CN115252671A

CN115252671A - 仙人掌果花色苷在制备调控肠道菌群产品中的应用

Info

Publication number: CN115252671A
Application number: CN202210935061.1A
Authority: CN
Inventors: 张筠; 邵帅; 赵晶; 崔艳伟; 张煜; 付红岩; 赵琳; 吕歌
Original assignee: East University of Heilongjiang
Current assignee: East University of Heilongjiang
Priority date: 2022-08-05
Filing date: 2022-08-05
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2042-08-05
Also published as: CN115252671B

Abstract

本发明提供了仙人掌果花色苷在制备调控肠道菌群产品中的应用，属于医药保健技术领域。体外发酵实验和小鼠实验结果表明，本发明仙人掌果花色苷能够调节肠道微生物的组成与多样性，抑制有害菌，促进有益菌生长，增加肠道中短链脂肪酸的含量，减少肥胖的发生。

Description

仙人掌果花色苷在制备调控肠道菌群产品中的应用

技术领域

本发明属于医药保健技术领域，尤其涉及一种仙人掌果花色苷在制备调控肠道菌群产品中的应用。

背景技术

肠道微生物是人体重要的“微生物器官”，与消化、免疫、营养、代谢、认知等诸多生理功能紧密相关，肠道微生物的种类、数量发生着微妙变化，继而影响着机体生理功能。用于调节肠道菌群的药物多为益生菌类药物如双歧杆菌三联活菌散、复方嗜酸乳杆菌片、枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊、乳酸菌素片，此类药物对菌群的调节作用单一，均为直接补充正常生理性细菌，调节肠道菌群，抑制肠道中对人体具有潜在危害的菌类、病原菌。

仙人掌果(Opuntia ficus-indica)是仙人掌属(Opuntia)植物的果实，源自美洲大陆的一种多浆植物，广泛分布于南非，该植物主产于我国热带地区，例如海南、云南、广西，具有气候耐受性。仙人掌果具有较高的营养价值，但是其鲜销和保存都比较困难，所以为了最大限度利用仙人掌果，提取其生物活性物质进行产品化利于保存与运输。仙人掌果中存在大量的生物活性物质如花色苷、多糖类、蛋白质等。花色苷在浆果中含量最为丰富，它是花色素与糖以糖苷键结合而成，属于类黄酮类化合物，是天然水溶性物质。

近年来花色苷通过调节肠道微生物从而促进人体健康已成为研究热点，但是由于目前研究者们普便利用蓝莓、蓝靛果、紫马铃薯等研究花色苷，但未见研究仙人掌果花色苷可调控肠道菌群的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种仙人掌果花色苷在制备调控肠道菌群产品中的应用，可以改变肠道微生物群的多样性和组成，抑制有害菌，促进有益菌生长，增加短链脂肪酸的产生。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

仙人掌果花色苷在制备调控肠道菌群产品中的应用，所述调控肠道菌群包括以下中的一种或多种：减少变形菌门的数量，降低大肠埃希菌和脱硫弧菌属的相对丰度，增加拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门的增长，提高普氏菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、光冈菌属、阿克曼氏菌属的相对丰度。

优选的，所述仙人掌果花色苷的制备方法包括：将仙人掌果粉末与乙醇溶液混合提取后，经减压浓缩、冻干得到所述仙人掌果花色苷；所述乙醇溶液的体积百分含量为40％-70％；所述仙人掌果粉末与乙醇溶液的质量体积比为1:20-30g/mL；所述提取的温度为50-60℃，pH值为1-5，时间为60-100min；所述减压浓缩的温度为40-60℃。

优选的，所述仙人掌果花色苷能够增加短链脂肪酸的含量。

优选的，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸。

优选的，所述产品包括保健品和药品。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了仙人掌果花色苷在制备调控肠道菌群产品中的应用。体外发酵实验结果表明，本发明仙人掌果花色苷能够调节肠道微生物的组成与多样性，抑制有害菌，促进有益菌生长，增加肠道中短链脂肪酸的含量，减少肥胖的发生。因此，本发明仙人掌果花色苷具有促进肠道健康的潜力。

附图说明

图1为仙人掌果花色苷在模拟胃消化过程中含量的变化；

图2为仙人掌果花色苷在模拟肠消化过程中含量的变化；

图3为仙人掌果花色苷在厌氧发酵中短链脂肪酸的变化；

图4为仙人掌果花色苷微生物菌群主坐标以及多维尺度分析；图a为PCoA分析，图b为NMDS分析；

图5为物种丰富VENN图片；

图6为仙人掌果花色苷厌氧发酵下肠道菌群门水平相对丰度的变化；

图7为肠道菌群拟杆菌门/厚壁菌门的比例；注:不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)；

图8为仙人掌果花色苷厌氧发酵下肠道菌群物种丰富热图；

图9为仙人掌果花色苷厌氧发酵下肠道菌群属水平相对丰度的变化；

图10为小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的含量；注:不同小写字母表示组间差异显著性(p<0.05)，不同大写字母表示组间极显著性(p<0.01)；

图11为小鼠盲肠内容物样品稀疏曲线；

图12为小鼠盲肠内容物物种丰度等级曲线曲线；

图13为仙人掌果花色苷微生物菌群分析，图a为PCoA分析，图b为NMDS分析，图c为Anosim分析；

图14为物种丰富VENN图片；

图15为小鼠肠道菌群门水平相对丰度的变化；

图16为小鼠肠道菌群拟杆菌门/厚壁菌门的比例；

图17为小鼠肠道菌群物种丰富热图；

图18为小鼠肠道菌群属水平相对丰度的变化。

具体实施方式

本发明提供了仙人掌果花色苷在制备调控肠道菌群产品中的应用，所述调控肠道菌群包括以下中的一种或多种：减少变形菌门的数量，降低大肠埃希菌和脱硫弧菌属的相对丰度，增加拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门的增长，提高普氏菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、光冈菌属、阿克曼氏菌属的相对丰度。

体外发酵实验结果表明：在门水平上，主要是减少了变形菌门数量，增加了拟杆菌门、厚壁菌门以及放线菌门的增长；在属水平上，增加了普氏菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、光冈菌属等肠道有益菌的相对丰度，降低了大肠埃希菌和脱硫弧菌属肠道有害菌的相对丰度。因此，本发明仙人掌果花色苷能够调节肠道微生物的组成与多样性，抑制有害菌，促进有益菌生长。

小鼠实验结果表明：门水平上，灌喂本发明仙人掌果实花色苷后主要减少变形菌门的产生，增加了拟杆菌门、厚壁菌门的产生，同时减小了厚壁菌门/拟杆菌门的比例；在属水平上，花色苷使得有益菌普氏菌属、阿克曼氏菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属产量增加(p<0.05)，同时减少致病菌大肠杆菌属、脱硫弧菌的产生。因此，本发明仙人掌果实花色苷可以起到调节小鼠肠道菌群的作用，使致病菌减少，有益菌增多。

在本发明中，所述仙人掌果花色苷的制备方法优选包括：将仙人掌果粉末与乙醇溶液混合提取后，经减压浓缩、冻干得到所述仙人掌果花色苷；所述乙醇溶液的体积百分含量为40％-70％；所述仙人掌果粉末与乙醇溶液的质量体积比为1:20-30g/mL；所述提取的温度是50-60℃，pH值为1-5，时间为60-100min；所述减压浓缩的温度为40-60℃。所述乙醇溶液的体积百分含量优选为51％；所述仙人掌果粉末与乙醇溶液的质量体积比优选为1:25g/mL；所述提取的温度优选为55℃，pH值优选为2，时间优选为70min；所述减压浓缩的温度优选为50℃。

在本发明中，所述仙人掌果花色苷能降低厚壁菌门/拟干菌门(Firmicutes/Bacteroidetes)为F/B值，能减少肥胖的发生。F/B值越高表明发生肥胖的几率就越高，被作为肥胖的有效生物标记物。体外发酵实验结果表明：与K组相比，L组、M组以及H组F/B值均显著减少(p<0.05)，分别为74.1％、35.1％、35.5％，有利于减少肥胖的发生。由此可知，本发明所述仙人掌果花色苷对肠道菌群具有良好的调节作用。

在本发明中，所述仙人掌果花色苷能够增加短链脂肪酸的含量；所述短链脂肪酸优选包括包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸。

在本发明中，所述产品优选包括保健品和药品。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例、实验例中使用的材料及来源：

无水乙醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、七水合硫酸镁、六水合氯化钙、吐温80、硫酸、乙醚、氯化钾、氯化钠、六水合氯化镁、碳酸铵、浓盐酸、氢氧化钠分析纯天津市光复科技发展有限公司；

蛋白胨、酵母膏、猪胆盐分析纯北京奥博星生物技术有限公司；

氯化血红素、维生素K₁、L-半胱氨酸、α-淀粉酶(4000u/g)、胃蛋白酶(250u/mg)、胰蛋白酶(3000u/mg)分析纯上海源叶生物科技有限公司；

二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠分析纯西陇化工股份有限公司；

6种水溶性脂肪酸混标色谱纯坛墨质检科技股份有限公司；

仙人掌果购买于海南；

正常饲料购买于沈阳茂华生物科技有限公司；

粪便样品来源于2位健康的志愿者，过去三个月内没有消化系统疾病、没有使用任何的抗生素和益生菌(18-30岁、1位女士和1位男士)。实验前已经和志愿者阐述利害关系，试验均在志愿者同意下进行。

仪器及来源：Magnetic stirrer磁力搅拌器意大利VELP公司；Allegra 64RCompact Centrifuge离心机贝克曼库尔特公司；UV1800紫外可见分光光度计上海棱光技术有限公司；RE-25AA旋转蒸发仪上海亚荣生化有限公司；FDU-1100真空冷冻干燥机日本东京理化仪器有限公司；BSD-TX345摇床上海启闵生物技术有限公司；7890A气相色谱安捷伦科技有限公司；Vortex.Genie2漩涡振荡上海迈旗环保科技有限公司；BactronⅡ厌氧培养箱美国SHELLAB公司。

仙人掌果粉末的制备方法：

新鲜的仙人掌果剥去外表皮，之后用榨汁机将其打成匀浆，在-80℃的超低温冷冻冰箱中进行冷冻，以至样品成为固体状态，将其放入真空冷冻干燥机中去除水分，过40目筛剔除其籽得到仙人掌果粉末。

实施例1

仙人掌果花色苷的提取方法

准确称取10g仙人掌果粉末，用250mL 51％的乙醇溶液(pH＝2)进行提取，于55℃磁力搅拌提取70min，离心，取上清液于50℃减压浓缩，冻干得到仙人掌果花色苷。

实施例2

仙人掌果花色苷的提取方法

准确称取10g仙人掌果粉末，用200mL40％的乙醇溶液(pH＝1)进行提取，于50℃磁力搅拌提取60min，离心，取上清液于40℃减压浓缩，冻干得到仙人掌果花色苷。

实施例3

仙人掌果花色苷的提取方法

准确称取10g仙人掌果粉末，用300mL 70％的乙醇溶液(pH＝5)进行提取，于60℃磁力搅拌提取100min，离心，取上清液于60℃减压浓缩，冻干得到仙人掌果花色苷。

实施例4

体外消化实验

1、制备模拟唾液(SSF)、模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)电解质储备溶液，如表1所示。

表1消化电解质液原液的配制

实施例1仙人掌果花色苷溶液制备方法为：取1g实施例1得到的仙人掌果花色苷，溶于100mL的无菌水中，得到浓度为10mg/mL的花色苷溶液。

2、模拟体外口腔消化、胃消化和肠消化

口腔消化：取10mg/mL实施例1仙人掌果花色苷溶液5mL，加入3.5mL SSF电解质液、25μL CaCl₂(H₂O)₂、0.5mL活力值为1200U/mL的α-淀粉酶，最后用超纯水定容至10mL。在恒温摇床37℃、120r/min、避光进行2min。消化完成后立即转入-80℃冰箱灭酶。

胃消化：将口腔消化产物(10mL)加入7.5mL SGF电解质液、1.6mL活力值为24000U/mL的胃蛋白酶、5μLCaCl₂(H₂O)₂溶液，用HCl调pH为3后，加超纯水至20mL。对照组：仅将模拟未消化中1.6mL胃蛋白酶使用SGF电解质液等量代替。在恒温摇床37℃、120r/min、避光进行胃消化，分别在1h、2h、3h，取消化产物于-80℃冰箱灭酶。

肠消化：将胃消化产物(20mL)中加入11mLSIF电解液、5mL活力值为1000U/mL的胰蛋白酶、4％的猪胆盐2.5mL、40μL 0.3mol/L CaCl₂(H₂O)₂溶液，用NaOH调pH值为7后，加超纯水至40mL。对照组：仅将模拟肠消化中肠蛋白酶和猪胆盐用7.5mL SIF电解液代替。在恒温摇床37℃、120r/min、避光进行肠消化，分别在1h、2h、3h，取肠消化产物于-80℃冰箱灭酶。

3、测定色苷含量、消化率

采用pH示差法对消化过程中仙人掌果花色苷含量变化的测定，取两份2.0mL的实施例1仙人掌果花色苷溶液，分别用0.025mol/L，pH＝1.0氯化钾缓冲液和0.4mol/L，pH＝4.5醋酸钠缓冲液定容至25mL的容量瓶中。静置60min，分别在535nm和700nm下测定吸光值，根据公式，计算出花色苷的含量，公式如下：

式(1)中，W：花色苷的含量，mg/g；Mw：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔质量，449.2g/moL；A：花色苷吸光度，A＝(A₅₃₅pH_1.0-A₇₀₀pH_1.0)-(A₅₃₅pH_4.5-A₇₀₀pH_4.5)；DF：稀释倍数；V：为定容的体积，mL；ε：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900L/mol·cm；L：比色皿的宽度(1cm)；M：样品质量，g。

消化率的测定，公式如下：

仙人掌果花色苷在模拟胃消化过程中含量的变化结果见图1。经胃消化3小时后花色苷含量与初始量相比显著下降(p<0.05)，其消化率为11.4％；模拟胃消化组与胃消化空白组相比，花色苷含量稍有降低，但不具有显著性差异(p>0.05)。由于胃消化空白组未添加胃蛋白酶，因此该结果表明：花色苷在消化过程中不受胃蛋白酶的影响，但受胃酸和胃液的影响较大。

仙人掌果花色苷在模拟肠消化过程中含量的变化结果见图2，经肠消化4小时后花色苷含量急剧下降(p<0.05)，其消化率为23.5％；模拟肠消化组与肠消化空白组相比，花色苷含量具有显著性差异(p<0.05)。肠消化空白组未添加胰蛋白酶和胆盐，因此该结果表明：花色苷在肠消化过程中受胆汁、胰蛋白酶的影响较大，花色苷在pH较高的肠液中不稳定，易被消化。仙人掌果花色苷经由胃-肠的总消化率为34.9％，绝大部分花色苷剩余，不会被上消化道消化。

实施例5

体外发酵实验

1、试剂配制

基础厌氧培养基配制：酵母提取物(2.0g)、蛋白胨(2.0g)、NaHCO₃(2.0g)、胆汁盐(0.5g)、L-半胱氨酸(0.5g)、NaCl(0.1g)、K₂HPO₄(0.04g)、KH₂PO₄(0.04g)、氯化血红素(0.02g)、MgSO₄·7H₂O(0.01g)、CaCl₂(0.01g)、维生素K₁(10μL)、吐温80(2.0mL)溶于1.0mL蒸馏水，将基础营养培养基的pH调节至pH＝7.0，121℃高压蒸汽灭菌15分钟。

磷酸盐缓冲液(PBS)配制：氯化钠(2.0g)、磷酸二氢钾(0.2g)、磷酸氢二钠(2.9g)、氯化钾(0.2g)，溶于1L超纯水中，灭菌冷却调节pH＝7.4，于4℃冷藏备用。

试验当天取健康成年人(1男1女)(身体健康，无胃肠道疾病且近三个月未服用过抗生素)粪便，将收集好的粪便样品转入厌氧培养箱进行处理，在电子天平上称取粪便样品各10g，与磷酸盐缓冲溶液以1:10(W/V)的比例混匀(采用一男一女得到更丰富的菌群，以构建肠道菌群模型)，纱布过滤备用。

2、发酵培养

在三角瓶中加入27mL厌氧培养基，3mL过滤的粪便悬浊液，1mL不同浓度的实施例1花色苷提取物溶液分为L组(低剂量5mg/mL)、M组(中剂量10mg/mL)、H组(高剂量15mg/mL)，K组(空白)使用等量无菌水代替花色苷提取物溶液。于37℃恒温厌氧培养箱中培养24h。

3、气相色谱检测体外发酵后短链脂肪酸含量

短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是由肠道微生物在结肠内发酵未被消化的物质，包括碳水化合物、多糖低聚糖、膳食纤维以及其他植物营养素在肠道中获得的碳原子数为1～6个的饱和脂肪酸。

前处理：将发酵24h后的样品在条件为12000r/min、4℃、5min下离心，沉淀于冰箱保存备用。取上清液5mL依次加入0.5mL 50％的硫酸溶液5mL乙醚，混匀旋涡振荡2min后，于4℃，10000r/min，5min下进行离心，取上层乙醚层，过0.22μm有机相滤膜后存于气相小瓶进行检测。

气相色谱条件：色谱柱为10mDB-WAX毛细管柱，进样口温度为220℃，分流比为10:1，柱流量为1.5mL/min，氮气横流，程序升温第一阶段为70℃，1min；第二阶段以15℃/min升至160℃，6min；第三阶段以30℃/min升至210℃保持5min，采用氢火焰检测器(FID)检测器温度为250℃。具体结果见图3。

由图3可知，与K组相比，H组、M组、L组总短链脂肪酸含量均升高具有极显著性(p<0.01)，分别为K组的7.8倍、5.0倍和1.1倍。与K组相比，L组乙酸、丙酸和丁酸含量上具有显著差异性(p<0.05)，分别上升1.1倍、1.3倍和1.2倍，异丁酸、异戊酸和戊酸含量无显著性差异(p>0.05)。与K组相比M组、H组均具有显著差异性(p<0.05)，M组在乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的含量均明显升高，分别为空白组的5.9倍、2.9倍、6.5倍、4.2倍、4.4倍和6.5倍；H组在乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的含量均明显升高，分别为K组的10.0倍、4.6倍、10.7倍、4.7倍、5.6倍和7.8倍。从图3中还可以得到仙人掌果花色苷与人类粪便共培养后产生的乙酸、丙酸、丁酸其含量比较高。分析得出：本发明花色苷提取物在一定程度上会影响短链脂肪酸的产生，拟杆菌门促进乙酸的产生，厚壁菌门促进丁酸的产生，放线菌门促进丙酸的产生。由于本发明花色苷提取物对肠道上的微生物的作用，随着花色苷浓度的增加短链脂肪酸含量升高。

4、菌群多样性构成分析

K组、L组、M组以及H组，每组三个样本，共12例人类粪便与本发明花色苷提取物厌氧培养物样品中肠道微生物总DNA提取以及高通量测序委托广州基迪奥生物科技有限公司进行；采用粪便DNA试剂盒提取DNA；对目标片段16s rDNAV3-V4区域进行PCR扩增，以第一个引物中的barcode作为特异引物扩增得到目标产物；将目标片段中PCR扩增的产物经电泳检测后，切胶回收目标片段，采用荧光定量PCR扩增产物；使用AMPure XP Beads对第二轮扩增产物进行纯化，用ABI StepOnePlus RealTime PCR System(Life Technologies，产地美国)进行定量；根据Novaseq 6000的PE250模式pooling上机测序。

含采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析(p<0.05表示差异有统计学意义)，Origin2021进行作图。高通量测序的原始数据进行质控、过滤、去嵌合体，得到的有效数据，进行分类操作单元的划分以及系统发育学分析，菌群结构差异及差异微生物种类采用Usearch分析。具体结果见表2和图4-7。

(1)菌群Alpha多样性分析

Alpha多样性与物种数目也就是均匀度以及生态系统内的多样性两个因素有关，描述群落均匀度的指标主要包括Chao1、ACE指数，指数越小，群落均匀度低，多样性就越高；描述群落多样性的指数有Shannon、Simpson指数，指数其值越高，表明群落多样性越高。具体结果见表2。

表2花色苷提取物对肠道微生物群α多样性指数的影响

注：*表示与空白组相比具有差异显著性

由表2所示，与K组相比L组、M组以及H组Chao1与ACE指数均减少(p＜0.05)，而Shannon指数与Simpson指数均增加(p＜0.05)。使得肠道菌群内丰多样性的升高，表明添加本发明花色苷提取物会改变肠道内的菌群的多样性。

(2)菌群Beta多样性分析

PCoA(principal co-ordinates analysis)是样本间的差异分析。每一个点代表一个样本，相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小，距离越远，差异比例越大。具体结果见图4。

由图4a可以得出，各个样本之间完全分离，说明各个样品中微生物菌落发生改变且差异明显，表明此次结果能够较好的描述样本特征，M组与K组距离最远，相似度最低，表明微生物群落相似度最低差异大，而L组与H组距离最近相似度最大，微生物群落相似度差异小。

NMDS(Non-metric multidimensional scaling)通过点与点之间距离反映样本间的差异和相似性。stress值为度量由一个二维NMDS确定的排序点与原始n个实体相似性排序的一致程度，亦称NMDS分析的拟合优度，stress值越小代表拟合度越好。stress<0.05，拟合极好；stress<0.1，拟合较好；stress<0.2，拟合一般；stress>0.3，拟合较差。

由图4b可以得出应力函数值strees＝0.00≤0.05，表明具有很好的代表性。

(3)肠道菌群物种组成分析

通过四组样品每组三个样本共12个样品，这12个样品的平均测序深度为128163±3388reads，按照97％的相似性下每个样本有476±33OTUs，VENN图表示样品之间共有和差异物种或基因的情况，反映了各组之间共有的和特有的OTUs数目。

根据图5所示L组、M组以及H组共同拥有而K组未出现的为92个OTU。L组、M组、H组以及K组共有177个OTU。K组和L组、M组、H组独特OTU分别为282、130、121、135。表明本发明仙人掌果花色苷改变了粪便肠道微生物群的组成。

(4)门水平下物种组成分析

由图6可知，各样本的肠道微生物主要有厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)这5大门类，占样本丰富度的97％以上。其中K组变形菌门含量占比最多，变形菌门包括绝大多数病原菌，如大肠杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌、空肠弯曲杆菌，添加本发明仙人掌果花色苷后L组、M组、H组分别显著降低(p<0.01)，为43.5％、44.0％，43.4％。与K组相比L组、M组、H组的拟杆菌门增加43.5％、30.4％、28.1％，拟杆菌门促进乙酸以及异戊酸的产生，参与人体结肠中的代谢活动，通过代谢获得碳源与能量，厚壁菌门促进丁酸的产生，加花色苷组丁酸含量增多与厚壁菌门占比增加有关。

厚壁菌门/拟干菌门(Firmicutes/Bacteroidetes)为F/B值，该值越高表明发生肥胖的几率就越高，被作为肥胖的有效生物标记物。

如图7所示，与K组相比，L组、M组以及H组F/B值均显著减少(p<0.05)，分别为74.1％、35.1％、35.5％，有利于减少肥胖的发生。由此可知，本发明所述仙人掌果花色苷对肠道菌群具有良好的调节作用。

(5)属水平下物种组成分析

由图8肠道菌群物种丰富热图可知，经厌氧发酵后，K组主要有大肠杆菌志贺属(Escherichia-Shigella)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、链型杆菌属(Catenibacterium)占比最多。而在加入本发明花色苷提取物后，则以普氏菌属(Prevotella)、光冈菌属(Mitsuokella)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)为主。

从图9肠道菌群属水平相对丰度中可以得到，与K相比，L组、M组以及H组大肠杆菌志贺属占比显著下降(p<0.05)，分别为41.0％、41.2％、41.1％，但L组、M组以及H组之间变化差异不大，大肠杆菌志贺属中存在着很多已发现的病原体，会引起肠道炎症等，对人体肠道菌群危害很大。脱硫弧菌属也被称为硫酸盐还原菌(SRB)属于变形菌门。这类细菌可以“呼吸”硫酸盐而不是氧气。由于硫化氢(H₂S)的产生，SRB被认为会对肠道上皮具产生毒性，导致胃肠道疾病，与K组相比，L组、M组以及H组脱硫弧菌占比显著下降(p<0.05)，分别为18.9％、19.6％以及19.9％。可见，本发明仙人掌果花色苷能够抑制肠道菌群中致病菌的生长。

与K相比，L组、M组以及H组普氏菌属占比显著上升(p<0.05)，分别为24.1％、40.7％、38.2％，普氏菌属存在于人类中，帮助分解蛋白质和碳水化合物食物，可以参与合成多种维生素，促进人体健康。与K相比，L组、M组以及H组乳酸杆菌属和双歧杆菌属的总含量增加(p<0.05)，分别为4.6％、5.8％、12.88％，L组、M组以及H组之间变化呈梯度增加，乳酸杆菌与双歧杆菌作为公认的益生菌，可以使肠道微生物维持稳定状态，乳酸杆菌属可利用从精氨酸生产L-鸟氨酸来促进肠粘膜形成，调节肠道粘膜稳态。与K组相比，L组、M组以及H组光冈菌属均增加分别为36.0％、27.7％、27.2％(p<0.05)，而光冈菌属丰富度的增加，能提高机体发酵碳水化合物、多糖的能力，对于减轻肥胖有很大益处。

实施例6

小鼠实验

1、动物饲养

40只体重为20±2g的雄性KM小鼠，将其分成4个小组，每个小组10个。经过一星期的适应训练。按照以下方式处理分组。

(1)K组，每天两次灌喂无菌水；

(2)L组，每天灌喂两次25mg/kg.BW花色苷溶液；

(3)M组，每天灌喂两次50mg/kg.BW花色苷溶液；

(4)H组，每天灌喂两次75mg/kg.BW花色苷溶液；

室内温度：20～22℃，相对湿度28％～50％.保证实验室的清洁和清洁，小鼠可以自由进食和饮水。

适应性饲养后，所有小鼠自由进食饮水，每天上午9点、下午3点各灌胃1次。K组灌胃无菌水；L组灌胃25mg/kg.BW花色苷溶液；M组灌胃50mg/kg.BW花色苷溶液；H组灌胃75mg/kg.BW花色苷溶液。连续造模3周，直至取材。

2、样本的采集与测定

(1)动物行为学观察

所有小鼠在灌胃期间记录小鼠每天精神状态、毛色、光泽度、摄食量、饮水量及排尿量，记录小鼠粪便性状。

(2)动物取材

末次灌胃16h后，小鼠脱颈处死后进行无菌取材。取材部位为盲肠内容物(盲肠内容物分成两份保存)。并对盲肠内容物组织进行称重，将组织进行冻存。用锡纸包裹后转入无菌无酶管中，在液氮中预冻，立即转入-80℃冰箱中保存。

(3)气相色谱检测盲肠内短链脂肪酸

盲肠内容物处理：取100mg盲肠内容物于试管中加入5mL超纯水置于冰水浴中，漩涡震荡样品混匀，样品进行超声10min，将准备好的样品于冰水浴中20min，在于4℃、4800r/min离心20min。取上清液过0.22μm滤膜后转入气相色谱进样瓶待测。

气相色谱检测条件与实施例5体外发酵实验相同。

由图10可知，相比于K组，L、M、H组均显著增加了乙酸、丙酸和丁酸的含量(p<0.05)，乙酸分别为K组的2.1倍、3.3倍和5.4倍，丙酸分别为K组的2.2倍、2.6倍和4.5倍，丁酸分别为K组的1.7倍、2.6倍和5.5倍。在体内进行的胆固醇的新陈代谢中，丙酸也会起作用，而肠道上皮细胞则会受到丁酸的作用，同时也会对免疫系统的生长起到一定的作用，从而起到保护作用。M、H组与K组相比，异丁酸、异戊酸和戊酸的含量具有显著差异性(p>0.05)。异丁酸与K组相比分别增加了1.4倍和1.5倍，M组的异丁酸含量和H组变化差异不大。异戊酸与K组相比分别增加了1.5倍和1.6倍。戊酸含量与K组相比增加了1.4倍和1.8倍。与K组相比可知，L、M和H组产生的六种总短链脂肪酸均比K组高且具有差异显著性(p<0.01)。

结果表明，乙酸、丙酸、丁酸是花色苷经过小鼠消化吸收后主要的典型代谢产物，这也与实施例5体外发酵实验中的短链脂肪酸含量结果呈现出一样的趋势。因此，本发明仙人掌果花色苷经小鼠消化后，能到达大肠与之相互作用增加短链脂肪酸的产生。

(4)仙人掌果花色苷对小鼠肠道菌群的影响

1)菌群Alpha多样性分析

对K组、L组、M组和H组的盲肠内容物菌群α-多样性如表3所示。

表3花色苷对肠道微生物群α多样性指数的影响

注：^*表示与空白组相比具有差异显著性

由表3可知，与K相比，仙人掌果花色苷喂养3周后，Chao1指数和ACE指数的值显着下降(p<0.01)，呈剂量依赖性，表明改变了肠道微生物的均匀度；Shannon指数和Simpson指数与空白组相比有了明显上升(p<0.05)，说明改变了菌群的多样性。结果表明，本发明仙人掌果花色苷喂养后的小鼠肠道细菌的变异更大，这也与体外发酵仙人掌果花色苷呈现出相同的作用。

由图11可知，测序深度在20000曲线趋于平缓，说明此次测序可信。空白组曲线最长，匀速下降，表明样品组成的丰度比较均匀，物种组成多样性高。低、中、高剂量组与空白组相比曲线快速陡然下降，表明样品中物种丰度分布均匀度很低，优势菌群所占比例很高，多样性降低。中、高剂量组曲线相类似，表明物种相似度高，从图12中进一步得出低剂量组优势菌群所含最高。结果说明灌喂本发明仙人掌果花色苷能够改变物种组成丰富度，增加优势菌群的生长。

2)菌群Beta多样性分析

由图13a可以得出，各个颜色的点没有重合，互不相交，表明各个样本之间完全分离，能够较好的描述小鼠肠道特征，说明小鼠肠道中微生物菌落发生改变且差异明显。其中H组与K组距离最远，表明H组与K相似度最低，说明微生物群落相似度最低差异大，而L组与K组距离最近，表明L组与K相似度最大，微生物群落相似度差异小。NMDS由图13b可以得出应力函数值strees＝0.014≤0.01表明具有极好的代表性。由图13c中可以得出R＝0.633说明组间差异显著，p＝0.001<0.05具有显著性。

3)物种组成分析

K组、L组、M组和H组共有四组，通过四组样品每组三个样本共12个样品，这12各样品的平均测序深度为63752±2235，按照97％的相似性下每个样本有905±55OTUs，说明测量结果能准确代表小鼠肠道菌群真实情况。通过体内试验得到小鼠肠道菌群组成VENN图如图14所示。

由图14所示，L组、M组以及H组共同拥有35个OTU，占总序列的1.4％。L组、M组、H组以及K组共有411个OTU，占总序列的16.2％。K组和L组、M组以及H组独特OTU分别为455、358、411以及510，分别占总序列的17.9％，14.1％，16.2％以及20.1％。表明本发明仙人掌果花色苷改变了小鼠盲肠道微生物群的组成。

4)门水平下物种组成分析

通过体内试验，小鼠肠道菌群组成门水品分析如图15-16所示。

由图15可知，小鼠肠道微生物主要有厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、髌骨细菌门(Patescibacteria)除此之外还有少量的疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)、埃普西隆杆菌门(Epsilonbacteraeota)。其中小鼠样品L组、M组、H组变形菌门含量同K组相比，喂养仙人掌果花色苷后3周后，变形菌门分别降低12.4％、16.6％，18.6％(p<0.05)，变形菌门中包含绝大多数致病菌，引起疾病的发生。与K组相比，L组拟杆菌门增加10.2％，M组和H组增量相差不大为19.5％、20.7％，但都具有显著性(p<0.05)，拟杆菌门促进乙酸以及异戊酸的产生，参与人体结肠中的代谢活动，通过代谢获得碳源与能量。L组、M组、H组与空白组比，厚壁菌门的比例增加为6.6％、6.9％、4.3％。

厚壁菌门/拟杆菌门的比例与肥胖的发生有关，由图16可知，与K组相比，厚壁菌门/拟杆菌门的比例分别减少为40.2％、21.4％、14.1％，有利于减少肥胖的发生。

5)属水平下物种组成分析

通过体内试验，小鼠肠道菌群组成属水品分析如图17-18所示。

由图17可知，经仙人掌果花色苷喂养3周的小鼠，K组主要有大肠杆菌属(Escherichia)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、瘤胃菌属(Ruminococcaceae_UCG-014)、Candidatus_Saccharimonas。而在灌胃花色苷后，则以普氏菌属(Prevotella)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)为主。

从图18中可以得到，肠道菌群紊乱，引起疾病发生的大肠杆菌属改变最为显著。与K相比，L组、M组以及H组大肠杆菌属占比显著下降(p<0.01)，分别为30.5％、35.9％、36.9％(p<0.05)。硫酸盐还原菌(SRB)是一种变形菌门的细菌。这种微生物因其能分解硫酸盐而非分解氧而备受瞩目。由于硫化弧菌在新陈代谢过程中会释放出大量的硫化氢(H₂S)，因此近些年来，人们普遍相信，硫化弧菌会损伤肠上皮，从而引发消化系统的病变，与K组相比，L组、M组以及H组脱硫弧菌占比显著下降(p<0.05)，分别为18.9％、19.6％以及19.9％。普氏菌属通过促进合成维生素，灌胃花色苷后，与K相比，L组、M组以及H组占比显著上升(p<0.05)，其中L组上升24.4％、M组和H组相似为32.2％、32.8％。乳酸杆菌属的变化同普氏菌属相类似(p<0.05)，分别增加15.9％、18.1％、18.2％。双歧杆菌增加3.4％、6.7％、9.1％。与K组相比，阿克曼氏菌属在L、M、H组所特有，分别为11.6％、12.4％、14.0％。阿克曼氏菌属作为新型的益生菌，可以使肠道微生物维持稳定状态，减少肥胖、糖尿病、肠道炎症、肝脏疾病的发生，被称作下一代明星益生菌。经过仙人掌果花色苷喂饲的小鼠均生长了阿克曼氏菌属，表明仙人掌果实中的花色苷有助于益生菌的生长。

综上所述，本发明仙人掌果花色苷干预可以改变肠道微生物群的多样性和组成。在门水平上，主要是减少了变形菌门，增加了拟杆菌门、厚壁菌门以及放线菌门的增长。在属水平上，增加了普氏菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、光冈菌属、阿克曼氏菌属等肠道有益菌的相对丰度，降低了大肠埃希菌和脱硫弧菌属肠道有害菌的相对丰度。因此，本发明仙人掌果花色苷能够调节肠道微生物的组成与多样性，抑制有害菌，促进有益菌生长。仙人掌果花色苷在肠道消化过程中能够增加短链脂肪酸的产生，可能是使肠道菌群发生改变，从而促进了该短链脂肪酸产生菌的生长。因此，本发明仙人掌果花色苷具有促进肠道健康的潜力，可以作为益生元进行探索。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.仙人掌果花色苷在制备调控肠道菌群产品中的应用，其特征在于，

所述调控肠道菌群包括以下中的一种或多种：减少变形菌门的数量，降低大肠埃希菌和脱硫弧菌属的相对丰度，增加拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门的增长，提高普氏菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、光冈菌属、阿克曼氏菌属的相对丰度。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述仙人掌果花色苷的制备方法包括：将仙人掌果粉末与乙醇溶液混合提取后，经减压浓缩、冻干得到所述仙人掌果花色苷；

所述乙醇溶液的体积百分含量为40％-70％；

所述仙人掌果粉末与乙醇溶液的质量体积比为1:20-30g/mL；

所述提取的温度为50-60℃，pH值为1-5，时间为60-100min；

所述减压浓缩的温度为40-60℃。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述仙人掌果花色苷能够增加短链脂肪酸的含量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括保健品和药品。