CN113876821A - 一种玫瑰茄花色苷提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种玫瑰茄花色苷提取物的制备方法，提取工序简单、无污染，花色苷的含量高。通过本发明所述制备方法制备得到的玫瑰茄花色苷提取物用途广泛，能够用于食品、制备保健品和/或药品多个领域。本发明进一步提供了玫瑰茄花色苷提取物在制备预防或缓解结肠炎药物中的应用。玫瑰茄花色苷提取物在预防或缓解结肠炎方面的作用具体体现在：玫瑰茄花色苷提取物能够缓解葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠的体重减少、降低血清和组织中的炎症水平、缓解结肠的缩短和水肿、保护肠道粘膜屏障、提高肠道短链脂肪酸总含量、维持肠道菌群稳态和降低肠道有害菌的丰度。

Description

一种玫瑰茄花色苷提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于植物成分提取技术领域，具体地，涉及一种玫瑰茄花色苷提取物及其制备方法与应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel diseases，IBD)是一类发生于消化道、慢性且易复发的疾病，主要分为克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎 (Uulcerativecolitis,UC)。在CD中，呈现节段性、不对称性和跨壁性的炎症浸润，胃肠道各节段均有连续损伤的可能，通常伴有脓肿、瘘管和狭窄等并发症，严重时会累及从口腔至肛门的整段消化道区域。相反，UC以粘膜炎症为典型，局限于结肠段，会引起长时间的粘膜炎症的复发和转移，从直肠开始并延伸到结肠近端段。IBD患者会出现间歇性腹痛、持续性腹泻、体重下降、发烧、直肠反复性出血等症状，更大几率会导致结肠癌症与脑膜炎，还可能导致运动障碍、肛肠功能障碍等残疾，高达15％的溃疡性结肠炎患者需要结肠切除术。目前临床上炎症性肠病治疗使用氨基水杨酸、免疫抑制剂和生物制剂来阻止炎症级联反应，但是长期使用这些治疗药物可能会带来不良的副作用，如呕吐、恶心、头痛和疲劳等，且并不能完全根治。因此，迫切需要制定天然的、副作用小的治疗策略。
玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa L.)是一种一年生的木槿属草本植物，生长在干燥的亚热带气候中。在民间作为药用植物，用于利尿、降血压等作用早有记载。玫瑰茄富含花色苷资源总花色苷含量占所有玫瑰茄花萼(干)干重的1.7％～2.5％。占玫瑰茄花色苷最多的的飞燕草素花色苷中，具有5个酚羟基，其抗氧化能力强。没食子酸和丁香酸作为该花色苷衍生代谢物，已被证明可以减少潜在有害细菌的生长，而对有益细菌没有任何负面影响。目前也有关于玫瑰茄花色苷提取及其应用的报道，玫瑰茄提取物已被证明具有抗衰老、降血脂、抗菌等多种功效，例如：公开号为CN 108938691A的中国专利(一种具有抗衰老作用的玫瑰茄提取物及其提取方法和应用)公开了通过用乙醇提取，再用环己烷萃取乙醇提取物得到具有抗衰老作用的玫瑰茄提取物；Chang等研究表明，服用玫瑰茄提取物能够降低血清游离脂肪酸(Chang et al.Hibiscus sabdariffa extract inhibits obesity and fataccumulation,and improves liver steatosis in humans[J].Food&Function,2014,5.)； Liu等发现玫瑰茄花萼及其提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌生长的抑制作用(Liu et al.In vitro antibacterialactivity of roselle calyx and protocatechuic acid[J].Phytotherapy Research,2010, 19(11):942-945.)；公开号为CN 108558971A的中国专利公布了一种玫瑰茄花色苷的制备方法，然而，上述内容所用提取方法仅用大孔树脂纯化，无法实现花色苷的高度富集，提取物未标定花色苷的具体含量或提取物中仍有大量其他黄酮类化合物存在，且目前国内外尚未有玫瑰茄花色苷在预防或辅助治疗结肠炎等炎症性肠病方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种玫瑰茄花色苷提取物的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供上述制备方法制备得到的玫瑰茄花色苷提取物。
本发明的第三个目的在于提供上述玫瑰茄花色苷提取物在食品中的应用。
本发明的第四个目的在于提供上述玫瑰茄花色苷提取物在制备治疗结肠炎的保健品和/或药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种玫瑰茄花色苷提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将玫瑰茄花萼干粉碎后过筛，得到玫瑰茄粉末，在玫瑰茄粉末中加入酸化溶液进行浸提，过滤后取滤渣，滤渣再次浸提，重复若干次，合并提取液，减压浓缩，得到浓缩液；
S2.在步骤S1的浓缩液中加入萃取剂进行萃取，萃取后取萃取液；
S3.将步骤S2的萃取液加入已活化的大孔吸附树脂中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到浓缩液；
S4.将步骤S3的浓缩液加入到已活化的MCX阳离子交换柱中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到玫瑰茄花色苷提取物。
本发明利用玫瑰茄花萼干为原料，首先采用酸化溶液浸提，提高玫瑰茄花色苷的稳定性，防止其在提取过程中出现降解，浸提后获得的浸提液通过减压浓缩得到浓缩液，在浓缩液中加入萃取剂除去挥发油、脂肪酸等脂溶性成分，保留玫瑰茄的花色苷等酚类物质，再进一步通过大孔树脂和MCX阳离子双重柱层析获得玫瑰茄花色苷高度富集的提取物。
优选地，玫瑰茄花萼干粉碎后过60～80目筛。
更优选地，玫瑰茄花萼干粉碎后过80目筛。
优选地，步骤S1所述所述酸化溶液为酸化醇溶液，所述酸为甲酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、三氟乙酸或盐酸中的一种或几种。
更优选地，所述醇溶液为乙醇、丙二醇或异丙醇中的任意一种或几种。
优选地，步骤S1共浸提3次。
更优选地，步骤S1所述酸化溶液中酸的浓度为0.1％～2％，醇溶液的体积分数为60％～90％。
进一优选地，步骤S1所述酸化溶液中的酸为浓度为0.1％～0.5％(w/w)的盐酸，醇溶液的体积分数为80％～90％。
优选地，玫瑰茄粉末与酸化溶液的比例为1g：(3～20)mL。
更优选地，步骤S1所述玫瑰茄粉末与酸化溶液的比例为1g：(6～10)mL。
优选地，步骤S1所述所述浸提的时间10～30h。
更优选地，步骤S1所述所述浸提的时间20～24h。
优选地，步骤S2所述萃取剂为石油醚或乙酸乙酯。
优选地，步骤S2所述浓缩液与萃取剂的体积比例为1～10。
更优选地，步骤S2所述浓缩液与萃取剂的体积比为5：1。
优选地，步骤S3所述大孔吸附树脂柱的填料为Amberlite XAD-7型树脂。
优选地，步骤S3所述大孔吸附树脂柱的活化的步骤为：预先用2倍柱体积 95％(v/v)乙醇活化大孔吸附树脂并浸泡6h，再用2倍柱体积2％(w/w)的 HCl溶液淋洗树脂并浸泡3h，蒸馏水淋洗中性再用质量分数为2％的NaOH溶液淋洗树脂并浸泡3h，再用蒸馏水淋洗中性，最后用1～2倍柱体积的0.1％(w/w) 的HCl平衡树脂。
优选地，步骤S3所述大孔吸附树脂柱吸附与洗脱流程：将步骤S2的浓缩萃余液加入活化后的大孔树脂进行吸附，用酸性水溶液清洗后，再用乙醇洗脱，收集洗脱液。
更优选地，所述酸性水溶液的用量为2～4倍柱体积，其加液速度为每小时 1～1.5个柱体积；采用酸性水溶液清洗的目的是去除玫瑰茄花色苷提取液中大分子糖类与蛋白质，且提高洗脱过程中花色苷的稳定性。
优选地，所述酸性水溶液为0.2％～0.5％(w/w)的盐酸溶液。
优选地，所乙醇为70％～90％(v/v)乙醇水溶液。
更优选地，所述70％～90％(v/v)乙醇的加液速度为每小时1～1.5个柱体积，洗至无色。
优选地，步骤S4所述MCX阳离子交换柱的填料是将磺酸基键合在高度交联的苯乙烯/二乙烯基苯表面得到的混合型强阳离子交换吸附剂。
优选地，步骤S4所述MCX阳离子交换柱的活化步骤为：依次用0.02mol/L 的NaOH、水、0.02mol/L的HCl、水各冲洗2个柱体积。
优选地，步骤S4所述MCX阳离子交换柱吸附与洗脱流程：将步骤S3的浓缩液加入活化后的MCX阳离子交换柱进行吸附，用1:(15～25)(v:v)的冰醋酸和纯乙醇混合溶液漂洗，随后用体积比为1：(0.3～3)的纯乙醇和氯化钠溶液混合液洗脱，收集洗脱液。
优选地，步骤S4所述玫瑰茄花色苷提取物中花色苷的质量分数为70％～95％。
本发明还提供了上述任一所述制备方法制备得到的玫瑰茄花色苷提取物。
基于玫瑰茄无毒、可食用的性能，以及提取过程可选择满足食品配料生产要求，因此上述玫瑰茄花色苷提取物在食品中的应用也在本发明的保护范围之内。
本发明通过采用玫瑰茄花色苷提取物对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎进行膳食干预来评价玫瑰茄花色苷提取物在预防或缓解结肠炎方面的功效。具体地，通过监测小鼠体重变化情况、便血情况及粪便形状，评估玫瑰茄花色苷提取物对结肠炎小鼠体重、肠道消化排遗的影响，实验结果表明玫瑰茄花色苷提取物对DSS诱导的结肠炎小鼠体重下降、隐血及腹泻有缓解的作用；通过解剖取剖取肛门至盲肠末端(包括回盲部结肠)的整个结肠肠段观察玫瑰茄花色苷提取物对结肠炎小鼠的结肠长度、结肠重量和结肠重量与长度比值影响。实验结果表明，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预能缓解结肠炎小鼠结肠缩短、水肿等炎症表现，且对结肠的长度与重量无副作用；通过H&E染色和结肠炎症评分、阿利新蓝染色分析玫瑰茄花色苷提取物对DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织病理情况及肠道粘膜屏障的影响。结肠组织H&E染色与结肠组织炎症评分的结果表明，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预组小鼠结肠中，仅有少量肠上皮细胞皮损，隐窝结构明显，少量炎症细胞浸润，即结肠组织损伤具有保护作用；阿利新蓝染色的结果表明，玫瑰茄花色苷提取物干预明显缓解杯状细胞数量减少情况，促进黏液分泌；通过qPCR技术测定粘蛋白MUC-2的mRNA表达水平，实验结果表明，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预能减少DSS诱导的杯状细胞的损伤，提高粘液层厚度，保护肠道粘膜屏障；采用Elisa试剂盒测定血清中炎症因子水平和qPCR技术测定结肠组织中炎症因子及紧密连接蛋白mRNA表达水平，分析玫瑰茄花色苷提取物对DSS诱导炎症水平影响，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预对于DSS诱导的紧密连接蛋白下调有缓解作用，且小鼠血清中的促炎因子水平均有显著下降；通过气相色谱仪测定小鼠盲肠内容物短链脂肪酸含量，并对结肠内容物进行 16SrDNA测序，分析玫瑰茄花色苷提取物对DSS诱导结肠炎小鼠肠道菌群稳态调节作用。实验结果表明，玫瑰茄花色苷提取物能够提高DSS诱导结肠炎小鼠盲肠内容中的乙酸(p＜0.05)、丁酸(p＜0.05)、丙酸(p＜0.01)和短链脂肪酸含量总含量，且能够降低有害菌门的丰度水平，改善肠道菌群稳态失调。上述实验结果表明，玫瑰茄花色苷提取物能够预防或缓解结肠炎。因此，上述玫瑰茄花色苷提取物在制备预防或缓解结肠炎的保健品和/或药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述玫瑰茄花色苷提取物在制备缓解体重减少、降低血清和组织中的炎症水平、缓解结肠缩短和水肿、保护肠道粘膜屏障、提高肠道短链脂肪酸总含量、维持肠道菌群稳态和降低肠道有害菌的丰度的药物和/或保健品中的应用。
本发明还提供一种预防或缓解结肠炎的保健品、药物或食品，含有上述任一所述制备方法制备得到的玫瑰茄花色苷提取物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种玫瑰茄花色苷提取物的制备方法，提取工序简单、无污染，花色苷含量高。通过所述方法制备得到的玫瑰茄花色苷提取物用途广泛，能够用于食品、保健品和/或药品多个领域。
(2)本发明进一步提供了玫瑰茄花色苷提取物在制备预防或缓解结肠炎药物中的应用。玫瑰茄花色苷提取物在预防或缓解结肠炎方面的作用具体体现在：玫瑰茄花色苷提取物能够缓解葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠的体重减少、降低血清和组织中的炎症水平、缓解结肠缩短和水肿、保护肠道粘膜屏障、提高肠道短链脂肪酸总含量、维持肠道菌群稳态和降低肠道有害菌的丰度。
附图说明
图1为各组小鼠在干预期体重变化和处死时结肠长度、结肠重量和结肠重量与长度比值；其中，图1A为干预期体重变化；图1B为解剖小鼠取得结肠段；图1C为各组小鼠结肠长度；图1D为各组小鼠结肠重量与长度比值。
图2为各组小鼠处死时结肠组织H&E染色与结肠组织炎症评分；其中，图 2A为各组小鼠结肠组织H&E染色；图2B为根据H&E染色结果对结肠组织炎症的评分。
图3为各组小鼠结肠组织阿利新蓝染色和MUC-2mRNA表达水平；其中，图3A为根据阿利新蓝染色结果对结肠组织粘液层面积统计结果；图3B为结肠组织中MUC-2mRNA表达水平；图3C为各组小鼠结肠组织阿利新蓝染色结果。
图4为各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白表达水平、血清和结肠组织中炎症因子水平；分别为各组小鼠结肠组织中Claudin-1、Occludin和ZO-1紧密连接蛋白mRNA表达水平；各组小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的蛋白水平；各组小鼠结肠组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平。
图5为各组小鼠盲肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸以及短链脂肪酸含量的测定结果；其中，图5A是乙酸含量，图5B是丙酸含量，图5C是丁酸含量，图5D 是总短链脂肪酸含量。
图6为各组小鼠结肠内容物微生物门水平相对丰度变化；其中，图6A为结肠肠道菌群在门水平的相对丰度；图6B为拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度；图6C为变形菌门(Proteobacteria)相对丰度；图6D为软壁菌门(Tenericutes) 相对丰度；图6E为念珠菌门(Candidatus_saccharibacteria)相对丰度，图6F为螺旋菌门(Spirochaetes)相对丰度；图6G为厚壁菌门与拟杆菌门比例。
图7A为结肠道菌群在属水平的相对丰度；图7B为萨特氏菌属(Sutterella) 相对丰度；图7C为螺杆菌属(Helicobacter)相对丰度；7D为绿脓杆菌属 (Turicibacter)相对丰度；图7E为大肠杆菌/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella) 相对丰度；图7F为葡萄球菌属(Streptococcus)相对丰度；图7G为肠杆菌属 (Enterorhabdus)相对丰度；图7H为双歧杆菌属(Bifidobacterium)相对丰度； 7I为欧陆森氏菌属(Olsenella)相对丰度；图7J为丁酸弧菌属(Butyricimonas) 相对丰度；图7K为普雷沃氏菌属(Prevotella)相对丰度；图7L为副杆状菌属 (parabacteroides)相对丰度。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例中的步骤S3所述大孔吸附树脂柱的活化步骤为：预先用2倍柱体积95％(v/v)乙醇活化大孔吸附树脂并浸泡6h，再用2倍柱体积2％(w/w) 的HCl溶液淋洗树脂并浸泡3h，蒸馏水淋洗中性再用2％(w/w)的NaOH溶液淋洗树脂并浸泡3h，再用蒸馏水淋洗中性，最后以每小时1个柱体积的加液速度加入2倍柱体积的0.1％(w/w)的HCl平衡树脂；步骤S4所述MCX阳离子交换柱的活化步骤为：依次用0.02mol/L的NaOH、水、0.02mol/L的HCl、水各冲洗2个柱体积。
实施例1玫瑰茄花色苷提取物的制备
S1.将玫瑰茄花萼干粉碎后过60目筛，得到的玫瑰茄粉末，加入2％的乙酸酸化的60％乙醇进行浸提24h，玫瑰茄粉末与酸化乙醇的比例为1g：8mL，过滤后取滤渣，滤渣再次浸提，共浸提3次，最后取提取液，减压浓缩，得到浓缩液。
S2.取1.0L步骤S1的浓缩液中加入200mL石油醚进行萃取，得到萃取液。
S3.将步骤S2的萃取液加入大孔吸附树脂中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到初步纯化的玫瑰茄花色苷溶液。
S4.将步骤S3的浓缩液加入到已活化的MCX阳离子交换柱中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到玫瑰茄花色苷提取物。
所述大孔吸附树脂柱的吸附与洗脱流程：将步骤S2的浓缩萃取液缓慢加入活化后的大孔吸附树脂，打开树脂柱下端出液口，让柱内液面缓慢下降，下降液面距柱床2～3cm后关闭出液口，待吸附后，以每小时1.3个柱体积的加液速度加入3个柱体积的0.2％(w/w)的HCl溶液清洗后，以每小时1个柱体积的加液速度加入1.5倍柱体积的80％(v/v)乙醇进行洗脱，收集深红色洗脱液。
步骤S4所述MCX阳离子柱吸附与洗脱流程：将步骤S3的浓缩液加入活化后的MCX阳离子树脂进行吸附，用1:15(v:v)的冰醋酸和纯乙醇混合溶液漂洗，随后用体积比为3:1的纯乙醇和浓度为2.0mol/L的氯化钠溶液混合液洗脱，收集洗脱液。
玫瑰茄花色苷提取物中总花色苷含量测定采用pH示差法进行；总酚含量测定采用福林酚法进行。玫瑰茄花色苷提取物中花色苷的质量分数为72.3％，总酚的质量分数为89.1％。
实施例2玫瑰茄花色苷提取物的制备
S1.将玫瑰茄花萼干粉碎后过80目筛，得到的玫瑰茄粉末，加入0.5％的三氟乙酸酸化的75％乙醇进行浸提20h，玫瑰茄粉末与酸化乙醇的比例为1g：10mL，过滤后取滤渣，滤渣再次浸提，共浸提3次，最后取提取液，减压浓缩，得到浓缩液。
S2.取1.0L步骤S1的浓缩液中加入100mL石油醚进行萃取，得到萃取液。
S3.将步骤S2的萃取液加入大孔吸附树脂中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压，得到初步纯化的玫瑰茄花色苷溶液。
S4.将步骤S3的浓缩液加入到已活化的MCX阳离子交换柱中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到玫瑰茄花色苷提取物。
所述大孔吸附树脂柱的吸附与洗脱流程：将步骤S2的浓缩萃取液缓慢加入活化后的大孔吸附树脂，打开树脂柱下端出液口，让柱内液面缓慢下降，下降液面距柱床2～3cm后关闭出液口，待吸附后，以每小时1个柱体积的加液速度加入2个柱体积的0.3％(w/w)的HCl溶液清洗后，以每小时1.5个柱体积的加液速度加入2倍柱体积的70％(v/v)乙醇进行洗脱，收集洗脱液。
步骤S4所述MCX阳离子柱吸附与洗脱流程：将步骤S3的浓缩液加入活化后的MCX阳离子树脂进行吸附，用1:20(v:v)的冰醋酸和纯乙醇混合溶液漂洗，随后用体积比为1:1的纯乙醇和浓度为2.0mol/L的氯化钠溶液混合液洗脱，收集深红色洗脱液。
玫瑰茄花色苷提取物中总花色苷含量测定采用pH示差法进行；总酚含量测定采用福林酚法进行。玫瑰茄花色苷提取物中花色苷的质量分数为75.1％，总酚的质量分数为88.4％。
实施例3玫瑰茄花色苷提取物的制备
S1.将玫瑰茄花萼干粉碎后过70目筛，得到的玫瑰茄粉末，加入0.5％的盐酸酸化的90％乙醇进行浸提10h，玫瑰茄粉末与酸化乙醇的比例为1g：10mL，过滤后取滤渣，滤渣再次浸提，共浸提3次，最后取提取液，减压浓缩，得到浓缩液。
S2.取1.0L步骤S1的浓缩液中加入150mL乙酸乙酯进行萃取，得到萃取液。
S3.将步骤S2的萃取液加入大孔吸附树脂中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到初步纯化的玫瑰茄花色苷溶液。
S4.将步骤S3的浓缩液加入到已活化的MCX阳离子交换柱中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到玫瑰茄花色苷提取物。
所述大孔吸附树脂柱的吸附与洗脱流程：将步骤S2的浓缩萃取液缓慢加入活化后的大孔吸附树脂，打开树脂柱下端出液口，让柱内液面缓慢下降，下降液面距柱床2～3cm后关闭出液口，待吸附后，以每小时1.5个柱体积的加液速度加入4个柱体积的0.5％(w/w)的HCl溶液清洗后，以每小时1.2个柱体积的加液速度加入2倍柱体积的90％(v/v)乙醇进行洗脱，收集深红色洗脱液。
步骤S4所述MCX阳离子柱吸附与洗脱流程：将步骤S3的浓缩液加入活化后的MCX阳离子树脂进行吸附，用1:25(v:v)的冰醋酸和纯乙醇混合溶液漂洗，随后用体积比为1:1的纯乙醇和浓度为2.0mol/L的氯化钠溶液混合液洗脱，收集洗脱液。
玫瑰茄花色苷提取物中总花色苷含量测定采用pH示差法进行；总酚含量测定采用福林酚法进行。玫瑰茄花色苷提取物中花色苷的质量分数为87.3％，总酚的质量分数为92.4％。
实施例4玫瑰茄花色苷提取物的制备
S1.将玫瑰茄花萼干粉碎后过80目筛，得到的玫瑰茄粉末，加入0.1％的盐酸酸化的90％乙醇进行浸提24h，玫瑰茄粉末与酸化乙醇的比例为1g：10mL，过滤后取滤渣，滤渣再次浸提，共浸提3次，最后取提取液，减压浓缩，得到浓缩液。
S2.取1.0L步骤S1的浓缩液中加入200mL石油醚进行萃取，得到萃取液。
S3.将步骤S2的萃取液加入大孔吸附树脂中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到初步纯化的玫瑰茄花色苷溶液。
S4.将步骤S3的浓缩液加入到已活化的MCX阳离子交换柱中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到玫瑰茄花色苷提取物。
所述大孔吸附树脂柱的吸附与洗脱流程：将步骤S2的浓缩萃取液缓慢加入活化后的大孔吸附树脂，打开树脂柱下端出液口，让柱内液面缓慢下降，下降液面距柱床2～3cm后关闭出液口，待吸附后，以每小时1个柱体积的加液速度加入2个柱体积的0.2％(w/w)的HCl溶液清洗后，以每小时1个柱体积的加液速度加入1.5倍柱体积的90％(v/v)乙醇进行洗脱，收集洗脱液。
步骤S4所述MCX阳离子柱吸附与洗脱流程：将步骤S3的浓缩液加入活化后的MCX阳离子树脂进行吸附，用1：20(v:v)的冰醋酸和纯乙醇混合溶液漂洗，随后用体积比为1：1的纯乙醇和浓度为2.0mol/L的氯化钠溶液混合液洗脱，收集深红色洗脱液。
玫瑰茄花色苷提取物中总花色苷含量测定采用pH示差法进行；总酚含量测定采用福林酚法进行。玫瑰茄花色苷提取物中花色苷的质量分数为94.6％，总酚的质量分数为96.3％。
测试例1玫瑰茄花色苷提取物对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎的膳食干预实验
1、实验方法
本发明采用饮用1.9％DSS化学致炎剂诱导小鼠建立结肠炎模型，用实施例 2制备得到的玫瑰茄花色苷提取物对结肠炎小鼠的膳食进行干预。具体地，采用 125mg/kg/day低剂量玫瑰茄花色苷提取物和250mg/kg/day高剂量玫瑰茄花色苷提取物进行膳食干预。
将50只C57BL/6小鼠随机被分为5个组别，每组10只：空白对照组(Control 组)、造模对照组(DSS组)、花色苷对照组(ARE组)、低剂量花色苷膳食干预组(125ARE+DSS组)、高剂量花色苷膳食干预组(250ARE+DSS组)。 DSS、125ARE+DSS、250ARE+DSS三组小鼠造模期间自由饮用1.9％DSS水溶液，建立结肠炎模型，Control及ARE两组正常饮水。其中ARE、125ARE+DSS、250ARE+DSS三组小鼠在造模期间分别给予高剂量(250mg/kg/day)、低剂量(125mg/kg/day)与高剂量(250mg/kg/day)灌胃，其余组给予生理盐水灌胃。造模共20天，共2个周期造模，各8天。
建模实验结束后，分离血清，解剖取剖取肛门至盲肠末端(包括回盲部结肠) 的整个结肠肠段、盲肠内容物、结肠内容物，测定肠炎相关生理指标及肠道菌群。每天监测小鼠体重变化情况、便血情况及粪便形状，评估玫瑰茄花色苷提取物对结肠炎小鼠体重、肠道消化排遗的影响。通过H&E染色和阿利新蓝染色分析玫瑰茄花色苷提取物对DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织病理情况及肠道粘膜屏障的影响，并用qPCR技术测定粘蛋白MUC-2的mRNA表达水平。采用Elisa试剂盒测定血清中炎症因子水平和qPCR技术测定结肠组织中炎症因子及紧密连接蛋白mRNA表达水平，分析玫瑰茄花色苷提取物对DSS诱导炎症水平影响。通过气相色谱仪测定小鼠盲肠内容物短链脂肪酸含量，并对结肠内容物进行 16SrDNA测序，分析玫瑰茄花色苷提取物对DSS诱导结肠炎小鼠肠道菌群稳态调节作用。
2.实验结果
各组小鼠在干预期体重变化和处死时结肠长度、结肠重量和结肠重量与长度比值如图1所示；其中，图1A为干预期体重变化；图1B为解剖小鼠取得结肠段；图1C为各组小鼠结肠长度；图1D为各组小鼠结肠重量与长度比值。从图 1可以看出，DSS造模组在第6天体重开始明显下降(p＜0.05)，玫瑰茄花色苷提取物干预后，体重下降趋势变缓，125ARE+DSS组在第14天膳食干预后显著缓解体重下降(p＜0.05)，而，250ARE+DSS组体重变化与DSS模型组没有显著差异(p>0.05)(见图1A)；DSS造模组在第6天粪便成稀状，肉眼可观察到便血出现，玫瑰茄花色苷提取物干预后，稀便减少，隐血减少(见图1B)。上述结果表明：玫瑰茄花色苷提取物对DSS诱导的结肠炎小鼠体重下降、隐血及腹泻有缓解的作用，低剂量组干预效果好于高剂量组。另外，DSS组小鼠结肠解剖时发现结肠组织变脆，易断，肉眼可见的不同程度的肠内出血与肿胀，结肠中的粪便成稀状，大都不成形，结肠长度短于Control组(p＜0.01)，且结肠重量/长度比值高于Control组(p＜0.05)。玫瑰茄花色苷提取物膳食干预的两组小鼠结肠组织肉眼观察颜色正常，无异常水肿，结肠长度和重量/长度比值与Control 组无显著性差异。结果表明，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预能缓解结肠炎小鼠结肠缩短、水肿等炎症表现，且对结肠的长度与重量无副作用改变。
各组小鼠处死时结肠组织H&E染色与结肠组织炎症评分如图2；其中，图 2A为各组小鼠结肠组织H&E染色；图2B为根据H&E染色结果对结肠组织炎症的评分。从图2A可以看出，DSS组小鼠结肠组织中隐窝结构被破坏，肠上皮细胞被损坏且排列紊乱，弥漫性中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞浸润，血管壁不紧密。不同剂量玫瑰茄花色苷提取物膳食干预组小鼠结肠中，仅有少量肠上皮细胞皮损，隐窝结构明显，少量炎症细胞浸润。从图2B可知，与Control组相比，模型小鼠结肠组织病理学评分显著升高(p＜0.001)，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预可显著降低结肠组织病理学评分，且125ARE+DSS组膳食干预效果最佳(p＜0.01)。上述实验结果说明玫瑰茄花色苷提取物对DSS诱导的小鼠结肠组织损伤具有保护作用。
各组小鼠结肠组织阿利新蓝染色和MUC-2mRNA表达水平如图3所示；其中，图3A为根据阿利新蓝染色结果对结肠组织粘液层面积统计结果；图3B为结肠组织中MUC-2mRNA表达水平；图3C为各组小鼠结肠组织阿利新蓝染色结果。从图3A可以看出，DSS模型组结肠组织粘液层的分布比对照组显著减少，玫瑰茄花色苷可以缓解这种减少。从图3C可以看出，DSS模型组小鼠结肠组织杯状细胞数量减少，粘液减少，这可能导致致病菌与肠上皮细胞直接接触，促使结肠炎症发生；玫瑰茄花色苷提取物低、250ARE+DSS组小鼠结肠组织杯状细胞数量较多、形态正常、分布均匀，明显优于DSS模型对照组，且与Control 组接近。结果显示，DSS可显著降低小鼠结肠组织杯状细胞数量，减少黏液分泌，破坏肠道黏液屏障(p＜0.01)；而玫瑰茄花色苷提取物干预明显缓解杯状细胞数量减少情况，促进黏液分泌，其高剂量对结肠黏液屏障的保护作用优于低剂量组 (p＜0.05)。通过qPCR检测结肠组织中MUC-2的mRNA表达水平发现，与 Control组相比，DSS组小鼠结肠中的MUC-2表达水平降低。高剂量玫瑰茄花色苷提取物膳食干预后，MUC-2表达水平显著增加(p＜0.05)(见图3B)。结果表明，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预能减少DSS诱导的杯状细胞的损伤，提高粘液层厚度，保护肠道粘膜屏障。
各组小鼠结肠组织中紧密连接蛋白表达水平、血清和结肠组织中炎症因子水平如图4所示；分别为各组小鼠结肠组织中Claudin-1、Occludin和ZO-1紧密连接蛋白mRNA表达水平；各组小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平；各组小鼠结肠组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平。从图4中可以看出， qPCR检测结肠组织中紧密连接蛋白的mRNA表达水平结果中，与Control组相比，DSS模型组中的Claudin-1的表达水平非常显著增加(p＜0.01)，在玫瑰茄花色苷提取物干预后，表达水平下降，特别是低剂量组(p＜0.05)。DSS组中 ZO-1与Occludin表达水平下降，玫瑰茄花色苷提取物干预后呈上调趋势，高剂量组比低剂量组明显。结果表明，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预对于DSS诱导的紧密连接蛋白下调有缓解作用。在血清中，与Control组相比，DSS组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著升高(p＜0.01)。在玫瑰茄花色苷提取物膳食干预后，这些促炎因子水平均有显著下降(p＜0.05)。在结肠组织中与 Control组相比，DSS组小鼠结肠组织中的IL-6和TNF-α水平非常显著升高(p ＜0.01)，IL-1β显著升高(p＜0.05)，表明DSS的诱导引起接结肠组织炎症反应的发生。在玫瑰茄花色苷提取物膳食干预后，这些促炎因子水平均不同程度的下调。其中，低剂量的玫瑰茄花色苷提取物膳食干预比高剂量组抗炎作用要好，特别是对IL-6有下调非常显著的作用(p＜0.01)。
各组小鼠盲肠内容物中乙酸、丙酸、丁酸以及短链脂肪酸含量的测定结果如图5所示；其中，图5A是乙酸含量，图5B是丙酸含量，图5C是丁酸含量，图 5D是总短链脂肪酸含量。从图5可以看出，与Control组相比，DSS模型组小鼠盲肠内容物中丙酸含量(图5B)明显减少(p＜0.01)，乙酸(图5A)和丁酸 (图5C)也有所减少(p＜0.05)，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预后，显著提高了小鼠盲肠内容物中丙酸(p＜0.01)，并且提高了乙酸(p＜0.05)和丁酸含量； DSS造模组小鼠盲肠内容物中总SCFA含量(图5D)明显减少(p＜0.01)，说明DSS组小鼠肠道中产SCFA的菌群有所减少，肠道菌群稳态在一定程度上失调，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预后，显著提高了小鼠盲肠内容物中的总SCFA 含量(p＜0.01)。结合图5A～C的结果，表明高剂量花色苷膳食干预组相比低剂量花色苷膳食干预组组更能提高乙酸、丙酸、丁酸和总SCFA含量，帮助缓解 DSS诱导小鼠的结肠炎。
图6是各组小鼠结肠内容物微生物门水平相对丰度变化，其中，图6A为结肠肠道菌群在门水平的相对丰度；图6B为拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度；图6C为变形菌门(Proteobacteria)相对丰度；图6D为软壁菌门(Tenericutes) 相对丰度；图6E为念珠菌门(Candidatus_saccharibacteria)相对丰度，图6F为螺旋菌门(Spirochaetes)相对丰度，图6G为厚壁菌门与拟杆菌门比例。从图6A 可以看出，DSS诱导结肠炎小鼠肠道中的菌群(厚壁菌Fimicutes、拟杆菌 Bacteroidetes、放线菌Actinobacteria、变形菌Proteobacteria、疣微菌verrucomicrobia、软壁菌Tenericutes、脱铁杆菌Deferribacteres、念珠菌Candidatus_saccharibacteria、螺旋菌Spirochaetes等)组成及其比例发生明显变化。与Control组相比，DSS 组拟杆菌门丰度显著降低(p＜0.05)(图6B)，变形菌门丰度增加(p＜0.05) (图6C)，放线菌门下降(p＜0.05)(图6D)，软壁菌门增加(p＜0.01)(图 6E)，且发现一些有害菌门丰度增加，螺旋菌门非常显著增加(p＜0.01)(图 6F)，念珠菌门丰度增加(p＜0.01)。此外，与Control组相比，门水平中厚壁菌门与拟杆菌门比例(F/B)在DSS模型组比值显著增加(p＜0.05)(图6G)，玫瑰茄花色苷提取物膳食干预能缓解菌群稳态失调的变化，且高剂量组比低剂量组缓解能力更强，能显著调节F/B比例，降低有害菌门的丰度水平，维护肠道菌群平衡，改善DSS诱导小鼠结肠炎肠道菌群结构的失衡。
图7是各组小鼠结肠内容物微生物属水平相对丰度变化，其中，图7A为结肠肠道菌群在属水平的相对丰度；图7B为萨特氏菌属(Sutterella)相对丰度；图6C为螺杆菌属(Helicobacter)相对丰度；7D为绿脓杆菌属(Turicibacter) 相对丰度；图7E为大肠杆菌/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)相对丰度；图 7F为葡萄球菌属(Staphylococcus)相对丰度；图7G为肠杆菌属(Enterorhabdus) 相对丰度；图7H为双歧杆菌属(Bifidobacterium)相对丰度；7I为欧陆森氏菌属(Olsenella)相对丰度；图7J为丁酸弧菌属(Butyricimonas)相对丰度；图 7K为普雷沃氏菌属(Prevotella)相对丰度；图7L为副杆状菌属(parabacteroides) 相对丰度。从图7可以看出，DSS组小鼠，相对于Control组，属水平上增加了条件致病菌的丰度，如萨特氏菌属(p＜0.05)、螺杆菌属(p＜0.05)和绿脓杆菌属(p＜0.01)；增加了与肠道疾病相关的致病菌丰度，如大肠杆菌/志贺氏菌属(p＜0.05)、葡萄球菌属(p＜0.05)和肠杆菌属(p＜0.001)。高剂量玫瑰茄花色苷膳食干预都能显著降低上述致病菌的丰度，加强了机体免疫抵抗能力。此外，研究表明，高剂量组玫瑰茄花色苷膳食干预能增加DSS诱导的结肠炎小鼠肠道菌群中益生菌。对比于DSS组与Control组，高剂量组中双歧杆菌非常显著增加(p＜0.01)、陆森氏菌的丰度(p＜0.01)(图7H、I)；增加DSS诱导的结肠炎小鼠肠道菌群中产短链脂肪酸的菌群丰度，如丁酸弧菌属丰度非常显著增加(p＜0.01)、普雷沃氏菌非常显著增加(p＜0.01)；调节与紧密连接蛋白相关的菌属丰度，DSS组中副杆状菌属丰度非常显著增加(p＜0.01)，高剂量组中非常显著下降(p＜0.01)。上述结果表明，在属水平上，高剂量组玫瑰茄花色苷膳食干预能增加DSS诱导的结肠炎小鼠肠道菌群中益生菌；增加肠道菌群中产短链脂肪酸的菌群丰度；调节与紧密连接蛋白相关的菌属丰度；降低致病菌的菌群丰度。

Claims (10)

1.一种玫瑰茄花色苷提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将玫瑰茄花萼干粉碎后过筛，得到玫瑰茄粉末，在玫瑰茄粉末中加入酸化溶液进行浸提，过滤后取滤渣，滤渣再次浸提，重复若干次，合并提取液，减压浓缩，得到浓缩液；
S2.在步骤S1的浓缩液中加入萃取剂进行萃取，萃取后取萃取液；
S3.将步骤S2的萃取液加入已活化的大孔吸附树脂中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到浓缩液；
S4.将步骤S3的浓缩液加入到已活化的MCX阳离子交换柱中，进行吸附与洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到玫瑰茄花色苷提取物。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述酸化溶液为酸化醇溶液，所述酸为甲酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、三氟乙酸或盐酸中的一种或几种，所述醇为乙醇、丙二醇或异丙醇中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述玫瑰茄粉末与酸化溶液的比例为1g：(3～20)mL；所述浸提的时间10～30h。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2所述萃取剂为石油醚或乙酸乙酯；所述浓缩液与萃取剂的体积比例为1～10。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述大孔吸附树脂柱吸附与洗脱流程：将步骤S2的浓缩萃余液加入活化后的大孔树脂进行吸附，用酸性水溶液清洗后，再用乙醇洗脱，收集洗脱液。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S4所述MCX阳离子交换柱吸附与洗脱流程：将步骤S3的浓缩液加入活化后的MCX阳离子交换柱进行吸附，用体积比为1:(15～25)的冰醋酸和纯乙醇混合溶液漂洗，随后用体积比为1：(0.3～3)的纯乙醇和氯化钠溶液混合液洗脱，收集洗脱液；步骤S4所述玫瑰茄花色苷提取物中花色苷的质量分数为70％～95％。
7.权利要求1～6任一所述制备方法制备得到的玫瑰茄花色苷提取物。
8.权利要求7所述玫瑰茄花色苷提取物在食品中的应用。
9.权利要求7所述玫瑰茄花色苷提取物在制备预防或缓解结肠炎的保健品和/或药物中的应用。
10.根据权利要求9的应用，其特征在于，所述玫瑰茄花色苷提取物在制备缓解体重减少、降低血清和组织中的炎症水平、缓解结肠的缩短和水肿、保护肠道粘膜屏障、提高肠道短链脂肪酸总含量、维持肠道菌群稳态和降低肠道有害菌的丰度的药物和/或保健品中的应用。
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