CN115770251A - 刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，属于医药技术领域。动物实验结果表明，本发明将刺糖中性多糖用于溃疡性结肠炎的小鼠模型后，能缓解结肠缩短的现象，抑制有害菌的产生，降低螺杆菌属丰度，增加有益菌数量，提高乳杆菌属、拟杆菌属和颤螺菌属的丰度。因此，本发明刺糖中性多糖可作为制备预防或治疗溃疡性结肠炎的药物。

Description

刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的 应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(UC)是一种以长期炎症为特征的炎症性肠病，起源于直肠，以近端连续延伸到结肠，导致溃疡和血性腹泻。临床表现腹泻、腹痛，甚至可有血便，病程可长达几十年甚至伴随终生，严重降低了患者的生活质量，缩短患者寿命，增加社会经济负担。由于其在所有年龄段的高发生率、复杂性、复发性、难以愈合和高癌症风险，该病已成为全球公共卫生问题。溃疡性结肠炎的确切病因尚不清楚，遗传易感性、肠道屏障受损、免疫调节紊乱和肠道菌群失衡等因素的复杂相互作用导致了疾病发生。临床一线药物如氨基水杨酸类、激素和免疫抑制剂等，都有一定的缺陷，疗效有限、缺乏特异性且毒副作用明显，导致溃疡性结肠炎反复发作，甚至病情逐渐加重。因此发现治疗溃疡性结肠炎更有效更经济的药物是研究的热点和难点。

近年来研究表明中药多糖可以通过多种过程有效地缓解和治疗溃疡性结肠炎，具有安全性、效果明确、不良反应少等优点。将多糖作为治疗溃疡性结肠炎药物或者一线药物的佐剂，也许是可以克服目前治疗肠道疾病的药物缺点的一种有效的治疗策略。

刺糖中性多糖提取自刺糖(Alhagi Honey)，豆科类植物蝶形花亚科骆驼刺属，半灌木骆驼刺叶子分泌液所凝结成的糖粒，颜色呈黄白色，形状呈圆形或椭圆形。刺糖中性多糖具有多种生物活性，但国内外对其研究集中于增强免疫、抗菌、降血糖，对治疗溃疡性结肠炎未有相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

优选的，所述刺糖中性多糖的提取方法包括：刺糖经脱脂、乙醇除杂、水提、透析、醇沉、脱蛋白、脱色、纯化后，得到刺糖中性多糖；所述透析在截留分子量为500-2000Da的透析袋中进行，所述透析的时间为12-36h。

优选的，所述醇沉包括将透析液与无水乙醇混合，得到混合液，于2-5℃下醇沉20-30h；所述混合液中乙醇的体积百分含量为70-90％。

优选的，所述水提的料液比为1：5-10g/mL，温度为85-95℃，时间为0.5-1.5h。

优选的，所述脱蛋白采用Sevage法；所述脱色采用摇床静态吸附法。

优选的，所述纯化包括依次进行DEAE纤维素柱洗脱分离和葡聚糖凝胶柱洗脱分离。

优选的，所述刺糖中性多糖能缓解溃疡性结肠炎患者结肠缩短、稀便、血便的症状。

优选的，所述刺糖中性多糖能抑制肠道中有害菌的产生，增加有益菌数量。

优选的，所述刺糖中性多糖能降低螺杆菌属丰度，提高乳杆菌属、拟杆菌属和颤螺菌属的丰度。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。动物实验结果表明，本发明将刺糖中性多糖用于溃疡性结肠炎的小鼠模型后，能缓解结肠缩短的现象，抑制有害菌的产生，降低螺杆菌属丰度，提高乳杆菌属、拟杆菌属和颤螺菌属的丰度。因此，本发明刺糖中性多糖可作为制备预防或治疗溃疡性结肠炎的药物。

附图说明

图1为葡萄糖标准曲线；

图2为刺糖多糖紫外光谱；

图3为造模流程图；

图4为小鼠体重变化的分析图；

图5为小鼠DAI分析图；a为具有代表性的小鼠粪便直观图；b为小鼠DAI评分图；

图6为DSS诱导小鼠的结肠长度；a为具有代表性的结肠组织图片；b为结肠长度分析图；

图7为结肠病理组织分析；a为结肠病理组织切片H&E染色图；b为结肠病理组织学评分图；

图8为脾脏指数变化图；

图9肠道菌群主成分分析图；不同颜色或形状的图形代表不同条件下的样本；横、纵坐标的刻度是相对距离，代表了样品受主成分(PCo1或PCo2)影响下的相似性距离；

图10为肠道菌群属水平群落组成的柱状图；横坐标中每个条形图代表一个样本，纵坐标代表该分类层级的序列数目，同一种颜色代表相同的分类级别；

注：图4-7中数据表示为平均值±S.D.“###”与对照组相比，P<0.001；“*”与DSS诱导的UC组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

具体实施方式

本发明提供了刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

在本发明中，所述溃疡性结肠炎优选包括溃疡性结肠炎。

在本发明中，所述刺糖中性多糖的提取方法优选包括：刺糖经脱脂、乙醇除杂、水提、透析、醇沉、脱蛋白、脱色、纯化后，得到刺糖中性多糖；所述透析在截留分子量优选在500-2000Da的透析袋中进行，更优选为1000Da；所述透析的时间优选为12-36h，更优选为24h；所述醇沉优选包括将透析液与无水乙醇混合，得到混合液，优选于2-5℃下醇沉20-30h，更优选为4℃下醇沉24h；所述混合液中乙醇的体积百分含量优选为70-90％，更优选为80％；所述水提的料液比优选为1:5-10g/mL，更优选为1:9g/mL，温度优选为85-95℃，更优选为90℃；时间优选为0.5-1.5h，更优选为1h；所述脱蛋白优选采用Sevage法；所述脱色优选采用摇床静态吸附法；所述纯化优选包括依次进行DEAE纤维素柱洗脱分离和葡聚糖凝胶柱洗脱分离。本发明使用1000Da透析袋，1000Da可以刚好区分刺糖中性多糖与寡糖、单糖、蛋白质，方便除去分子量较小的糖类和蛋白质，并且损失的多糖更少，得率更高；所述透析24h为优选时间，小于24h醇沉不充分得到的粗多糖少，大于24h有更多的色素鞣质杂质沉淀出现，影响后续分离；本发明所述80％乙醇沉淀可以将大部分多糖沉淀出来提高得率；本发明所述提取前处理(石油醚脱脂和乙醇除杂)减少杂质引入，总糖含量更高；本发明脱色时采用摇床静态吸附，透析速度快量大提高效率，更适合大规模工业应用。

在本发明中，所述刺糖中性多糖能缓解溃疡性结肠炎患者结肠缩短、稀便、血便的症状；所述刺糖中性多糖能抑制肠道中有害菌的产生，增加有益菌数量；所述刺糖中性多糖能降低螺杆菌属丰度，提高乳杆菌属、拟杆菌属和颤螺菌属的丰度。本发明将刺糖中性多糖用于溃疡性结肠炎的小鼠模型后，能缓解结肠缩短的现象，抑制有害菌的产生，降低螺杆菌属丰度，增加有益菌数量，提高乳杆菌属、拟杆菌属和颤螺菌属的丰度。实验结果表明，本发明刺糖中性多糖在治疗溃疡性结肠炎方面具有潜在药用价值。

本发明所涉及的原料对来源没有特殊限定，采用本领域市售产品即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

刺糖中性多糖的提取

1、刺糖粗多糖的提取

取刺糖药材100g，干燥粉碎，与石油醚1:3比例于60℃水浴回流脱脂处理，过滤之后沉淀与95％乙醇1:3比例水浴回流除醇溶性物质，过滤后沉淀与水1:9混合于90℃下恒温水浴回流1h，过滤之后将滤液通过旋转真空蒸发器将其浓缩到原来体积的1/5，使用1000Da分子量透析袋透析24h取袋内透析液后再次浓缩，加入无水乙醇至80％(v/v)醇沉浓度，在4℃下醇沉24h。过滤离心收集沉淀物，并依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤，最后得到浅黄色的干燥粉末，为刺糖粗多糖粉末ASP。

采用苯酚－硫酸法对多糖样品中总糖含量进行测定。

(1)绘制葡萄糖标准曲线：于500mL容量瓶中配置40μg/mL的葡萄糖母液，分别吸取0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL于8支试管中，补水至2.0mL。然后加入1.0mL苯酚溶液(6％)及5.0mL浓硫酸，充分混合，室温静置，反应20min后，在490nm处测吸光值A，水作为空白。以标准葡萄糖浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线(图1)，回归方程为y＝0.5473x+0.1365(R²＝0.9862)。表明在40-200μg/mL范围内标准葡萄糖浓度与490nm处吸光度值呈良好线性关系。

取4.6mg刺糖粗多糖粉末ASP配置成为1mg/mL刺糖粗多糖溶液测得在490nm处吸光度A为2.324，带入标准曲线得样品中总糖含量3.9969mg，经计算(提取率/％＝总糖含量/样品质量×100％)提取得刺糖粗多糖中总糖提取率为81.57％。

2、刺糖粗多糖的提纯

(1)Sevage法除蛋白

凯氏定氮仪检测步骤1刺糖粗多糖粉末中蛋白含量为1.78％，取步骤1所得的刺糖粗多糖ASP溶解于水中，向其中加入1/5体积的正丁醇-氯仿混合液，4000r/min离心20min后，去除沉淀，重复操作3次以上，直至完全除去蛋白质成分。将除去蛋白质的上清液减压浓缩，加入无水乙醇4℃沉淀24h，真空冷冻干燥。

使用紫外光谱于185nm～800nm波长范围内扫描，在260nm和280nm处没有显示任何吸收峰(图2)，说明蛋白质脱除完全，不存在蛋白质和核酸杂质。

(2)静态吸附法脱色

采用静态吸附法，用大孔树脂(AB-8)对脱蛋白后的刺糖粗多糖进行脱色处理。即将600mL刺糖多糖液(25mg/mL)与250g大孔树脂AB-8(湿重)混合于锥形瓶中，置于摇床，以200rpm转速在室温下振荡12h。过滤收集滤液，在去离子水中透析72h，直至去离子水中的电荷不再变化。最后将透析液浓缩收集，冷冻干燥。

(3)DEAE纤维素柱洗脱

采用规格为2.6cm×60cm的玻璃层析柱，称取5g粗多糖粉末，溶解于50mL超纯水中，离心取上清液滴加上样，分别用超纯水、0.1-0.9mol/L梯度NaCl溶液进行洗脱，洗脱速度为1.0mL/min，每管15mL洗脱液。以苯酚硫酸法于490nm处检测各洗脱液中多糖的含量，以吸光度值对管数绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线合并洗脱液，收集水溶液洗脱的组分。

(4)葡聚糖凝胶柱洗脱

称取DEAE纤维素柱洗脱后的刺糖多糖组分5g，用20mL超纯水完全溶解，离心，取上清液，用胶头滴管沿管壁缓慢滴加。用超纯水以0.3mL/min流速洗脱，每管10mL，收集30管。用苯酚硫酸法在490nm处进行跟踪检测，合并洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥。得到精制刺糖中性多糖。

实施例2

动物实验

1、动物分组及给药

实验流程如图3所示，昆明小鼠56只，全雄，体重18-22g，每组8只，随机分组：

模型组(Control)：持续灌胃给予4％DSS(葡聚糖硫酸钠)至给药结束，期间自由饮水；

空白对照组(DSS)：每日自由饮水，在造模第9天后灌胃给予生理盐水；

阳性对照组(5-ASA)：每日灌胃4％DSS溶液0.7mL，一天4次，在造模第9天后灌胃给予10mg/mL 5-氨基水杨酸(120mg/mL)进行治疗；

刺糖治疗3组：刺糖多糖低剂量(200mg/kg，AP-L)、中剂量(400mg/kg，AP-M)、高剂量(800mg/kg，AP-H)三组，每组每日灌胃4％DSS溶液0.7mL，一天4次，在造模第9天后分别灌胃给予不同剂量的刺糖多糖水溶液，同时每日给予4％DSS；

上述各组，每组8只小鼠；

同笼饲养实验组：取4只4％DSS诱导但不治疗的溃疡性结肠炎小鼠(Cohouse+DSS)，4只4％DSS诱导的溃疡性结肠炎但给予高剂量刺糖多糖治疗的小鼠(Cohouse+AP-H)，做好标记放入同一笼中饲养，观察不给药小鼠和给药小鼠的变化。

2、评估小鼠疾病变化情况

每天记录小鼠的体重、粪便特征和便血情况进行疾病活动指数(diseaseactivity index,DAI)评估。DAI值为体重下降百分比、大便的形状和大便隐血情况三者评分的平均值。

实验小鼠的体重下降百分率(％)：体重不变记为0分；1-5记为1分；6-10记为2分；11-15记为3分；大于15记为4分；

正常小鼠大便记为0分；松散的大便记为2分；稀便的记为4分；

正常小鼠大便且肛门不出血记为0分；隐血阳性为2分；显性出血记为4分，如下表所示。

表1疾病活动度指数评分标准

3、样品收集

第22天，在小鼠空腹12h后对小鼠进行眼球取血，4℃下3000r/min离心10分钟后取上清，在-80℃保存用于生化分析。收集小鼠的新鲜粪便，保存在-80℃用于肠道菌群的检测。给药结束后，颈椎脱臼处死小鼠，切除从盲肠至肛门上方1cm之间的结肠，收集小鼠的结肠组织，测量结肠长度后，置于4％多聚甲醛溶液中固定进行HE染色组织切片观察。

脾指数测定

解剖所得脾脏，洗净称重，计算小鼠脾指数，脾指数为脾脏占小鼠总体重的比值。

4、组织病理学分析

给药结束时，观察到同笼饲养组小鼠自主食取同类粪便的现象。

给药结束后，颈椎脱臼处死小鼠，切除从盲肠至肛门上方1cm之间的结肠，测量其长度。将结肠组织置于福尔马林中固定后，按照常规方法包埋，切成厚度约4-5μm的切片，固定在粘附性载玻片上。采用苏木素-伊红(H&E)染色，首先将玻片置于二甲苯中脱蜡5min；其次置于不同浓度的乙醇中各5min，水洗2min；再用苏木素蓝化2min，自来水冲洗；然后置于盐酸酒精中数秒，自来水冲洗；再用伊红染液染2min，自来水冲洗2遍；最后脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下进行组织学观察分析。根据体重、粪便特征和便血情况进行炎症评分。采用单因素方差分析(anova)方法对数据进行比较。P<0.05被认为有统计学意义。所有统计分析均采用SPSS软件和Graph-pad prism7软件进行，结果以均值±SEM(均值的标准误差)表示。具体结果见图4～8。

由图4～8可知，与空白对照组相比，模型组的DAI评分显著升高，结肠长度明显缩短，小鼠出现便血，精神萎靡不振，毛发杂乱等状况，说明小鼠结肠产生炎症。给予三个不同刺糖中性多糖浓度给药治疗，小鼠的DAI评分有不同程度的下降，结肠长度缩短的现象有所缓解，炎症症状减轻。

在本领域中，结肠长度和脾指数是结肠炎炎症表型的重要指标，溃疡性结肠炎常表现为结肠缩短便血，肠道菌群失调，恢复结肠缩短和调整肠道菌群环境可以直接说明与溃疡性结肠炎的关系。结肠缩短和调整肠道菌群环境可以证明能够达到预防和/或治疗的效果；在同笼期间，动物以粪便为食(食粪性)，或者通过自我清洁摄取粪便可以说明动物微生物群落均一化，能够达到治疗结肠炎炎症的效果。

如图4所示，对照组的小鼠体重逐渐增加，相比之下，DSS组的小鼠从第8天起体重持续下降。相比之下，AP-H组以剂量依赖的方式明显改善了小鼠的体重下降(P<0.001)。

粪便的代表性照片见图5a，刺糖中性多糖可以缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的血便、稀便情况，且刺糖中性多糖治疗后DAI评分明显降低(P＜0.001)，AP-H组以及Cohouse-AP800组显示出最明显的疾病恢复程度，效果与阳性药物5-氨基水杨酸相似(图5b)。

结肠的代表性照片见图6a，表明刺糖中性多糖可以缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠短缩情况。如图6b所示，与对照组小鼠相比，DSS治疗后结肠长度明显缩短，DSS组为5.72±0.21cm，对照组为9.53±0.44cm(P＜0.001)，而5-ASA组(7.48±0.55cm)和AP-H组(7.95±0.74cm)可以明显缓解DSS诱导的结肠缩短(P<0.001)。

图7中H&E染色显示，对照组小鼠的结肠组织结构基本正常，其结肠黏膜完整，隐窝中的杯状细胞排列规则。与对照组相比，DSS组的小鼠有严重的黏膜溃烂，炎症细胞渗入黏膜组织，杯状细胞消失，隐窝破坏。这些变化反映在明显较高的病理评分上(P<0.001)。给予刺糖中性多糖治疗后，结肠病变组织得到改善，病理学明显评分下降(P<0.001)。然而，AP-L组仍显示出更严重的黏膜溃疡、炎症细胞浸润、隐窝细胞丧失，病理学评分下降不明显，相比之下，AP-H组、Cohouse+DSS组和Cohouse+AP-H组改善更明显，表现出黏膜溃疡明显减轻、炎症细胞浸润减少和隐窝恢复。

如图8所示，与对照组(2.71±0.23mg/g)相比，DSS组小鼠的脾脏肿大明显(8.63±1.52mg/g)，而5-ASA组(4.92±1.17mg/g)、AP-H组(4.83±0.93mg/g)、Cohouse-AP800组(5.25±0.91mg/g)可以明显减少脾脏肿大(P<0.001)。

简而言之，刺糖中性多糖可以以剂量依赖的方式治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎，400mg/kg和800mg/kg剂量的刺糖中性多糖可以明显减轻DSS小鼠症状。而与800mg/kg刺糖中性多糖治疗的小鼠同笼饲养，可增加DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎症状的恢复，表明刺糖中性多糖可能通过改变肠道菌群达到治疗效果。

5、16S rRNA基因测序及微生物组分析

采用FastPfu引物(338F和806R)聚合酶PCR扩增细菌16S核糖体RNA(rRNA)基因的V3-V4区。然后用凝胶提取纯化扩增子，并使用定量荧光-st进行定量。纯化的扩增子以等摩尔浓度汇集，并使用IlluminaMiSeq仪器进行对端测序。

微生物组分析结果如图9～10所示。

免疫调节紊乱是溃疡性结肠炎关键的直接发病机制，肠道菌群是这种免疫损伤过程中的重要激发因素。由图9检测结果可知，对照组和DSS组的组成结构有显著的差异，DSS破坏了肠道微生物群结构，而每个治疗组的肠道微生物群沿PCo1和PCo2方向行进，随着刺糖中性多糖剂量的增加，微生物群的聚类向Control组靠近，这表明刺糖中性多糖保护了DSS引起的生态紊乱。Cohouse+DSS组和Cohouse+AP-H组的微生物群结构发生变化，比AP-H组更接近对照组。图10对小鼠肠道菌群进行了属水平下的分析，乳杆菌属、拟杆菌属、普氏菌属和螺杆菌属是丰富度最高的菌属，DSS组小鼠肠道菌群严重失衡，与Control组相比，DSS组小鼠的肠道菌群的组成和结构发生了很大的改变，乳杆菌属，拟杆菌属，颤螺菌属丰度显著降低，螺杆菌属丰度显著增加。相较于DSS组，刺糖中性多糖治疗后各组螺杆菌属丰度降低，乳杆菌属，拟杆菌属，颤螺菌属丰度都增加，其中AP-H组效果增加，菌群水平逆转，表明刺糖中性多糖可抑制有害菌的产生，通过增加有益菌来调节肠道菌群。

综上所述，刺糖多糖对DSS诱导的溃疡性结肠炎有一定的保护和预防作用，改善溃疡性结肠炎引起的小鼠肠道菌群数量和结构的改变和恶化，使其肠道有益菌增加从而显著改善溃疡性结肠炎病理症状，同时同笼饲养组通过小鼠自主食取同类粪便，也验证了小鼠的粪便中微生物之间也可相互影响和调节肠道内微生物的结构和数量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述刺糖中性多糖的提取方法包括：刺糖经脱脂、乙醇除杂、水提、透析、醇沉、脱蛋白、脱色、纯化后，得到刺糖中性多糖；

所述透析在截留分子量为500-2000Da的透析袋中进行，所述透析的时间为12-36h。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述醇沉包括将透析液与无水乙醇混合，得到混合液，于2-5℃下醇沉20-30h；所述混合液中乙醇的体积百分含量为70-90％。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水提的料液比为1：5-10g/mL，温度为85-95℃，时间为0.5-1.5h。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述脱蛋白采用Sevage法；所述脱色采用摇床静态吸附法。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述纯化包括依次进行DEAE纤维素柱洗脱分离和葡聚糖凝胶柱洗脱分离。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述刺糖中性多糖能缓解溃疡性结肠炎患者结肠缩短、稀便、血便的症状。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述刺糖中性多糖能抑制肠道中有害菌的产生，增加有益菌数量。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述刺糖中性多糖能降低螺杆菌属丰度，提高乳杆菌属、拟杆菌属和颤螺菌属的丰度。

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