TWI569803B - 靈芝多醣體用於抑制脂肪肝形成之用途及其製備方法 - Google Patents

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Description

靈芝多醣體用於抑制脂肪肝形成之用途及其製備方法
本發明係關於一種靈芝多醣體之用途。進一步而言，本發明係提供一種靈芝多醣體之製備方法及其作為抑制脂肪肝形成之用途。
脂肪肝是一種三酸甘油酯大液泡累積於肝臟所形成的狀況。這個情況大多發生在酗酒或是肥胖個體的肝臟上。脂肪肝通常與發炎相關，稱作脂肪肝炎(steatohepatitis)。長期來說，脂肪肝疾病可能導致數種併發症，包括肝硬化、肝腫瘤以及死亡。目前脂肪肝的高普遍度使其成為大眾健康的主要威脅，其全球人口的普遍度約為10至24%。因此，在現代社會中，脂肪肝之預防及治療成為一個主要的目標。
傳統中藥在亞洲國家中有著悠久的歷史，可追溯至幾千年前。通常使用的一類傳統藥物是由藥用蕈類組成，例如牛樟芝(Antrodia cinnamomea)、巴西蘑菇(Agaricus blazei Murrill)、靈芝(Ganoderma lucidum)以及冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis)，這類藥物具有包含免疫調節作用在 內的廣泛生物活性。藥用蕈類靈芝(G.lucidum)在亞洲國家中是用於促進健康以及增長壽命。然而，此蕈類是否能夠在脂肪肝疾病上產生有益的效果，仍然是未知的。
綜觀人類脂肪肝發生率的升高及其於預防及治療上的困難，人們需要一種替代性的方法來預防、治療或是控制脂肪肝，尤其是一種新的方法可直接導入日常飲食中，而不會大幅改變生活方式且不會產生毒性或不良的影響。
有鑑於此，本發明之一方面係提供一種靈芝(Ganoderma lucidum)多醣體用於製備治療或預防脂肪肝之藥物的用途，其中該靈芝多醣體之分子量係大於135kDa；且其中該靈芝多醣體至少包含甘露醣(mannose)、葡萄醣(glucose)及半乳醣(galactose)。在本發明之一實施例中，其中該本發明之靈芝多醣體可進一步包含岩藻醣(fucose)、鼠李醣(rhamnose)、阿拉伯醣(arabinose)及葡萄醣胺(glucosamine)。在本發明之一實施例中，該靈芝多醣體中岩藻醣、鼠李醣、阿拉伯醣、葡萄醣胺、半乳醣、葡萄醣以及甘露醣的比例係為2：2：2：1：16：26：47至3：3：3：1：17：27：48。在本發明之一實施例中，其中該靈芝多醣體之重量平均分子量係為846kDa，以及範圍係介於135kDa至5,364kDa之間，分子量分布指數(Mw/Mn)係為6.25。本發明所提供之靈芝多醣體係降低一個體之肝臟重量及肝臟脂肪的含量。在本發明之一實施例中，該靈芝多醣體之有效劑量係0.001mg/kg至1g/kg。
本發明之另一方面係提供一種靈芝多醣體之製備方法，包含：由一靈芝菌絲以水萃取，並續以一醇類沉澱，再經離心分離與濾膜過濾而得，其中(a)將一靈芝菌絲與水混合並以低轉速萃取一預定時間，取上清液並將該上清液濃縮，以獲得一靈芝萃取濃縮物；(b)將該靈芝萃取濃縮物加入一醇類靜置一段時間以沉澱出一靈芝多醣體粗萃取物；以及(c)將該靈芝多醣體粗萃取物離心後獲得一沉澱物；以切向流過濾系統(tangential flow filtration,TFF)過濾該沉澱物，以獲得一靈芝多醣體。
在本發明之一實施例中，步驟(a)之該上清液係以蒸發方式濃縮且步驟(a)該靈芝菌絲與水混合的比值為5.0%(w/v)；步驟(b)中該醇類係為95%酒精、該靈芝萃取濃縮物之濃度比值為20.0%(w/v)、該靈芝萃取濃縮物與95%酒精混合的比例為1：5、而該一段時間係至少16小時；步驟(c)之切向流過濾系統由0.2μm中空纖維膜過濾及10-300kDa超限濾膜(50cm2，PES)之組合進行劃分過濾。
本發明之靈芝多醣體係可用於在動物體或人體中降低肝臟重量及肝臟脂肪的含量，因此，可提供作為治療或預防脂肪肝相關疾病之醫藥品、補充品、或飲食品。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，以下所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖係為本發明靈芝多醣體之萃取流程圖；第2圖係為本發明使用高效能陰離子交換色層分析儀裝配脈衝式安培檢測器(high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)分析靈芝多醣體分餾液(G1)中的單醣組成；第3圖係為本發明之靈芝多醣體分餾液(G1)之凝膠滲透圖譜(gel permeation chromatogram)；第4圖係為本發明之靈芝多醣體分餾液(G1)的分子量取對數(Log molecular weight)對重量分部/微分分子量取對數(weight fraction/dLogMW)的曲線圖；第5圖係為本發明靈芝多醣體分餾液(G1)的分子量取對數(Log molecular weight)對累積重量分部(cumulative weight fraction)的曲線圖；第6圖係為靈芝多醣體在高脂飲食小鼠之肝臟上的效果。8週C57BL/6NCrlBltw公小鼠隨機分為10組，每組5隻。小鼠餵食標準chow飼料(能量來源13.5%為脂肪)或是高脂肪含量飼料(能量來源60%為脂肪)，每天藉由胃內灌食的方式灌入100μL的靈芝多醣體分餾液(G1至G4)或蒸餾水處理，持續二個月。之後犧牲小鼠並秤其肝臟重量如第6A圖。第6圖中，肝臟組織以油紅O(oil red O，簡稱ORO)將脂質染色(6B圖)並以Image J軟體量化被染色的程度(6C圖)，顯示靈芝多醣體分餾液G1與G2降低高脂飲食(HFD-fed)小鼠的肝臟重量與脂肪含量。以學生t檢定分析統計上的顯著差異(**P<0.01,***P<0.001)。比例尺：30μm。
定義
本文所述之有效劑量係用以表示能降低動物及人類肝臟重量及肝臟脂肪的含量並抑制脂肪肝形成之靈芝多醣體劑量。適當的有效劑量可依施予生物體或個體的不同而有所差異，但可以包含劑量遞增之研究方式的各種實驗技術決定有效劑量。
如於本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本發明提供一種能抑制脂肪肝形成的靈芝多醣體，經由實驗顯示本發明之靈芝多醣體能有效降低一個體的肝臟重量及肝臟脂肪含量。概括而言，每日給予哺乳動物或人類本發明之多醣體0.001至1,000mg/kg(體重)劑量可有效降低該哺乳動物或人類肝臟脂肪的含量，詳細說明如下。
首先，將靈芝多醣體定性，之後經由實驗顯示該分離的靈芝多醣體對於脂肪肝的效果實驗。
實施例1 本發明靈芝多醣體的製備方法
本發明之靈芝多醣體具有大於135kDa之分子量能有效用於降低肝臟重量及肝臟脂肪的含量。本發明之靈芝多醣體可加入至飲食中，其可為一飲品、日常補充品或食品，不需要在生活方式有太大的改變，且不會引起毒素或對健康造成不良的影響。
1.1 本發明靈芝水溶性萃取濃縮液的製備步驟
第1圖係顯示從靈芝菌絲分離多醣體之方法。首先，將10L蒸餾水混合由長庚生物科技股份有限公司(臺北，臺灣)取得之乾燥液態發酵的靈芝菌絲(500g)形成混合液(50g/L)，其中固體與液體比值為5.0%(w/v)，以20公升攪拌式反應器，轉速為150RPM(revolution per minute)、121℃高溫的條件下萃取30分鐘。接著，離心該萃取後混合液以去除固體物質以獲得一靈芝水萃取物，並以蒸發方式濃縮該萃取物至體積為2.5公升，並分裝至20ml暗色玻璃安瓶，接著經高壓高溫滅菌處理二十分鐘，以獲得一固體與液體比值為20.0%(w/v)的一靈芝萃取濃縮液，保存於4℃備用。
1.2 本發明靈芝多醣體粗萃取物的製備步驟
如第1圖所示，取120ml、20.0%(w/v)的靈芝萃取濃縮物(代號為W1，含有總水溶性碳水化合物6.03g；詳見表1)，加入600ml(五倍靈芝水萃取濃縮物體積)、95%酒精混合均勻，在4℃靜置16小時以沉澱出靈芝多醣體酒精粗萃取物，接著續以離心去除上清液，並以120ml、70%冰酒精清洗及離心沉澱靈芝多醣體粗萃取物三次。接著，將三次的上清液混合為酒精沉澱上清液，體積為1,050mL(代號為G4，含有總水溶性碳水化合物2.82g；詳見表1)。取1,000mL蒸餾水復溶酒精沉澱靈芝多醣體粗萃取物，並濃縮至體積為700ml以去除殘留酒精，接著加入蒸餾水定量此靈芝多醣體粗萃取物體積至2,400mL(代號為W2，含有總水溶性粗多醣3.21g；見表1與表2)。
1.3 本發明靈芝多醣體粗萃取物的分離純化
取2,400ml靈芝多醣體粗萃取物至50℃水浴槽，接著以切向流超限過濾系統TFF(Spectrum公司，KrosFlo型號)組合0.2μm中空纖維膜(1,500cm2，polyethersulfone，PES)進行劃分過濾並將過膜壓力(transmembrane pressure，TMP)控制在15-16psi進行劃分過濾。當回流液體積剩餘800至1000mL時補入蒸餾水600mL，繼續進行過濾。重複操作補入蒸餾水600mL三次，共計補入蒸餾水1,800mL。得到650mL的G1-1分餾液(含總水溶性粗多醣1.26g)及3,600mL過濾液。
取上述3,600ml、0.2μm中空纖維膜過濾液至50℃水浴槽，接著以切向流過濾系統組合300kDa超限濾膜(50cm2，PES)進行劃分過濾，將過膜壓力控制在16-18psi。當回流液體積剩餘1,000至1,200mL時補入蒸餾水600mL，繼續操作過濾。得到950mL的G1-2分餾液(總水溶性粗多醣0.60g)及3,600mL過濾液。合併G1-1分餾液與G1-2分餾液得到1,600mL的G1分餾液(總水溶性粗多醣1.86g；詳見表2)。
另取上述步驟3,600mL過濾液至50℃水浴槽，接著以切向流過濾系統組合10kDa超限濾膜(50cm2，PES)進行劃分過濾，將過膜壓力控制在16-18psi。當回流液體積剩餘1,000至1,200mL時補入蒸餾水600mL，繼續操作過濾。得到970ml的10kDa至300kDa的G2分餾液(總水溶性粗多醣1.01g；詳見表2)，3,600ml的10kDa過濾液，該10kDa過濾液即為小於10kDa的G3分餾液(總水溶性粗多醣0.34g；詳見表2)。
將劃分收集到的四個G1-G4分餾液，進行濃縮至少量體積並復溶蒸餾水至體積110mL。每一分餾液分裝至五瓶20mL暗色玻璃安瓶，接著經121℃滅菌二十分鐘，保存於4℃備用。
1.4 本發明之靈芝多醣體總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多醣含量分析
本發明使用酚-硫酸法分析20.0%(w/v)的靈芝水萃取濃縮物(代號為W1，120mL)、靈芝多醣體粗萃取物(代號為W2，2,400mL)、G1分餾液(1,600mL)、G2分餾液(970mL)、G3分餾液(3,600mL)、與G4分餾液(1,050mL)之總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多醣含量。配製0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.18與0.20mg/mL之葡萄糖標準溶液。每一濃度的葡萄糖標準溶液分別取200μL至1.5mL微量離心管，再加入200μL、5%苯酚並混合均勻。接著加入1mL硫酸，混合均勻。待靜置二十分鐘，以分光光度計(spectrophotometer)在波長490nm下測定其讀值，並以此讀值建立檢量線，檢量線之R2>0.99。待測樣品經適當稀釋後，取200μL至1.5mL微量離心管，再加入200μL、5%苯酚混合均勻。接著加入1mL硫酸，混合均勻。待靜置二十分鐘，以分光光度計在波長490nm下測定其讀值，將讀值帶入檢量線可以計算獲得總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多醣的濃度。
靈芝多醣體粗萃取物的總水溶性碳水化合物與總水溶性粗多醣含量分析結果如表1及表2所示，其中在表2的20%(w/v)靈芝萃取濃縮液的總水溶性粗多醣含量分布分析中，靈芝多醣體粗萃取物(W2)的總水溶性粗多醣中含有1.86克截留分子量大於300kDa的本發明之靈芝多醣體(G1)，其佔總靈芝多醣體萃取物(W2)的57.9%。
1.5 本發明之靈芝多醣體的單醣組成分析
第2圖顯示使用高效能陰離子交換色層分析儀裝配脈衝式安培檢測器(Dionex ICS-5000 System)分析分餾液(G1)之單醣組成。岩藻醣(L-fucose)、鼠李醣(L-rhamnose)、半乳醣胺(D-galactosamine)、阿拉伯醣(D-arabinose)、葡萄醣胺(D-glucosamine)、半乳醣(D-galactose)、葡萄醣(D-glucose)與甘露醣(D-mannose)之標準混合溶液濃度為0.1、0.5、1.0、2.0與5.0mg/L。分析條件係注射體積為25μL、分析管柱為CarboPac PA1(4×250mm)、移動相為純水(92%)與200mM氫氧化鈉水溶液(8%)經混合後組成比例為16mM氫氧化鈉水溶液、流速為1.0ml/min以及管柱烘箱溫度 為30℃。注射入單醣標準品，經過三十分鐘之分析時間，可獲得單醣標準品在0.1、0.5、1.0、2.0與5.0mg/L的峰形積分面積，以此積分面積建立各別單醣之檢量線，檢量線之R2>0.99。
取0.21mL的分餾液(G1)(總水溶性粗多醣3mg)加入2.79mL蒸餾水以及1.33mL三氟醋酸(trifluoroacetic acid)，在112℃下加熱12小時進行酸水解。接著將此混合物濃縮並反覆復溶於蒸餾水以除酸，最後復溶於蒸餾水至1mg/mL。此水解產物經稀釋4倍(0.25mg/ml)後取25μL，利用高效能陰離子交換色層分析儀搭配脈衝式安培檢測器與分析管柱分析，移動相為純水(92%)與200mM氫氧化鈉水溶液(8%)經混合後組成比例為16mM氫氧化鈉水溶液、流速為1.0ml/min以及管柱烘箱溫度為30℃。經過30分鐘之分析時間，將樣品分析所得峰形之滯留時間與積分面積與上述8個標準品相比對，可經由標準品檢量線計算出分餾液(G1)的各別單醣濃度，進而獲得單醣組成的百分比。分餾液(G1)經高效能陰離子交換色層分析儀搭配脈衝式安培檢測器分析單醣組成比例，岩藻醣佔2.8%，鼠李醣佔2.5%，阿拉伯醣佔2.9%，葡萄醣胺佔1.1%，半乳醣佔16.9%，葡萄醣佔26.3%以及甘露醣佔47.5%(詳見第2圖、表3與表4)。
1.6 本發明之靈芝多醣體的多醣分子量分佈分析
本發明使用分子篩滲透層析法(size-exclusion chromatography，SEC)搭配折射(refractive index，RI)、微差黏度(differential viscosity，DV)、以及光散射(light scattering，LS)三合一偵測器之高效液相色谱分析儀(high performance liquid chromatography，配有Waters 2410折射率檢測器index detector，Viscotek 270雙檢測器)來分析分餾液(G1)中的多醣分子量分佈。製備濃度為1.5mg/mL的分子量標準品葡聚糖(Dextran 670)進行系統校正。分析條件係為注射體積100μL、分析管柱為串接2組GPC管柱TSKgel G5000PWxL(7.8×300mm)與TSKgel G6000PWxL(7.8×300mm)、移動相為純水添加0.02% NaNO3、流速為0.8ml/min、管柱分析溫度 為22℃。
取分餾液(G1)(總水溶性粗多醣7.5mg/mL)並以上述條件進行分析。將樣品分析所得之RI-DV-LS數據(如第3圖所示)經Viscotek OmniSEC系統進行分析計算，計算公式如下：Mn：數目平均分子量
Mw：重量平均分子量
Mz：較高平均分子量
Mp：最高波鋒分子量，為分子量分布最高重量分布點的分子量
Mi：單鏈分子量(molecular weight of a chain)
Ni：單鏈的數目(number of chains of that molecular weight)
將分餾液(G1)分析所得之RI-DV-LS數據(第3圖)經OmniSEC軟體進行分析計算之後，得到多醣分子量分佈圖如第4圖所示，其中Mn(數目平均分子量)為135,395Da、Mw(重量平均分子量)為846,622Da、Mz(z-平均分子量)為5,364,000Da，與峰值分子量Mp(最高波鋒分子量)為309,436Da。多醣分子重量累積如第5圖所示，Mn與Mw之累積重量分率(cumulative weight fraction)為0.79與0.18，換算多醣分子量介於Mn為135,395Da至Mw為846,622Da之間約占總多醣重量之61%。
因此，本發明之分餾液(G1)雖為截留分子量300kDa超限濾膜所截留，但是由於多醣類的生物高分子特性在一般的情況下會產生團聚現象，因此多醣實際分子量會有小於濾膜截留分子量現象，如第4圖所示分餾液(G1)分子量分布，證實本發明之分餾液(G1)之分子量係大於135kDa的靈芝多醣體分餾物。
實施例2 本發明之靈芝多醣體對高脂飲食小鼠(High-Fat Diet-fed，HFD-fed)之治療脂肪肝疾病的效果
第6圖顯示靈芝多醣體分餾液(G1、G2、G3及G4)在高脂飲食小鼠之肝臟上的效果。8週C57BL/6NCrlBltw公小鼠隨機分為10組，每組5隻。小鼠餵食標準chow飼料(能量來源13.5%為脂肪)或是高脂肪含量飼料(能量來源60%為脂肪)，每天藉由胃內灌食的方式灌入100μL的靈芝多醣體分餾液(G1、G2、G3、以及G4)或蒸餾水處理，持續二個月，分別為HFD+G1、HFD+G2、HFD+G3、HFD+G4、HFD、Chow+G1、Chow+G2、Chow+G3、Chow+G4及Chow組。之後犧牲小鼠並秤其肝臟重量如第6A圖。第6圖中，肝臟組織以油紅O(oil red O，簡稱ORO)將脂質染色(6B圖)並以Image J軟體量化被染色的程度(6C圖)，顯示靈芝多醣體分餾液G1與G2降低高脂飲食(HFD-fed)小鼠的肝臟重量與脂肪含量。
在肝臟重量方面，如第6A圖所示，相較於其他HFD組，HFD+G1組的肝臟重量較低，顯示不同分子量的靈芝多醣體對降低肝臟重量的效果不同，其中又以大於135kDa分子量的靈芝多醣體的效果最佳。 在肝臟脂肪方面，如第6B圖所示，HFD+G1組較其他多醣體處理HFD組降低肝臟脂肪的效果最佳，顯示不同分子量的靈芝多醣體對降低肝臟脂肪的效果不同，其中又以大於135kDa分子量的靈芝多醣體的效果最佳。
在所有靈芝多醣體分餾液中，對高脂飲食小鼠來說，多醣體分餾液G1與G2有達到統計上的顯著差異，多醣體分餾液G3與G4則無。而多醣體分餾液G1與G2又以G1差異更大，所以效果最好。因此，本發明之靈芝多醣體分餾液G1有最佳降低肝臟重量(第6A圖)以及肝臟脂肪的含量(第6B圖)。靈芝多醣體分餾液G1之多醣體含量為1.94g/100mL，故用以處理小鼠(體重為30g)之靈芝多醣體的劑量為0.0019g/小鼠體重。經由換算，可得用以處理人個體(體重為70kg)之靈芝多醣體分餾液(G1)的劑量係為4.53g/人個體體重，亦即用於人體之靈芝多醣體的劑量為0.0646g/kg(G1)。
本發明所提供之分離與純化的靈芝多醣體，在餵食HFD哺乳動物上可降低脂肪肝疾病的症狀。因此，本發明提供一個預防與治療人類脂肪肝疾病之新穎方法。這個方法有顯著商業潛力，可以廣泛地用於設計治療此疾病的商品及治療方法。前述結果僅代表本發明的一個示例性的應用。本發明之修飾與改良將成為本發明相關領域者的努力成果。這些修飾仍然落入本發明之範圍以及本專利之專利範圍內。

Claims (12)

  1. 一種靈芝(Ganoderma lucidum)多醣體用於製備治療或預防脂肪肝疾病之藥物的用途，其中該靈芝多醣體之分子量係大於135kDa；且其中該靈芝多醣體至少包含甘露醣(mannose)、葡萄醣(glucose)及半乳醣(galactose)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該靈芝多醣體進一步包含岩藻醣(fucose)、鼠李醣(rhamnose)、阿拉伯醣(arabinose)及葡萄醣胺(glucosamine)。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該靈芝多醣體中岩藻醣、鼠李醣、阿拉伯醣、葡萄醣胺、半乳醣、葡萄醣以及甘露醣的比例係為2：2：2：1：16：26：47至3：3：3：1：17：27：48。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該靈芝多醣體之重量平均分子量係為846kDa，以及範圍係介於135kDa至5,364kDa之間，分子量分布指數(Mw/Mn)係為6.25。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該靈芝多醣體係降低一個體之肝臟重量與肝臟脂肪的含量。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該靈芝多醣體之有效劑量係0.001mg/kg至1g/kg。
  7. 一種如申請專利範圍第1項所述之靈芝多醣體之製備方法，包含：由一靈芝菌絲以水萃取，並續以一醇類沉澱，再經離心分離與濾膜過濾而得，其中(a)將一靈芝菌絲與水混合並以低轉速萃取一預定時間，取上清液並將 該上清液濃縮，以獲得一靈芝萃取濃縮物；(b)將該靈芝萃取濃縮物加入一醇類靜置一段時間以沉澱出一靈芝多醣體粗萃取物；以及(c)將該靈芝多醣體粗萃取物離心後獲得一沉澱物；以切向流過濾系統(tangential flow filtration,TFF)過濾該沉澱物，以獲得一靈芝多醣體；該切向流過濾系統由0.2μm中空纖維膜過濾及300kDa超限濾膜之組合進行劃分過濾。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中步驟(a)之該上清液係以蒸發方式濃縮。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中步驟(a)該靈芝菌絲與水混合的比值為5.0%(w/v)。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中步驟(b)中該醇類係為95%酒精。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中步驟(b)該靈芝萃取濃縮物濃度比值為20.0%(w/v)與95%酒精混合的比例為1：5。
  12. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中步驟(b)該一段時間係至少16小時。
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