CN108159089A - 灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制备治疗和或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制药领域中的用途，尤其涉及一种灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途。本发明的灵芝孢子粉膳食纤维提取物不仅能明显有助于高脂饮食致肝损伤的修复，而且还对与肝损伤相关的疾病表现出明显的治疗和/或预防效果，例如能有效抑制炎症因子的表达，有效缓解炎症的恶化，改善免疫相关的各项生理病理指标，可以用于药物、保健品等各种领域中，具有极大的经济和社会价值。

Description

灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制备治疗和或预防高脂饮食致 肝损伤相关疾病的制剂中的用途
技术领域
本发明涉及灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制药、保健品等领域中的用途，尤其涉及一种灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途。
背景技术
肥胖是指人体内脂肪过分堆积，明显超出正常人的一般平均量，并出现机体代谢、生理生化的异常变化，被称为肥胖。截至2014年，世界已有6亿人属于肥胖人群，预计到2025年，世界肥胖人数将会达到14亿人，肥胖问题已经成为世界瞩目的公共卫生问题之一。研究发现，富裕社会常见疾病的发生发展多数与肥胖相关如糖尿病、高血压、冠心病、肝病、结肠癌、肾脏疾病、阿尔茨海默症等。肥胖发生机制复杂，主要包括遗传因素、环境因素等，其中大多数肥胖患者属于单纯性肥胖，由饮食结构不合理导致的，高脂饮食摄入过多，膳食纤维摄入不足是导致肥胖发生因素之一。
肠道微生物组被誉为“人体第二套基因组”，与人类健康息息相关。人类肠道微生物种类多达1000-1150种，其中厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌群，肠道基因组中的基因数量为人类自身基因组的150多倍。肠道菌群与宿主存在着互利共生关系，在肠道中保持着动态平衡，当平衡被打破时，人就有可能患上各种疾病。已有研究证实：(1)肠道菌群与肥胖相关，肥胖人群中多存在肠道菌群结构失调，细菌多样性下降的现象；肥胖小鼠的拟杆菌门少，厚壁菌门多；将肥胖小鼠的肠道微生物移植到无菌小鼠上，会导致后者脂肪量增加。对于肥胖的人来说，长期摄入高脂饮食，可造成肠道菌群结构的改变，失衡的肠道菌群会产生内毒素进入人体，被免疫细胞识别后产生多种炎症因子，导致机体处于低度炎症状态，产生代谢异常，使得从食物中摄取的能量容易转换成脂肪，造成肥胖；(2)肝脏和肠道在生物学功能上是密切相关、相互影响的。肝脏与肠道菌群通过肠-肝轴相互作用，肠道菌群与肝脏疾病密切，肝脏患病时，会影响肠道菌群的结构和功能，而肠道菌群失调时又会反过来影响肝脏功能，肝硬化患者双歧杆菌等有益菌数量降低，而肠杆菌、肠球菌等有害菌数量增多。
高脂饮食可以改变肠道菌群结构，使有益菌减少，破坏肠道菌群的平衡，进而影响肝脏功能，造成肝损伤，并且随着我国的生活水平的发展及饮食结构等问题的增加，由高脂饮食导致的肝损伤的发病率明显增加，迫切需要开发在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病方面的制剂。
灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子。每个灵芝孢子只有4－6个微米，是活体生物体，双壁结构，外被坚硬的几丁质纤维素所包围，人体很难充分吸收，破壁后更适合人体肠胃直接吸收。
灵芝孢子粉具有灵芝的全部遗传物质和保健作用，其药用价值日益受到重视。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵芝孢子粉膳食纤维提取物的制备方法，并运用灵芝孢子粉膳食纤维提取物治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤的相关疾病。
在本发明的第一方面，提供一种灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途。
其中，所述肝损伤相关疾病包括脂肪肝、肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝衰竭。
优选的，所述灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制备治疗和/或预防肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝衰竭等疾病的制剂中的用途。
在本发明的第二方面，一种灵芝孢子粉膳食纤维提取物的制备方法，包括将样品采用乙醇回流提取，滤渣采用水回流提取，再酶解，醇沉，洗脱，最终得到灵芝孢子粉膳食纤维提取物。
优选的，所述乙醇回流提取包括：采用料液比为1:8-1:15的乙醇，回流提取2-4小时。
优选的，所述滤渣采用水回流提取包括：采用料液比为1:8-1:15的水，回流提取2-4小时。
优选的，所述酶解为采用木瓜蛋白酶酶解。
优选的，所述酶解用量为提取液的0.2％体积，所述酶活性为75万u/g-85万u/g。
优选的，所述酶解温度为50℃-70℃，时间为1-2小时。
优选的，所述沉淀为采用醇类试剂沉淀，例如乙醇、甲醇。
进一步优选的，所述沉淀为加入酶解后液体4-6倍量的乙醇，沉淀12-24小时。
优选的，所述洗脱为将得到的沉淀采用浓度递增的乙醇、丙酮进行梯度洗脱。
进一步优选的，所述洗脱为将得到的沉淀采用78％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、丙酮进行梯度洗脱。
优选的，所述灵芝孢子粉膳食纤维提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将灵芝孢子粉干燥后，按照料液比为1：8-1：15(质量体积比)加入乙醇例如95％乙醇，用乙醇煮沸回流提取2h-4h，抽滤，得到滤渣；
(2)按照料液比为1:8-1:15(质量体积比)向滤渣中加水，煮沸回流提取2h-4h；
(3)待温度降至50℃-60℃左右时，调节pH值至6-7，向步骤2得到的滤渣中加入木瓜蛋白酶酶解，酶量为0.2％重量百分比，50-70℃水浴酶解1h-2h，不停搅拌；
(4)酶解结束后，加入提取液体积4-6倍量的乙醇沉淀过夜，抽滤，得到滤渣；
(5)将滤渣采用78％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、丙酮进行梯度洗脱，烘干，粉碎，优选过80目筛网，得到灵芝孢子粉膳食纤维。
在一个优选的实施例中，所述灵芝孢子粉膳食纤维提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将灵芝孢子粉干燥后，按照料液比为1：10加入乙醇例如95％乙醇，用乙醇煮沸回流提取2h，抽滤，得到滤渣；
(2)按照料液比为1:10向滤渣中加水，煮沸回流提取2h；
(3)待温度降至50℃-60℃左右时，调节pH值至6-7，向步骤2得到的滤渣中加入木瓜蛋白酶酶解，酶量为0.2％重量百分比，60℃水浴酶解1h，不停搅拌；
(4)酶解结束后，加入提取液体积4倍量的95％乙醇沉淀过夜，抽滤，得到滤渣；
(5)将滤渣采用78％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、丙酮进行梯度洗脱，烘干，粉碎，优选过80目筛网，得到灵芝孢子粉膳食纤维。
本发明的第三方面，一种治疗和/或预防肝损伤相关疾病的制剂，所述制剂包括药物、保健品或食品，所述制剂包含灵芝孢子粉膳食纤维提取物。
在本发明的第四方面，一种预防和/或治疗肝损伤相关疾病的药物，包含灵芝孢子粉膳食纤维提取物和药学上可接受的载体。
优选的，所述灵芝孢子粉膳食纤维提取物为上述制备方法制备得到的提取物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的制备方法简单易行、运行成本低，本发明的制备方法使用的提取溶剂只使用了乙醇和水，乙醇可以回收再利用，无有机试剂残留风险，保证了提取物的天然品质的同时且对环境友好，属于绿色制造技术。
(2)本发明采用乙醇提取灵芝孢子粉，去除醇溶性物质，采用木瓜蛋白酶酶解样品中的蛋白质，去除蛋白质，提高灵芝孢子粉膳食纤维的提取率和纯度。
(3)本发明的灵芝孢子粉膳食纤维提取物不仅能明显有助于高脂饮食致肝损伤的修复，而且还对与肝损伤相关的疾病表现出明显的治疗和/或预防效果，例如能有效抑制炎症因子的表达，有效缓解炎症的恶化，改善免疫相关的各项生理病理指标，可以用于药物、保健品等各种领域中，具有极大的经济和社会价值。
附图说明
图1为实施例2的小肠组织HE染色病理切片图(200倍显微镜观察)。
图2为实施例2的肝脏组织病理切片图(200倍显微镜观察)。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
如本文中所使用，术语“包含”或“包括”指方法包括所列举的要素，但不排除其它要素。
灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子。每个灵芝孢子只有4－6个微米，是活体生物体，双壁结构，外被坚硬的几丁质纤维素所包围，人体很难充分吸收。破壁后更适合人体肠胃直接吸收。灵芝孢子粉具有灵芝的全部遗传物质和保健作用。其药用价值日益受到重视,研究发现灵芝孢子具有增强机体免疫力,抑制肿瘤,保护肝损伤，辐射防护作用。
实施例1：灵芝孢子粉膳食纤维提取物的制备方法
(1)样品烘干后称重，料液比为1：10，用95％乙醇煮沸回流提取2h，抽滤，保留滤渣；
(2)滤渣加水，料液比为1:10，煮沸回流提取2h；
(3)待温度降至60℃左右时，调pH值至6-7，加入木瓜蛋白酶酶解，酶量为称样量的0.2％，60℃水浴酶解1h，期间不停搅拌；
(4)酶解结束，加入提取液体积4倍量的95％乙醇沉淀过夜，抽滤，保留滤渣；
(5)滤渣采用78％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、丙酮进行梯度洗脱，烘干，粉碎，过80目筛网，制得到膳食纤维。
对于制备得到的灵芝孢子粉膳食纤维提取物的提取率，提取物的为：提取物质量/样品称样量×100％＝47.21％。
对于制备得到的灵芝孢子粉膳食纤维提取物进行理化性质的测定：膨胀力为7.44ml/g，膨胀率为7.69ml/ml，持水力为6.11g/g，持油力为0.74g/g，吸附胆固醇能力为35.21mg/g(pH2.0)、42.29mg/g(pH7.0)。
对于制备得到的灵芝孢子粉膳食纤维提取物进行成分分析：水分4.88％，蛋白质6.76％，灰分5.58％，总膳食纤维82.56％。
实施例2：灵芝孢子粉膳食纤维提取物对高脂饮食诱导肥胖小鼠肝损伤的改善作用
1、试剂：
总胆固醇(T-CHO)测试盒：南京建成生物工程研究所。
甘油三酯(TG)测试盒：南京建成生物工程研究所。
低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒：南京建成生物工程研究所。
高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒：南京建成生物工程研究所。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测试盒、总蛋白(TP)测试、白蛋白(ALB)测试和总胆红素(T-Bil)测试盒都购自于南京建成生物工程研究所。
雌性C57小鼠30只，SPF级，体重12-14g，日龄28-30d，购自于广东省医学实验动物中心，许可证号为SCXK(粤)2013-0002。
大小鼠维持饲料：广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2013-0002。
高脂高胆固醇饲料配方如表1所示：
表1高脂高胆固醇饲料的主要成分及能量构成
灵芝孢子粉膳食纤维提取物按本发明实验例1制备。
2、方法
受试动物饲养在广东省微生物所动物实验中心，饲养温度与湿度：23±1℃，55±10％，采用12h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。小鼠自由进食饮水。期间每日检查动物一次，未发现不健康的动物，取全部健康小鼠进行实验。30只C57小鼠经适应性饲养7d后，随机分成正常组、模型组和给药组，每组10只。正常组用普通饲料饲料喂养，模型组和给药组用高脂高胆固醇饲料喂养，连续喂养一个月。
造模成功后，开始给药，给药组给予灵芝孢子粉膳食纤维提取物灌胃，1g膳食纤维提取物用15ml蒸馏水稀释，每只小鼠每天灌胃0.6ml，连续给药2个月。正常组用普通饲料饲料喂养，模型组和给药组用高脂高胆固醇饲料喂养，连续喂养一个月。
3、结果观察
每天观察动物的外观体态(毛、色、形)和动态并作相应记录，每隔3d测量动物体重一次。
每天观察动物的外观体态(毛、色、形)和动态并作相应记录，每隔3d测量动物体重一次。
血液：停药24h后，动物取材测定指标。采集血样，摘眼球取血，血浆经3000RPM，10min离心两次收集血清，测定血清中T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C、TP、ALB、GLB、ALT、AST、T-Bil水平。测定炎症因子包括细胞因子白细胞介素IL-2、IL-6、IL-22，和肿瘤坏死因子TNF-α。
组织：摘眼球取血后，处死并解剖小鼠，取小鼠小肠和肝脏组织，固定在4％多聚甲醛中。小肠和肝脏组织被制成石蜡切片，小肠组织采用苏木素-伊红(HE)法染色，肝脏组织分别采用苏木素-伊红(HE)、天狼星红(SRS)和油红O(ORS)染色，进行病理切片观察。
4、数据处理
所有数据以均数标准差表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间均数两两比较，方差齐时采用LSD法；方差不齐时采用Dunnett’s T3法。由SPSS软件完成，α＝0.05。
观察发现，给药组的动物的毛皮比模型组的毛皮更平滑。
各组的体重变化如表2所示。
表2小鼠体重变化
#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs正常组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组
从表2可以看出，正常组和模型组之间的平均体重差异极其显著(P<0.001)，模型组小鼠在开始时平均体重约20.35g，在实验结束时平均体重为35.29g，说明高脂饮食诱导肥胖小鼠模型造模成功；与模型组相比，给药组小鼠平均体重显著下降(P<0.01)(表2)。这表明：在高脂饮食中添加适量的膳食纤维可以显著减缓体重增加。
各组的血脂四项检测结果如表3所示。
表3小鼠血清生化指标(mmol/L)
#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs正常组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组
从表3可以看出，模型组中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇比正常组显著升高(P<0.001或P<0.01)，高密度脂蛋白胆固醇比正常组显著降低(P<0.001)；与模型组相比，给药组中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平显著下降(P<0.05或P<0.01)，高密度脂蛋白胆固醇水平显著升高(P<0.05)。这表明：在高脂饮食中添加适量的膳食纤维可以显著降低血清中的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平。
各组的炎症因子检测结果如表4所示。
表4炎症因子检测结果
#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs正常组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组
从表4可以看出，与正常组相比，模型组血清中所有细胞因子水平均偏离正常，TNF-α、IL-2、IL-6、IL-22、Foxo3差异显著(p<0.05)；与模型组相比，给药组所有这些细胞因子明显恢复，从而表明灵芝孢子粉膳食纤维可以改善炎症环境。
各组的肝功能测定结果如表5所示。
表5肝功能测定结果
#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs正常组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组
从表5可以看出，模型组小鼠血清中TP、ALB、ALT、AST和T-BIL水平比正常组显著升高P<0.05或P<0.01；与模型组相比，给药组TP、ALB、ALT、AST和T-BIL水平显著降低(P<0.05)。这表明：在高脂饮食中添加适量的膳食纤维可以显著改善肝功能。
小肠组织HE染色病理切片结果如图1所示，从图1可以看出，正常组小肠组织绒毛长而完整，模型组肠绒毛脱落严重，说明高脂饮食能够对小鼠的肠道造成损伤，说明模型是成功的。与模型组相比，经过药物处理后，给药组能够缓解损伤，促进肠道的修复。
肝脏组织病理切片结果如图2所示，从图2可以看出，HE染色结果显示正常组小鼠肝细胞结构正常，模型组小鼠肝细胞体积增大，肝细胞细胞质内出现很多大小不一的圆形空炮，将细胞核推向一侧，局部有炎性细胞浸润现象；与模型组相比，给药组小鼠肝细胞脂肪空泡数量明显减少，炎性细胞浸润现象有所好转；SRS染色和ORS染色结果分别显示，与模型组相比，给药组小鼠肝细胞结构明显改善，趋于正常组。
实施例3：灵芝孢子粉膳食纤维提取物对高脂饮食诱导肥胖小鼠肠道菌群失调相关疾病的改善作用
1、实验方法
采集实施例2中动物实验结束时小鼠粪便，经过液氮快速冷冻后，保存在-80℃冰箱中。从粪便样品中提取DNA，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。采用正向引物5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和反向引物5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'对小鼠16S rRNA的V3-V4区基因进行扩增。PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行切胶回收，回收采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒。参照电泳初步定量结果，将PCR扩增回收产物进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader(BioTek，FLx800)。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。使用MiSeq测序仪进行2×300bp的双端测序，相应试剂为MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)。
2、实验结果
各组的肠道菌群多样性结果如表6所示。
表6小鼠肠道菌群多样性指数
#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs正常组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组
从表6可以看出，与正常组相比，模型组小鼠肠道菌群的Alpha多样性指数Simpson和Shannon显著下降(P<0.05)，说明高脂饮食改变了小鼠肠道菌群结构，使其多样性降低；与模型组相比，给药组小鼠肠道菌群多样性指数Simpson和Shannon显著升高(P<0.05)，说明高脂饮食诱导的肥胖小鼠肠道菌群给予灵芝孢子粉膳食纤维治疗后，肠道菌群多样性显著增加。
各组的OTU丰度分析如表7和表8所示。
表7小鼠肠道菌群在门水平上的丰度
#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs正常组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组
表8小鼠肠道菌群在属水平上的丰度
#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs正常组；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型组
从表7可以看出，在门水平上，与正常组相比，模型组小鼠肠道菌群Bacteroidetes和Firmicutes丰度发生了显著变化，Bacteroidetes丰度显著降低(P<0.001)，Firmicutes丰度显著增加(P<0.001)，与模型组相比，给药组Bacteroidetes丰度显著增加(P<0.01)，Firmicutes丰度显著降低(P<0.01)。
从表8可以看出，在属水平上，与正常组相比，模型组有益菌Akkermansia、Bifidobacterium和Lactobacillus显著降低(P<0.01)，有害菌Allobaculum(P<0.001)和Dorea(P<0.05)显著增加，与模型组相比，给药组有益菌Akkermansia、Bifidobacterium和Lactobacillus显著增加(P<0.01)，有害菌Allobaculum(P<0.05)和Dorea(P<0.05)显著降低。
综上可以看到，灵芝孢子粉膳食纤维提取物不仅能明显有助于肠道内优势菌群结构恢复，有助于菌群多样化，而且还对与肠道菌群结构相关的疾病表现出明显的治疗和/或预防效果，能有效抑制炎症因子的表达，有效缓解炎症的恶化，改善免疫相关的各项生理病理指标，可以用于药物、保健品等各种领域中，具有极大的经济和社会价值。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途。
2.根据权利要求书1所述的用途，其特征在于，所述肝损伤相关疾病包括脂肪肝、肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝衰竭。
3.根据权利要求书1或2的用途，其特征在于，所述灵芝孢子粉膳食纤维提取物在制备治疗和/或预防肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、肝衰竭等疾病的制剂中的用途。
4.一种灵芝孢子粉膳食纤维提取物的制备方法，其特征在于，包括将灵芝孢子粉粉碎后，采用乙醇回流提取，将滤渣采用水回流提取，再将提取液酶解、沉淀、洗脱，得到灵芝孢子粉膳食纤维提取物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇回流提取包括：采用料液比为1:8-1:15的乙醇，回流提取2-4小时；和/或，所述滤渣采用水回流提取包括：采用料液比为1:8-1:15的水，回流提取2-4小时。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酶解为采用木瓜蛋白酶酶解，优选的，所述酶解用量为提取液的0.2％体积，所述酶活性为75万u/g-85万u/g；和/或，所述酶解温度为50℃-70℃，时间为1-2小时。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀为采用醇类试剂沉淀，例如乙醇、甲醇；和/或所沉淀为加入酶解后液体4-6倍量的乙醇，沉淀12-24小时；和/或，所述洗脱为将得到的沉淀采用78％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、丙酮进行梯度洗脱。
8.根据权利要求4至7中任一所述的制备方法，包括以下步骤：
(1)将灵芝孢子粉干燥例如烘干后粉碎，按照料液比为1：10加入乙醇例如95％乙醇，用乙醇煮沸回流提取2h，抽滤，得到滤渣；
(2)按照料液比为1:10向滤渣中加水，煮沸回流提取2h；
(3)待温度降至50℃-60℃左右时，调节pH值至6-7，向步骤2得到的滤渣中加入木瓜蛋白酶酶解，酶量为0.2％重量百分比，60℃水浴酶解1h，不停搅拌；
(4)酶解结束后，加入提取液体积4倍量的95％乙醇沉淀过夜，抽滤，得到滤渣；
(5)将滤渣采用78％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、丙酮进行梯度洗脱，烘干，粉碎，优选过80目筛网，得到灵芝孢子粉膳食纤维。
9.一种治疗和/或预防肝损伤相关疾病的制剂，其特征在于，所述制剂包括药物、保健品或食品，所述制剂包含灵芝孢子粉膳食纤维提取物。
10.一种预防和/或治疗肝损伤相关疾病的药物，其特征在于，包含灵芝孢子粉膳食纤维提取物和药学上可接受的载体。
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苏爱梅等: "《食品营养与健康》", 31 January 2013, 中国质检出版社 *

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