CN105012826B - 一种益智叶提取物及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种益智叶提取物及其制备方法、应用。该益智叶提取物采用以下步骤获得：取益智叶，加入乙醇，加热提取，提取的液体经浓缩干燥得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物和正丁醇部位萃取物。本发明经过体外结合体内实验，说明益智叶提取物在体外和体内均有一定降糖作用。

Description

一种益智叶提取物及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种益智叶提取物及其制备方法、应用。

背景技术

糖尿病（DM）是由遗传和环境因素相互作用所导致的复杂的内分泌疾病，即是胰岛素相对和/或绝对分泌不足（包括β细胞衰变、功能降低或/和胰岛素抵抗），而引起的糖、蛋白质、脂肪和继发的水、电解质等一系列代谢紊乱性疾病。常分为：І型、Ⅱ型及妊娠期糖尿病。糖尿病患者可出现葡萄糖耐量降低、高血糖、尿糖及胰岛素释放试验异常，临床表现为多饮、多食、多尿及体重减轻（三多一少），即烦渴、易饥、消瘦、疲乏无力等症状。

糖尿病引起血糖升高，可以加快葡萄糖的有氧氧化，增强蛋白的非酶糖基化作用和导致脂代谢异常，使体内存在一定程度的氧化应激和脂质代谢紊乱。氧化应激会使外周组织对胰岛素的敏感性下降，葡萄糖的利用降低。此外，氧化应激还会加剧胰岛β细胞凋亡，胰岛细胞数目减少，降低胰岛素的合成与分泌，使糖代谢异常进一步加剧。因此，氧化应激在糖尿病的病理衍变中起重要作用。可见，高血糖会引起糖尿病患者抗氧化系统紊乱，产生氧化应激，反过来氧化应激又会影响糖代谢，由此形成恶性循环。

益智（Alpinia oxyphylla Miq.），系姜科(Zingiberaceae)山姜属（Alpinia Roxb.）植物，主要分布于我国海南、广东、广西等地。其干燥成熟果实益智（FructusAlpiniae Oxyphyllae）被誉为四大南药之一，具有十分重要的药用价值，且属于药食同源品种，因此具有十分广阔的开发前景。益智果实作为一门传统中药，被历版《中国人民共和国药典》收载，其味辛、性温，归脾、肾经。有温脾止泻，摄唾涎，暖肾，固精缩尿的功能。主治脾寒泄泻，腹中冷痛，口多唾涎，肾虚遗尿，小便频数，遗精白浊。

近年来，对益智（Alpinia oxyphylla Miq.）的研究报道较多，也更系统，其中主要是对益智果实的研究。益智果实的传统功效被我国历代中医药学家熟练地运用于临床，而近年来对其又有了新的进展。现代药理学研究表明，益智果实还具有舒张血管、强心、抗癌、抗过敏、抗氧化、抗衰老、抗溃疡、镇静、镇痛、提高免疫力以及神经保护等多方面药理活性。益智果实中主要成分为倍半萜类、其次为黄酮类、二芳基庚烷类、甾醇及其苷类化合物。

查阅大量文献可发现，对益智的叶子研究报道较少。益智为多年生草本植物，每年结果后大量的茎叶部位废弃不用，结果五、六年后益智结果能力开始衰退，导致了资源不能合理利用。张俊清等对不同生长期益智果实、根茎及茎叶中化学成分的研究发现，在果实整个生长周期，二苯基庚烷类、萜类等化学性成分主要富集在益智果实中，而黄酮类化学成分基本均匀分布在益智的果实、根茎及茎叶中。易美华等研究发现，经提取挥发油后的益智果实及其茎、叶的提取物对猪油脂质均有较强的抗氧化作用；且均对超氧阴离子自由基有清除作用，清除能力依次为：益智的叶、益智的茎、提取挥发油后的益智果实。但关于治疗糖尿病方面的研究并未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有预防、治疗糖尿病作用的益智叶提取物，同时提供该提取物的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种益智叶提取物的制备方法，包括以下步骤：取益智叶，加入乙醇，加热提取，提取的液体经浓缩干燥得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物和正丁醇部位萃取物。

乙醇的浓度为60-75V%，加热提取时温度控制在50-60℃，提取3次，每次1-3h。

根据上述制备方法制得的益智叶提取物，为益智叶的石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物和/或正丁醇部位萃取物。

益智叶提取物在制备预防、治疗糖尿病药物或保健品方面的应用。

本发明为证实上述益智叶提取物的降糖作用，采用了体外α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，选择抑制活性好的溶剂萃取物进行体内实验，体内采用的是四氧嘧啶诱导小鼠糖尿病模型。体外结合体内实验，主要检测了糖尿病小鼠的血糖值（给药前空腹血糖、给药后空腹血糖、给药后餐后血糖）、肝糖原含量、血清中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力等生化指标，共同考查其对糖尿病的预防、治疗作用。结果表明，益智叶乙酸乙酯部位萃取物及正丁醇部位萃取物，在体外和体内均有一定降糖作用。

附图说明

图1为益智叶不同萃取物不同浓度对α-葡萄糖苷酶活性的影响；

图2位益智叶不同萃取物不同剂量对小鼠体重的影响。

具体实施方式

实施例1：

益智叶提取物由以下方法获得：取3400 g干燥益智叶，剪碎后，加入75V%乙醇，55℃提取3次，每次3 h，每次加入的乙醇体积均以完全浸没益智叶为准，过滤，合并滤液，浓缩干燥即得益智叶乙醇总浸膏（提取率为23.33%）；将此总浸膏分散于少量水中，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别收集萃取液，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚部位萃取物（提取率1.41%）、乙酸乙酯部位萃取物（提取率9.42%）和正丁醇部位萃取物（提取率11.71%）。

实施例2：

益智叶提取物由以下方法获得：取3400 g干燥益智叶，剪碎后，加入70V%乙醇，50℃提取3次，每次2h，每次加入的乙醇体积均以完全浸没益智叶为准，过滤，合并滤液，浓缩干燥即得益智叶乙醇总浸膏；将此总浸膏分散于少量水中，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别收集萃取液，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚部位萃取物（提取率1.23%）、乙酸乙酯部位萃取物（提取率10.11%）和正丁醇部位萃取物（提取率11.08%）。

实施例3：

益智叶提取物由以下方法获得：取3400 g干燥益智叶，剪碎后，加入60V%乙醇，60℃提取3次，每次1h，每次加入的乙醇体积均以完全浸没益智叶为准，过滤，合并滤液，浓缩干燥即得益智叶乙醇总浸膏；将此总浸膏分散于少量水中，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别收集萃取液，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚部位萃取物（提取率1.53%）、乙酸乙酯部位萃取物（提取率9.65%）和正丁醇部位萃取物（提取率10.96%）。

效果实验一：益智叶不同萃取物的体外抑酶活性试验

本发明选用的是以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物的酶抑制剂筛选模型，体外考察对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用。

样品溶液的配制

分别称取实施例1制得的一定质量的石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物、正丁醇部位萃取物，加入一定体积的DMSO，配成初浓度为30 mg/mL的样品溶液。

阳性参考药物阿卡波糖的配制同各萃取物。

检测方法及数据处理

实验组设置如下：

空白对照组：8 μL DMSO+152 μL磷酸钾缓冲液，于405 nm波长下测OD值；

空白组：8 μL DMSO+112 μL磷酸钾缓冲液+20 μL α-葡萄糖苷酶+20 μL PNPG，于405 nm波长下测OD值；

样品对照组：8 μL样品溶液（含阿卡波糖）+152 μL磷酸钾缓冲液，于405 nm波长下测OD值；

样品组：8 μL样品溶液（分别含石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物、正丁醇部位萃取物）+20 μL α-葡萄糖苷酶+112 μL磷酸钾缓冲液+20 μL PNPG，反应结束后于405nm波长下测OD值；（具体过程：112 μL磷酸钾缓冲液 (pH 6.8)，加入浓度为0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶20 μL、8 μL相应浓度的样品溶液，37℃恒温15 min，加入20 μL 2.5 mmol/LPNPG，37℃恒温反应15 min。再加入80 μL、浓度为 0.2 mol/L的终止剂Na₂CO₃溶液，于405nm波长下测OD值。）

同时做相同体系下的空白对照组、空白组、样品对照组、样品组，每组重复3次，按下面计算公式计算抑制率，并用Origin 6.0软件求出相应的IC₅₀值。

分别采用上述方法测定了益智叶石油醚部位萃取物、乙酸乙部位酯萃取物和正丁部位醇萃取物，及阳性参考药物阿卡波糖等试样的抑制率及IC₅₀值。

实验结果

注：NT：未测定。

阿卡波糖为阳性参考药物。

由表1可看到，在体系浓度达到1500 µg/mL时，益智叶石油醚部位萃取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率仅为37.52 ± 1.40%，并未达到50%，因此并未测出其IC₅₀值，且也并未在图1中显示出其趋势图。表1中，在体系终浓度为1500 µg/mL时，益智叶乙酸乙酯部位萃取物和其正丁醇部位萃取物的抑制率（101.13 ± 1.51%，91.44 ± 1.55%）均大于阳性参考药物阿卡波糖（62.62 ± 2.21%），且前两者的活性（IC₅₀=55.00 ± 0.23 µg/mL，345.70 ±2.51 µg/mL）也均大于阳性参考药物阿卡波糖（IC₅₀=1130.00 ± 52.94 µg/mL）。由表1和图1可看到，乙酸乙酯部位萃取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最好，其次是正丁醇部位萃取物。

效果实验二：益智叶不同萃取物对糖尿病小鼠的影响

2.1 实验方法

小鼠糖尿病模型实验方法，采用的是四氧嘧啶(alloxan)诱导小鼠致糖尿病，其作用机制主要是选择性损伤胰腺β细胞，引起细胞坏死，导致血胰岛素不同程度下降伴血糖升高，形成糖尿病。雄性KM小鼠90只，体重16～20 g，自由采食与进水，喂养一周适应环境后，体重达到25±2 g，分组染色，禁食不禁水10 h后，尾静脉注射四氧嘧啶（80 mg/kg b.w.），诱导小鼠胰岛β细胞损伤，从而形成糖尿病模型。

72 h后，小鼠内眦取血，离心，测定其空腹血糖值（表2），血糖值大于16.7 mmol/L时，作为造模成功的标准。选择造模成功的小鼠，按照血糖值均衡原则随机分配7组，每组10只，再次染色称重。根据体外实验结果，选择活性好的萃取部位进行体内实验，因此共设7组，分别为组1：益智叶乙酸乙酯部位萃取物高剂量组（800 mg/kg b.w.），组2：益智叶乙酸乙酯部位萃取物低剂量组（200 mg/kg b.w.），组3：益智叶正丁醇部位萃取物高剂量组（800mg/kg b.w.），组4：益智叶正丁醇部位萃取物低剂量组（200 mg/kg b.w.），组5：阳性对照阿卡波糖组（75 mg/kg b.w.）、组6模型组（0.5%CMC，0.2 mL/10 g b.w.），组7：正常组（0.5%CMC，0.2 mL/10 g b.w.）。

灌胃给药8天，每天观察小鼠的状态以及尿量和饮水量。第8天给药2 h后，眼内眦取血，测餐后血糖（表2）。禁食不禁水10 h后，摘眼球取血，并处死解剖，分离肝脏。取出的血，放于室温 1 h后，离心，分离上清液，测空腹血糖值（表2）、总胆固醇TCH含量（表3）、甘油三酯TG含量（表3）、丙二醛MDA含量（表4）以及超氧化物歧化酶SOD活力（表4）。取出的肝脏，洗净，从肝大叶上剪取30 mg，用于测肝糖原含量（表5）。并且在给药的8天时间里，每2天记录一次体重（图2）。

实验结果

（1）对糖尿病小鼠血糖的影响

注： 与空白组比较：^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与阿卡波糖比较：^êP<0.05，^êêP<0.01，^êêêP<0.001；与造模后空腹血糖值比较：^♥P<0.05，^♥♥P<0.01，^♥♥♥P<0.001。组1：益智叶乙酸乙酯部位萃取物高剂量组，组2：益智叶乙酸乙酯部位萃取物低剂量组，组3：益智叶正丁醇部位萃取物高剂量组，组4：益智叶正丁醇部位萃取物低剂量组，组5：阳性对照阿卡波糖组，组6：模型组，组7：正常组。

由表2看到，与组7比较，给药前空腹血糖值、给药后空腹血糖值及给药后餐后血糖值中所有组均有极显著升高（P<0.001）。剩余组与组6比较，给药前空腹血糖值中各组均无显著性差异（P>0.05）；给药后空腹血糖值中，组1、3、5非常显著性降低（P<0.01），组2显著性降低（P<0.05），组4无显著性差异（P>0.05）；给药后餐后血糖值中，只有组5有非常显著性降低（P<0.01），其他组均无显著性差异（P>0.05）。组1、2、3、4与组5比较，给药前空腹血糖值中，此4组均无显著性差异（P>0.05）；给药后空腹血糖值中，此4组均无显著性差异（P>0.05）；给药后餐后血糖值中，此4组均有非常显著性升高（P<0.01）。给药后空腹血糖值与给药前空腹血糖值比较，组1、3、5均有非常显著性降低（P<0.01），组2有显著性降低（P<0.05），组4无显著性差异（P>0.05），组6有极显著升高（P<0.001）。

由表2说明，阿卡波糖对糖尿病小鼠的餐后血糖有一定的治疗作用，而益智叶乙酸乙酯部位萃取物高低剂量组、正丁醇部位萃取物高低剂量组对其餐后血糖效果不佳。经过8天的给药后，除正丁醇部位萃取物低剂量组外，乙酸乙酯部位萃取物高低剂量组、正丁醇部位萃取物高剂量组以及阿卡波糖组与给药前空腹血糖值相比，均能一定程度的降低糖尿病小鼠空腹血糖值，且这4组组间无显著性差异（P>0.05），说明前三者对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的降糖效果与阿卡波糖相当。

（2） 对总胆固醇TCH含量、甘油三酯TG含量的影响

注： 与空白组比较：^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与阿卡波糖比较：^êP<0.05，^êêP<0.01，^êêêP<0.001；与造模后空腹血糖值比较：^♥P<0.05，^♥♥P<0.01，^♥♥♥P<0.001。组1：益智叶乙酸乙酯部位萃取物高剂量组，组2：益智叶乙酸乙酯部位萃取物低剂量组，组3：益智叶正丁醇部位萃取物高剂量组，组4：益智叶正丁醇部位萃取物低剂量组，组5：阳性对照阿卡波糖组，组6：模型组，组7：正常组。

表3中，与组7比较，TCH中组6有极显著性升高（P<0.001）、TG中组6显著性升高（P<0.05），表明造成糖尿病小鼠血清中脂质代谢紊乱。剩下组与组6比较，组1、组5的TCH含量显著性降低（P<0.05），TG含量非常显著性降低（P<0.01）；组2的TCH含量非常显著性降低（P<0.01），TG含量显著性降低（P<0.05）；组3的TCH、TG含量均非常显著性降低（P<0.01）；组4两种含量均无显著性差异（P>0.05）。给药的5组之间比较，组间无显著性差异（P>0.05）。

结果表明，除正丁醇部位萃取物低剂量组外，阳性对照药物阿卡波糖组、乙酸乙酯部位萃取物高、低剂量组以及正丁醇部位萃取物高剂量组均能较好地降低小鼠血清中TCH、TG含量，且此4组组间无显著性差异（P>0.05），说明这些部位萃取物能够使糖尿病机体的脂质代谢紊乱症状得到改善。

（3）对丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响

注： 与空白组比较：^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与阿卡波糖比较：^êP<0.05，^êêP<0.01，^êêêP<0.001；与造模后空腹血糖值比较：^♥P<0.05，^♥♥P<0.01，^♥♥♥P<0.001。组1：益智叶乙酸乙酯部位萃取物高剂量组，组2：益智叶乙酸乙酯部位萃取物低剂量组，组3：益智叶正丁醇部位萃取物高剂量组，组4：益智叶正丁醇部位萃取物低剂量组，组5：阳性对照阿卡波糖组，组6：模型组，组7：正常组。

表4中，组6与组7比较，组6的MDA含量极显著升高（P<0.001），SOD活性极显著降低（P<0.001），表明糖尿病小鼠血清中过氧化脂质代谢紊乱。给药组与组6比较，组1、组3、组5中的MDA含量均极显著降低（P<0.001），SOD活力均极显著升高（P<0.001）；组2的MDA含量极显著降低（P<0.001），SOD活力非常显著升高（P<0.01）；组4两项指标与组6的比较，均无显著性差异（P>0.05）。给予萃取物的4组与组5比较，无显著性差异（P>0.05）。

表4表明，除正丁醇部位萃取物低剂量外，阳性对照药物阿卡波糖组、乙酸乙酯部位萃取物高、低剂量组、正丁醇部位萃取物高剂量组均能较好地降低糖尿病小鼠血清MDA含量，同时升高超氧化物歧化酶SOD活力。且效果最好的为正丁醇部位萃取物高剂量组，其次为乙酸乙酯部位萃取物高剂量组和阿卡波糖组。这也说明这些部位萃取物可增强糖尿病小鼠机体的抗氧化应急能力。

（4）体内对肝糖原含量的影响

注： 与空白组比较：^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；与模型组比较：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与阿卡波糖比较：^êP<0.05，^êêP<0.01，^êêêP<0.001；与造模后空腹血糖值比较：^♥P<0.05，^♥♥P<0.01，^♥♥♥P<0.001。组1：益智叶乙酸乙酯部位萃取物高剂量组，组2：益智叶乙酸乙酯部位萃取物低剂量组，组3：益智叶正丁醇部位萃取物高剂量组，组4：益智叶正丁醇部位萃取物低剂量组，组5：阳性对照阿卡波糖组，组6：模型组，组7：正常组。

表5中，组6与组7比较，组6中的肝糖原含量极显著性降低（P<0.001），表明糖尿病小鼠的肝糖原含量下降明显。治疗组与组6比较，组1、组3非常显著性升高（P<0.01），组2、组5均极其显著性升高（P<0.001），组4与组6比较肝糖原含量无显著性差异（P>0.05）。给予萃取物的4组与给予阿卡波糖的组5比较，组3有显著性降低（P<0.05），组4有非常显著性降低（P<0.01），组1和组2与组5比较无显著性差异（P>0.05）。

结果表明，除正丁醇部位萃取物低剂量组外，乙酸乙酯部位萃取物高剂量组、乙酸乙酯部位萃取物低剂量组、正丁醇部位萃取物高剂量组及阿卡波糖组均能较好的促进血糖转化为肝糖原，且阳性对照药物阿卡波糖效果最好。

（5）对小鼠体重的影响

由图2看到造模前各组小鼠体重无显著性差异，造模后糖尿病小鼠体重下降较多，第4天开始灌胃给药，随着给药天数的增加，小鼠体重也在慢慢的回升，而模型组体重缓慢持续下降，且空白组的小鼠体重一直持续上升。

Claims (1)

1.益智叶提取物在制备预防、治疗糖尿病药物方面的应用，其特征在于：所述益智叶提取物为益智叶的乙酸乙酯部位萃取物和/或正丁醇部位萃取物；

所述益智叶提取物通过以下步骤制备：取益智叶，加入乙醇，加热提取，提取的液体经浓缩干燥得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物和正丁醇部位萃取物；

其中，乙醇的浓度为60-75V%，加热提取时温度控制在50-60℃，提取3次，每次1-3h。