TWI484966B - 海葡萄萃取物的萃取方法及用於製備抑制前列腺癌腫瘤細胞生長之藥物組合物 - Google Patents

Description

海葡萄萃取物的萃取方法及用於製備抑制前列腺癌腫瘤細胞生長之藥物組合物

本發明係有關於一種具有海葡萄萃取物的藥物組合物，與該藥物組合物用於抑制前列腺癌腫瘤細胞生長之用途，以及該海葡萄萃取物的萃取方法。

前列腺癌（Prostate cancer, PCa）是男性獨有的癌症，美國癌症協會估計2012年癌症新增病例將達163萬人，其中前列腺癌將新增241,740人。在男性病患當中，前列腺癌、肺癌及腸癌的新增病例就佔了所有新增癌症病例的5成，尤其是前列腺癌就佔了29%，排名第一，而因它所造成死亡的比率約9%，致死比率與大腸癌相同，排名僅次於肺癌，可見前列腺癌在男性健康的重要性。此外，根據我國衛生署統計，台灣男性罹患前列腺癌的人數由1981年的75名增加至2009年的937名，28年內增加12.5倍，同時依據2010年國內台大醫院官方統計，2010年男性罹患前列腺癌的人共有393位，佔該院罹癌人數的10.0%，罹癌人數僅低於肝癌的16.1%及肺癌的12.8%，顯示罹患此癌症的風險性有逐年增加的趨勢。

在臨床上，前列腺癌的治療通常使用放射線和外科手術治療，但是腫瘤若已經開始惡化擴散，則這種治療方式的預後情形將很不樂觀，因此，往往需要再搭配化學治療方式才有可能控制病情發展，然而化學治療方法所引起的毒性往往會破壞其他正常功能的細胞，而導致嚴重的副作用。

在前列腺癌的治療方式當中，除了上述的治療方式之外，另有賀爾蒙療法應用於此癌症的治療，利用手術切除分泌雄性賀爾蒙的腺體，或利用抗雄性賀爾蒙的藥物來阻斷雄性激素誘導前列腺癌的生長，此種藥物對於正常的非雄性激素敏感性正常細胞的影響十分有限，副作用甚小，因此，賀爾蒙療法是治療前列腺癌的首選，不過仍有部分病患會出現和爾蒙療法無效的情形。

目前前列腺癌賀爾蒙療法所使用的藥物多為氟塔醯胺（Flutamide）及可蘇多^® （Casodex），此二種藥物分別屬於類固醇及非類固醇藥物，其中非類固醇藥物可蘇多^® （Casodex）已被廣泛使用，並經化學修飾衍生許多新產品以降低其對人體的副作用，然而該些藥物多為人工化學合成，仍有安全上的顧慮。因此，目前越來越多專家學者從傳統中草藥中開發出許多具治療前列腺癌潛力的天然物，包括黃花蜜菜分離萃取物、柳杉分離萃取物及苦參萃取物等，雖然這些產物均由傳統中草藥提煉而成，但其安全性仍不如長久以來被歸納為食材的海藻。根據文獻指出海藻也具有抗腫瘤的生物特性，從海藻中萃取而得之多醣類及多酚類對於包括肝癌、血癌、乳癌、大腸癌及胃癌等在內的癌細胞生長具有不同程度的抑制作用。

以紫菜為例，即有研究指出紫菜萃取物[包含有β胡蘿蔔素（β-carotene）、葉綠素A（chlorophyllA）和葉黃素（lutein）]可有效降低致突變因子的作用。而且根據研究顯示紫菜可明顯減少由二乙基亞硝基胺（diethylnitrosamine﹐DEN）所引起的胎盤型麩胱甘肽轉移酶陽性灶（GST-P-positive foci）的數量和面積，且顯著增加鳥胺酸脫羧酶（ornithinedecarboxylase）活性，與降低亞精胺/精胺-乙醯基移轉酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase）活性，顯示紫菜具有預防由DEN所誘導的肝癌形成。另外，也有研究表示攝食紫菜（teneraP. ）後，會顯著降低大鼠腸道菌的酵素活性，包括偶氮還原酶（azoreductase）、硝酸還原酶（nitratereductase）、硝基還原酶（nitroreductase）和β-D-葡萄糖醛酸苷酶（β-D-glucuronidase）等酵素，此些酵素的活化被認為是與腸癌形成有關，因此，紫菜被認為是具有抗癌的功效。許多研究報導更顯示紫菜萃出物[硫脂（sulfolipids ）和紫菜多醣（porphyra）]可直接抑制腫瘤細胞的生長。例如Kwonand Nam (2006)，即指出紫菜多醣可透過第一型類胰島素生長因子受器（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）負向調節腫瘤細胞訊息傳遞，活化3號半胱天冬酶（caspase-3），進而促使胃癌AGS細胞進行凋亡（apoptosis）。

除紫菜外，亦有許多報告指出萃取自褐藻的多醣類具有抑制腫瘤增生的活性。如Ellouali etal. (1993) 指出萃取自泡葉藻（Ascophyllum nodosum ）的低分子量多醣在100 µg/mL的濃度下可以明顯抑制大腸癌Colo320DM細胞增生，達控制組之50％。Vishchuk et al. (2011)從海帶（Saccharina japonica ）及裙帶菜（Undaria pinnatifida ）等褐藻中萃取出含硫多醣，發現此些多醣可以有效抑制人類乳癌T-47D細胞及黑色素瘤SK-MEL-28細胞的生長，其有效劑量約為400-800µg/mL。Lins etal. (2009)將萃取自費氏環節藻[Champia feldmannii (Diaz-Pifferer) ]的含硫多醣，分別以10mg/kg及25 mg/kg的劑量餵食小鼠，發現其可以抑制小鼠腫瘤S-180細胞生長分別達48.62%及48.16%。綜合上述文獻顯示海藻確實具有應用於腫瘤治療或預防的潛力性。

又，海葡萄（Caulerpa lentillifera ）是一種綠藻，屬於綠藻植物門、羽藻綱、羽藻目、蕨藻科，主要分布於熱帶及部分溫帶海域，藻體可分為直立莖、匍匐莖及假根，直立莖長出許多圓球狀的小枝，外觀如同葡萄串般，故名『海葡萄』。根據研究指出萃取自海葡萄之寡醣（β-1,3-xylooligosaccharides）可以有效抑制人類乳癌MCF-7細胞生長，並誘使其進行細胞凋亡（Apoptosis）。另外，海葡萄多醣也被發現具有活化小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞的活性，透過活化NF-κB轉錄因子，使細胞合成誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）並分泌出一氧化氮（NO）活性氧分子，且具濃度依賴性，此外，海葡萄多醣也可刺激巨噬細胞產生IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞激素。

基於罹患前列腺癌症的風險性有逐年增加的趨勢下，相對代表抑制或治療前列腺癌細胞生長發展之藥物在全球市場價值也相當龐大，因此，本發明人有鑑於此，乃以思考及發明創作的意念，遂本著鍥而不捨得精神，積極不斷地加以研究開發，積極尋求一種可以抑制前列腺癌細胞生長發展的天然物產物。

本發明之主要目的，係提供一種本發明提供一種海葡萄（Caulerpa lentillifera ）萃取物的萃取方法，主要能從海葡萄藻體中提取出具有抑制前列腺癌細胞活性的天然萃取物，其可有效抑制雄性素刺激雄性激素依賴型前列腺癌LNCaP細胞的生長及產生前列腺特異性抗原（Prostate SpecificAntigen，PSA），也可有效抑制非雄性激素依賴型前列腺癌細胞22Rv1及PC-3癌細胞的生長與發展，並促使前列腺癌細胞進行凋亡作用，及減少前列腺癌細胞的遷徙能力。

本發明之另一主要目的，係進一步提供一藥物組合物，其包含該海葡萄天然萃取物之有效量。

本發明之又一主要目的，係更進一步提供一包含該海葡萄天然萃取物之有效量的藥物組合物係用於抑制前列腺癌腫瘤細胞生長之用途。

本發明之主要目的與功效，是由以下之具體技術手段所達成：

一種海葡萄萃取物的萃取方法，包含以下步驟：

(a)將生鮮的海葡萄（Caulerpa lentillifera ）風乾後粉碎，貯存於室溫避光環境；

(b)將步驟(a)之海葡萄以酒精溶劑進行粗萃取，以得到海葡萄粗萃取物；

(c)將步驟(b)之海葡萄粗萃取物溶於乙醇溶液，再與正己烷（Hexane）混合，並進行區分，得到乙醇溶液分離物；

(d)將步驟(c)得到之乙醇溶液分離物加入水稀釋；

(e)將步驟(d)稀釋得到之乙醇溶液分離物再加入乙酸乙酯（Ethyl acetate），並進行區分，得到乙酸乙酯分離物；

(f)收集步驟(e)得到之乙酸乙酯分離物，並進行減壓濃縮，以獲得海葡萄乙酸乙酯分離物；

(g)將步驟(f)之海葡萄乙酸乙酯分離物採用層析方法經膠體管柱進行分離物精製，即得機能性海葡萄天然物（名為Excaulerpa）。

如上所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(a)之海葡萄係粉碎至40目（mesh）以下之細度（粒徑小於0.38 mm）。

如上所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(b)係將步驟(a)之海葡萄原料以1：7～1：10的比例加入濃度為90％酒精溶液中。

如上所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(b)係將所得之粗萃取液在40℃以下進行減壓濃縮。

如上所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(c)之海葡萄粗萃取物以1：50～1：100之比率（w/v）溶於50％乙醇溶液。

如上所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，在步驟(c)中是將海葡萄粗萃取物以1：50～1：100之比率（w/v）溶於50％乙醇溶液之後，與等比例之正己烷（Hexane）混合。

如上所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(d)係加入50％乙醇溶液分離物體積比例之水稀釋。

如上所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(f)係在40℃以下進行減壓濃縮。

如上所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(g)之層析方法係以1 L的水／乙醇作為移動相，濃度梯度由80：20、60：40、40：60、20：80到0：100（水：乙醇），收集每一梯度的沖提液，並進行減壓濃縮，其中20：80（水：乙醇）移動相所沖提下來之分層物即為機能性海葡萄天然物。

一種藥物組合物，其包含如上所述之海葡萄天然萃取物有效含量。

一種用於抑制前列腺癌腫瘤細胞生長之用途的藥物組合物，其包含如上所述之海葡萄天然萃取物有效含量。

為令本發明所運用之技術內容、發明目的及其達成之功效有更完整且清楚的揭露，茲於下詳細說明之，並請一併參閱所揭之圖式及圖號：

本發明所提供之方法如下。

海葡萄原料前處理

將生鮮的海葡萄（Caulerpa lentillifera ）風乾後，粉碎至40目（mesh）以下之細度（粒徑小於0.38 mm），裝袋貯存於室溫避光環境。

海葡萄粗萃取物製備

請參看第一圖，將海葡萄原料以1：7～1：10的比例加入90％酒精溶液，每天攪動2～4次，2天後進行過濾收集酒精粗萃取液。每批海葡萄原料可進行2～3次萃取，所得之粗萃取液在40℃以下的溫度進行減壓濃縮，所得之濃縮物即為海葡萄粗萃取物。

海葡萄天然萃取物（ Excaulerpa ）製備

如第一圖所示，將海葡萄粗萃取物以1：50～1：100之比率（w/v）溶於50％乙醇溶液。接著，與等比例之正己烷（Hexane）混合，進行區分，所得之乙醇溶液分離物再重複3次區分，之後，加入50％乙醇溶液分離物體積比例之水，將稀釋後的乙醇溶液分離物再加入等體積乙酸乙酯（Ethyl acetate），進行區分，所得之乙醇溶液分離物再重複3次區分，收集乙酸乙酯分離物，進行減壓濃縮（40℃以下），可獲得海葡萄乙酸乙酯分離物。將海葡萄乙酸乙酯分離物採用層析方法經膠體管柱進行分離物精製，以1 L的水/乙醇作為移動相，濃度梯度由80：20、60：40、40：60、20：80到0：100（水：乙醇），收集每一梯度的沖提液，並進行減壓濃縮，其中20：80（水：乙醇）移動相所沖提下來之分層物即為海葡萄天然萃取物（名為Excaulerpa）。

實施例 1 ：海葡萄天然萃取物（ Excaulerpa ）對男性賀爾蒙誘導前列腺癌細胞產生 PSA 之影響

本發明以抑制22Rv1前列腺癌細胞產生PSA作為指標，從海葡萄藻類中篩選出具有抑制前列腺癌細胞活性之海葡萄天然萃取物（Excaulerpa），分析此海葡萄天然萃取物對男性賀爾蒙（Androgen）誘導LNCaP及22Rv1等前列腺癌細胞產生PSA之情形。

分別將5×10⁴ cells/well之LNCaP及22Rv1前列腺癌細胞以置於96孔培養盤，內含有5％的活性炭/葡聚糖所處理的胎牛血清（charcoal-coateddextran-stripped FBS）之RPMI 1640培養基，於培養箱培養1天後，置換成新的培養基，並加入10 nM5α二氫睪固酮（5α-dihydrotestosterone）及欲分析的樣品，再培養1天。收集細胞上清液，以市售PSA酵素結合免疫吸附分析套組（PSA ELISA kit）進行PSA定量分析，另外，細胞部分則以100 μL裂解緩衝液（Lysis buffer）將細胞裂解，並運用改良式Lowry 蛋白質分析法（DC蛋白質分析法）進行蛋白定量，以固定細胞蛋白量校正PSA之含量。結果如第二圖所示，海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可以有效抑制5α二氫睪固酮刺激前列腺癌LNCaP及22Rv1細胞分泌PSA，且具有濃度依存性，尤其是在LNCaP癌細胞方面，其IC50 < 1 μg/mL，而在22Rv1癌細胞部分，其IC50落於1～10 μg/mL，顯示海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可以有效抑制由男性賀爾蒙（如5α二氫睪固酮）所活化的前列腺癌細胞活性。

實施例 2 ：海葡萄天然萃取物（ Excaulerpa ）對前列腺癌細胞生長之影響

本發明進一步分析海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對不同類型前列腺癌細胞生存發展之影響，所選用之前列腺癌細胞株包含有LNCaP、22Rv1及PC-3等，可區分為雄性激素依賴型及非雄性激素依賴型。LNCaP癌細胞是屬於雄性激素依賴型的前列腺癌細胞，只要缺乏雄性激素的刺激，其生長即會受到影響。22Rv1癌細胞屬於非雄性激素依賴型的前列腺癌細胞，由於其雄性激素受器（Androgen receptor，AR）發生突變，導致就算雄性激素不存在的情形下，仍然可以持續活化，維持前列腺癌細胞的生理機能。PC-3癌細胞同屬非雄性激素依賴型的前列腺癌細胞，然其本身缺乏雄性激素受器（AR），可說是完全不受雄性激素所影響，且近來的研究指出其具有癌幹細胞的特性。

首先，採用噻唑藍（MTT）法分析海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對不同類型前列腺癌細胞存活能力之影響，噻唑藍法為一種活細胞染色法，其原理乃利用細胞粒線體中的琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase）將噻唑藍的四唑（tetrazolium）環切斷，形成甲臢（formazan），使黃色的噻唑藍便為深藍色，利用生成顏色的深淺藉以瞭解細胞生長的情形。此方法步驟如下：取不同濃度的海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）（0.5、5、12.5、25、50 μg/mL）與1×10⁵ cells/mL前列腺癌細胞共同於37^Co 下，5% CO₂ 的培養箱中培養48 hr。而後以100 μL/well量加入噻唑藍（1 mg/mL），於37^o C反應2 hr後，移除上清液，並加入200 μL/well的二甲基亞碸（DMSO），震盪2 min，偵測570 nm吸光值。結果如第三圖所示，LNCaP癌細胞對海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）較為敏感，隨著海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）濃度的增加，其抑制癌細胞增生的效果也隨之增大，在50.0 μg/mL時，其細胞增生能力僅為控制組之24.4±1.6%，海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對於LNCaP癌細胞的IC50落在5.0～12.5 μg/mL之間。22Rv1癌細胞對海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）較有抗性（resistant），濃度12.5 μg/mL以下的海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對於22Rv1癌細胞的生長並無顯著的影響，當濃度增加為25.0 μg/mL和50.0 μg/mL時，海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可抑制22Rv1細胞增生分別達控制組之71.3±2.4%和58.1±4.1%。至於PC-3癌細胞方面，則顯示5.0 μg/mL濃度之海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）即可有效抑制PC-3癌細胞的增生活性達控制組之65.1±1.7%，但是隨著海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）濃度增加到50.0 μg/mL時，其抑制效果卻仍維持在44.9±0.5%，顯示其似乎無法完全抑制PC-3癌細胞的增生活性。綜合上述分析結果，顯示海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可以有效抑制前列腺癌細胞的生存活性，其效果會隨著前列腺癌細胞特性不同而有所差異，其中以雄性激素依賴型之LNCaP前列腺癌細胞最為敏感，對於具有癌幹細胞特性的PC-3前列腺癌細胞似乎仍然無法完全抑制其存活性。

接著，以形成新癌细胞聚落（Colony forming） 的能力觀察海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對不同類型前列腺癌細胞生長發展之影響，形成新癌细胞聚落分析法是一種用來檢測細胞聚落形成發展能力的分析，對於癌細胞而言，其可以反應單一個癌細胞發展成為腫瘤的過程，模擬癌細胞擴散出去後發展出另一腫瘤個體的能力，也可以反應癌細胞分裂的能力。此分析法乃將2×10⁴ cells/mL前列腺癌細胞接種於24孔盤，於37^Co 下、5% CO₂ 的培養箱中培養24 hr後，更換含有不同濃度海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）（0.01、0.1、0.5、1、5、10、25 μg/mL）之培養基，於37^o C、5％ 二氧化碳（CO₂ ）培養箱中持續進行培養，並於每2天更新測試樣品之培養基，連續培養12天後，移除培養基，並以1% 戊二醛（glutaldehyde）進行固定細胞，再以0.1%結晶紫進行染色，以去離子水洗淨後，陰乾，進行照相。隨後以20% 乙酸（Acetic acid）溶解色素，並偵測其595吸光值。其結果如第四圖所示，0.50 μg/mL的海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可明顯降低LNCaP和PC-3癌細胞形成聚落的能力，當海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）濃度提升到1.00 μg/mL時，則可以顯著抑制22Rv1癌細胞形成聚落的能力，顯示3種前列腺癌細胞的發展對海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）抗性不盡相同，雄性激素依賴型的LNCaP及缺乏雄性激素受器（AR）的PC-3前列腺癌細胞對於海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）較為敏感。當濃度增加至1.00 μg/mL時，海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可抑制LNCaP癌細胞發展達控制組之10.8±1.5%，繼續增加海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）濃度超過5.00 μg/mL時，LNCaP癌細胞的聚落形成程度僅不到控制組之2.0%［第四圖（A）］，顯示海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對於雄性激素依賴型的LNCaP前列腺癌細胞的發展具有良好抑制效果。另外，當濃度增加至1.00 μg/mL時，海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）雖然可抑制PC-3癌細胞發展達控制組之7.9±0.9%，但繼續增加海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）濃度達25.00 μg/mL時，PC-3癌細胞的聚落形成程度仍有控制組之2.8±0.2%［第四圖（C）］，顯示仍有極少數的癌細胞可以承受海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）的作用，仍然存活著，此現象推測與PC-3細胞具有癌幹細胞特性有關。在雄性激素受器（AR）突變的22Rv1前列腺癌細胞方面，則顯示高度活化的雄性激素受器（AR）活性可以增加癌細胞對海藻天然物的耐受性，然而當海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）的濃度增加至5.00 μg/mL時，海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可抑制22Rv1癌細胞發展達控制組之6.4±0.6%，繼續增加海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）濃度超過25.00 μg/mL時，22Rv1癌細胞的聚落形成程度僅不到控制組之0.9±0.4%［第四圖（B）］。綜合上述結果，顯示海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對於前列腺癌細胞的發展具有良好的抑制效果。

實施例 3 ：海葡萄天然萃取物（ Excaulerpa ）對前列腺癌細胞進行細胞凋亡之影響

在生物體中，細胞的死亡大致上可以分為壞死（Necrosis）及凋亡（Apoptosis），壞死的細胞往往會引起嚴重的發炎反應，而凋亡的現象卻是一種在基因調控下的計畫性死亡，因此，並不會對生物體產生額外的發炎損傷。在細胞凋亡中，粒線體扮演十分重要的角色，當粒線體因氧化壓力增加、Ca²⁺ 累積或粒線體膜電位降低時，會增加粒線體膜的通透性，進而釋出細胞色素c（cytochrome c）、第二個粒線體來源之半胱天冬酶激活劑/低等電點凋亡抑制蛋白直接結合蛋白（secondmitochondria-derived activator of caspases/direct IAPbinding protein, Smac/Diablo）, 凋亡誘導因子（apoptosis inducingfactor, AIF）和粒線體內切核酸酶G（endonuclease G）等致死蛋白，並誘發下游半胱天冬酶（caspases）等一連串反應，而使細胞進行細胞凋亡。因此，本發明利用羅丹明123（Rhodamine 123）螢光染劑分析海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對前列腺癌細胞中粒線體膜通透性的影響，此分析法乃將2×10⁵ cells/mL前列腺癌細胞接種於6孔盤，於37^Co 下、5%二氧化碳（CO₂ ）的培養箱中培養24 hr後，更換含有不同濃度海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）（1、10、25、50 μg/mL）之培養基，於37^o C、5％二氧化碳（CO₂ ）培養箱中繼續培養24 hr後，加入10 μM羅丹明123染劑，並反應30 min，以流式細胞儀進行分析。結果如第五圖所示，羅丹明123染劑的陰性表示細胞粒線體膜通透性的增加，因此，1 μg/mL之海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）即可引起4.73±0.68%的LNCaP前列腺癌細胞喪失粒線體膜功能，明顯高於控制組之2.83±0.67%，其效果具有濃度依存性，當海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）濃度提升至50 μg/mL時，其可引起24.63±2.46%的LNCaP前列腺癌細胞喪失粒線體膜功能［第五圖（A）］。相類似的結果也可在22Rv1及PC-3癌細胞株中發現，其在50 μg/mL濃度時，海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可分別促使12.43±0.81%的22Rv1前列腺癌細胞及23.33±2.18%的PC-3前列腺癌細胞喪失粒線體膜功能［第五圖（B）及（C）］。

當前列腺癌細胞粒線體膜功能遭受海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）破壞，是否會進一步引起細胞凋亡，本發明將採用膜聯蛋白V-碘化丙啶 [AnnexinV - Propidine iodide（PI）]雙染色法進行確認，膜聯蛋白V（Annexin V）是一種分子量為35～36 kDa的Ca²⁺ 依賴性磷脂結合蛋白，其與磷脂醯絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）具有高度親合性，磷脂醯絲氨酸（PS）正常位於細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，磷脂醯絲氨酸（PS）可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，而使膜聯蛋白V（Annexin V） 得與細胞膜外之磷脂醯絲氨酸進行結合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在細胞死亡後，碘化丙啶（PI）能夠透過細胞膜而使細胞核染上紅色。因此將膜聯蛋白V（Annexin V）與碘化丙啶（PI）搭配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。在本研究中，發現海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對於所有類型之前列腺癌細胞均有誘導其進行細胞凋亡的現象（第六圖），尤其是在雄性激素依賴型LNCaP前列腺癌細胞中，10 μg/mL之海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可有效造成19.65±1.23%的細胞凋亡，隨濃度的增加，其效果也隨之增加，最高可以造成27.49±1.13%細胞進行凋亡作用［第六圖（A）］。相似的結果也在雄性激素受器（AR）突變的22Rv1及缺乏雄性激素受器（AR）的PC-3前列腺癌細胞中發現，其最高可以分別造成14.19±1.07%［第六圖（B）］和16.03±1.06%［第六圖（C）］的細胞凋亡，且同樣具有濃度依存性。綜合上述結果，顯示海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可以明顯破壞前列腺癌細胞的粒線體膜功能，並有效誘使不同類型之前列腺癌細胞進行細胞凋亡。

實施例 4 ：海葡萄天然萃取物（ Excaulerpa ）對前列腺癌細胞遷移現象之影響

數種類的癌細胞轉移可透過血管或淋巴管遷徙（migration）或入侵（invasion）到鄰近的組織器官，具侵襲性的癌細胞具有高度遷徙型態，伴隨表現多種細胞移動能力的基因，此些基因表現可以使得癌細胞改變微環境，使環境更適合癌細胞的發展，因此，若能有效控制癌細胞的遷徙能力，就可以控制癌症的轉移，防止病情的惡化。在本發明中，運用傷口癒合方法分析不同類型前列腺癌細胞的遷徙活性，藉以評估海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對前列腺癌細胞轉移能力的影響。運用市售培養內嵌皿（Culture-Insert）於培養盤中創造出500 μm寬度的缺口，再以不同濃度之海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）處理前列腺癌細胞，觀察其對不同類型的前列腺癌細胞遷徙能力的影響。結果如第七圖所示，培養48 hr的雄性激素依賴型的LNCaP前列腺癌細胞具有許多突觸和偽足，且擁有極佳的遷徙能力，可將500 μm的缺口密合，經過0.5 μg/mL的海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）處理該癌細胞後，其缺口密合度減少，隨海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）濃度的增加，LNCaP前列腺癌細胞的遷徙能力更是明顯降低，甚至使LNCaP前列腺癌細胞之突觸及偽足減少，最終而抑制LNCaP前列腺癌細胞的遷徙活性［第七圖（A）］。相類似的結果也在雄性激素受器（AR）突變的22Rv1前列腺癌細胞中發現，顯示海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）可以有效抑制22Rv1前列腺癌細胞遷徙，且具有濃度依存性［第七圖（B）］。在缺乏雄性激素受器（AR）的PC-3前列腺癌細胞方面，該癌細胞的遷徙方式不像其他兩株細胞藉由突觸及偽足進行移動，而是先脫離附著，飄移至空隙處，再定著生長，因此其擴散的速度較其他兩株癌細胞為快速。在培養24 hr後即進行觀察，結果如第七圖（C）所示，PC-3前列腺癌細胞在未經海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）樣品處理時，其500 μm的缺口已有明顯縮密，隨海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）處理濃度的增加，其缺口密合度隨之減少，顯示海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）不僅可以有效抑制LNCaP及22Rv1前列腺癌細胞的遷徙能力，也可以有效抑制PC-3前列腺癌細胞的遷徙活性。綜合上述結果，顯示海葡萄天然萃取物（Excaulerpa）對於前列腺癌細胞的遷徙轉移具有良好的抑制效果。

以上所舉者僅係本發明之部份實施例，並非用以限制本發明，致依本發明之創意精神及特徵，稍加變化修飾而成者，亦應包括在本專利範圍之內。

綜上所述，本發明實施例確能達到所預期之使用功效，又其所揭露之具體技術手段，不僅未曾見諸於同類產品中，亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求，爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

無

第一圖：本發明之海葡萄天然萃取物的製備流程圖

第二圖：本發明之海葡萄天然萃取物對LNCaP及22Rv1前列腺癌細胞分泌前列腺特異性抗原（PSA）之影響的柱狀圖

第三圖（A）：本發明之海葡萄天然萃取物對LNCaP前列腺癌細胞增生之影響的柱狀圖

第三圖（B）：本發明之海葡萄天然萃取物對22Rv1前列腺癌細胞增生之影響的柱狀圖

第三圖（C）：本發明之海葡萄天然萃取物對PC-3前列腺癌細胞增生之影響的柱狀圖

第四圖（A）：本發明之海葡萄天然萃取物對LNCaP前列腺癌細胞發展成聚落之影響的試驗培養皿與柱狀圖

第四圖（B）：本發明之海葡萄天然萃取物對22Rv1前列腺癌細胞發展成聚落之影響的試驗培養皿與柱狀圖

第四圖（C）：本發明之海葡萄天然萃取物對PC-3前列腺癌細胞發展成聚落之影響的試驗培養皿與柱狀圖

第五圖（A）：本發明之海葡萄天然萃取物對LNCaP前列腺癌細胞粒線體膜電位之影響的柱狀圖

第五圖（B）：本發明之海葡萄天然萃取物對22Rv1前列腺癌細胞粒線體膜電位之影響的柱狀圖

第五圖（C）：本發明之海葡萄天然萃取物對PC-3前列腺癌細胞粒線體膜電位之影響的柱狀圖

第六圖（A）：本發明之海葡萄天然萃取物對LNCaP前列腺癌細胞凋亡之影響的柱狀圖

第六圖（B）：本發明之海葡萄天然萃取物對22Rv1前列腺癌細胞凋亡之影響的柱狀圖

第六圖（C）：本發明之海葡萄天然萃取物對PC-3前列腺癌細胞凋亡之影響的柱狀圖

第七圖（A）：本發明之海葡萄天然萃取物對LNCaP前列腺癌細胞轉移（擴散）能力之影響的影像記錄圖

第七圖（B）：本發明之海葡萄天然萃取物對22Rv1前列腺癌細胞轉移（擴散）能力之影響的影像記錄圖

第七圖（C）：本發明之海葡萄天然萃取物對PC-3前列腺癌細胞轉移（擴散）能力之影響的影像記錄圖

：無

Claims (10)

1. 一種海葡萄萃取物的萃取方法，包含以下步驟：(a)將生鮮的海葡萄（Caulerpa lentillifera ）風乾後粉碎，貯存於室溫避光環境；(b)將步驟(a)之海葡萄以酒精溶劑進行粗萃取，以得到海葡萄粗萃取物；(c)將步驟(b)之海葡萄粗萃取物溶於乙醇溶液，再與正己烷（Hexane）混合，並進行區分，得到乙醇溶液分離物；(d)將步驟(c)得到之乙醇溶液分離物加入水稀釋；(e)將步驟(d)稀釋得到之乙醇溶液分離物再加入乙酸乙酯（Ethyl acetate），並進行區分，得到乙酸乙酯分離物；(f)收集步驟(e)得到之乙酸乙酯分離物，並進行減壓濃縮，以獲得海葡萄乙酸乙酯分離物；(g)將步驟(f)之海葡萄乙酸乙酯分離物採用層析方法經膠體管柱進行分離物精製，即得機能性海葡萄天然物（名為Excaulerpa）。
2. 如申請專利範圍第1項所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(a)之海葡萄係粉碎至40目（mesh）以下之細度（粒徑小於0.38 mm）。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(b)係將步驟(a)之海葡萄原料以1：7～1：10的比例加入濃度為90％酒精溶液中。
4. 如申請專利範圍第3項所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(b)係將所得之粗萃取液在40℃以下進行減壓濃縮。
5. 如申請專利範圍第1項所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(c)之海葡萄粗萃取物以1：50～1：100之比率（w/v）溶於50％乙醇溶液。
6. 如申請專利範圍第5項所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，在步驟(c)中是將海葡萄粗萃取物以1：50～1：100之比率（w/v）溶於50％乙醇溶液之後，與等比例之正己烷（Hexane）混合。
7. 如申請專利範圍第1項所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(d)係加入50％乙醇溶液分離物體積比例之水稀釋。
8. 如申請專利範圍第1項所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(f)係在40℃以下進行減壓濃縮。
9. 如申請專利範圍第1項所述之海葡萄萃取物的萃取方法，其中，步驟(g)之層析方法係以1 L的水／乙醇作為移動相，濃度梯度由80：20、60：40、40：60、20：80到0：100（水：乙醇），收集每一梯度的沖提液，並進行減壓濃縮，其中20：80（水：乙醇）移動相所沖提下來之分層物即為機能性海葡萄天然物。
10. 一種用於抑制前列腺癌腫瘤細胞生長之用途的藥物組合物，其包含如申請專利範圍第1至9項中任意一項所述之海葡萄天然萃取物有效含量。