TWI790760B

TWI790760B - 海葡萄萃取物用於製備促進皮膚抗發炎、抗氧化及抗癌組合物之用途

Info

Publication number: TWI790760B
Application number: TW110135873A
Authority: TW
Inventors: 黃世鐘; 張芳榮; 王惠君; 陳瑩容; 蔡逸宏; 彭百煒; 柯雅甄; 謝居璋
Original assignee: 南六企業股份有限公司
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2023-01-21
Also published as: TW202313080A

Abstract

一種海葡萄萃取物用於製備皮膚抗發炎、抗癌組合物之用途，係將一有效劑量投予至所需個體，以達到皮膚抗發炎或抗癌之功效，該海葡萄萃取物之製備方法包括：將海葡萄Caulerpa lentillifera洗淨後，冷壓該海葡萄以獲得海葡萄汁；海葡萄汁通過濾網獲得海葡萄濾液及海葡萄濾渣；取該海葡萄濾渣，浸泡乙醇中獲得乙醇濾渣混合物，以濾網過濾乙醇濾渣混合物，獲得乙醇濾液；抽乾乙醇濾液，獲得海葡萄萃取物。

Description

海葡萄萃取物用於製備促進皮膚抗發炎、抗氧化及抗癌組合物之用途

本發明係關於一種海葡萄萃取物，特別指一種可以促進抗發炎、抗癌之海葡萄萃取物，及其製備方法和應用。

長莖葡萄蕨藻(Caulerpa Lentillifera)，俗名海葡萄(Sea grape)，為一種原生於熱帶及亞熱帶水域的綠藻；其主要生長於潮間帶，為抵抗潮水漲退，而發展出係長鬚狀的「假根」以固定藻體於海床上；此外，藻體還包括「直立莖」及「匍匐莖」兩個主要部分；直立莖係其種類的辨識依據之一，具有如葉狀、羽狀、鋸齒狀、絨毛狀及球狀等不同型態；匍匐莖則係平滑的圓柱型，以對稱或輻射等方式向外生長蔓延。

目前海葡萄的主要生產地分布於菲律賓、馬來西亞、日本沖繩縣，其具備量產技術而成為市場上的主力供應端；近年，在澎湖成功培育了海葡萄的藻種，並且實現了量產的養殖技術，未來將進軍海葡萄市場；海葡萄含有相當豐富的海藻多醣體，且零脂防、熱量相當的低，是生產保健食品相當優良的天然素材。此外，海葡萄萃取液所具備的大量微量元素，已證實有促進抗衰老的效果，在世界化粧品協會中列入了合法使用的化粧品原料，是具有相當市場潛力的。

按，台灣專利I558408，該發明涉及一種具抑制過敏之海葡萄萃取物，其製備方法及應用。其製備方法，包括以下步驟：海葡萄和純水以重量比為1：1~20，進行打漿並混合均勻，於溫度20~100℃下攪拌30~120分鐘，第一次過濾所得液體即為海葡萄萃取液，海葡萄萃取液可進一步進行第二次過濾，以EW、PW、DK薄膜過濾後經乾燥得到海葡萄精萃物；該發明宣稱具有優異的抑制過敏效果，且本身不引起過敏反應，可應用於化妝品與食品，然而純水打漿的方式並不能有效地分離出海葡萄萃取液中的特定有效成分，其應用層面較為限縮。

按，台灣專利號I592161，該專利提供一種長莖蕨藻之萃取物包含一多醣體及一類黃酮素，而該多醣體及類黃酮素萃取自一長莖蕨藻體，且該類黃酮素具有抗發炎能力、抗菌能力及抗氧化能力。一種長莖蕨藻之類黃酮萃取方法包含：提供一長莖蕨藻體添加於一溶液；將該長莖蕨藻體於該溶液進行粉碎處理，以獲得一長莖蕨藻溶液；將該長莖蕨藻溶液進行熱水萃取處理，以獲得一長莖蕨藻萃取液；將該長莖蕨藻萃取液進行過濾處理，以獲得一已過濾長莖蕨藻萃取液；將該已過濾長莖蕨藻萃取液進行分離處理，以獲得一含類黃酮萃取液。其係以熱水進行海葡萄萃取並取得一含類黃酮萃取液，但在熱水高溫萃取下，容易破壞海葡萄萃取液中含有之營養素及有效成分。

按，台灣專利號M486428，揭示了一種具促進肌膚保濕、美白的海葡萄萃取物之微粒結構，其包含：一含海葡萄萃取物之活性核心層；及一保護層，其包覆該保濕層之外層，而含有海葡萄萃取物的微粒結構易於被腸道所吸收，進而具有美白及/或有效提升肌膚的保水度；然而，此專利利用低溫超音波裝置萃取海葡萄，並在濃縮、過篩後滅菌以獲取萃取物，雖然在前端以低溫超音波萃取能保留多數海葡萄之活性成分，但後端採用的滅菌方式，則有高溫破壞活性成分的風險。

為解決上述問題，本發明之一目的提供一種海葡萄萃取物用於製備皮膚抗發炎、抗癌組合物之用途，係將一有效劑量投予至所需個體，以達到皮膚抗發炎或抗癌之功效。

在一些實施例中，該海葡萄萃取物之製備方法包括：將海葡萄Caulerpa lentillifera洗淨後，冷壓該海葡萄以獲得一海葡萄汁；該海葡萄汁通過一濾網，以獲得一海葡萄濾液CLJ及一海葡萄濾渣CLD；取該海葡萄濾渣CLD，於20~30℃浸泡於85~100%乙醇中獲得一乙醇濾渣混合物，並浸泡18~30小時；及該乙醇濾渣混合物通過濾網，以獲得一乙醇濾液；抽乾該乙醇濾液，獲得一海葡萄萃取液CLJ-5，其中，該冷壓步驟係以施以9000~11000kg/m²壓力，持續壓榨該海葡萄60~80小時，該濾網孔徑介於3~9μm。

在一些實施例中，該組合物進一步包括一海葡萄己烷萃取物，該海葡萄己烷萃取物的製備方法包括：取該海葡萄萃取液CLJ-5，於20~30℃加入乙醇-己烷水溶液；進行分配萃取18~30小時，以獲得一己烷萃取層及一乙醇萃取層；及收集該己烷萃取層以獲得一海葡萄己烷萃取物CLJ-5H，其中，該乙醇-己烷水溶液體積配比分別為乙醇1~5份，己烷0.5~2份，水1.5~6.5份。

在一些實施例中，該組合物進一步包括一海葡萄乙醇萃取物，該海葡萄乙醇萃取物的製備方法包括：取該海葡萄萃取液CLJ-5，於20~30℃加入乙醇-己烷水溶液；進行分配萃取18~30小時，以獲得一己烷萃取層及一乙醇萃取層；及收集該乙醇萃取層以獲得一海葡萄乙醇萃取物CLJ-5Et，其中，該乙醇-己烷水溶液體積配比分別為乙醇1~5份，己烷0.5~2份，水1.5~6.5份。

在一些實施例中，該組合物進一步包括一海葡萄水萃取物，該海葡萄水萃取物的製備方法包括：取該海葡萄濾液CLJ，於20~30℃下加入85~100%乙醇；分配萃取18~30小時，以獲得一水層及一乙醇沉澱物層；及收集該水層為一海葡萄濾液水萃取物CLJ-1，其中，該海葡萄濾液CLJ與該85~100%乙醇之比例為0.5：1~1.5：1。

在一些實施例中，該組合物進一步包括一海葡萄乙醇沉澱萃取物，該海葡萄乙醇沉澱萃取物的製備方法包括：取該海葡萄濾液CLJ，於20~30℃下加入85~100%乙醇；分配萃取18~30小時，以獲得一水層及一乙醇沉澱物層；及收集該乙醇沉澱物層為一海葡萄濾液乙醇沉澱萃取物CLJ-2，其中，該海葡萄濾液CLJ與該85~100%乙醇之比例為0.5：1~1.5：1。

如前所述之用途，其中，該有效劑量為5~50μg/mL。

本發明所提供的海葡萄萃取物用於製備皮膚抗發炎、抗癌組合物之用途，具備有以下幾種功效：

1.本發明所提供之組合物，其萃取方式能完整萃取出海葡萄所含之活性成分，且過程均在低溫中進行，避免了溫度變化對活性成分的破壞。

2.本發明所提供之組合物能促進皮膚細胞NF-kB之活性，以提升皮膚細胞的抗發炎反應能力，並具有提升細胞免疫之功效。

3.本發明所提供之組合物能促進Smad活性，並可與TGFβ共同作用，以提升細胞的抗癌化能力。

4.本發明所提供之組合物具有促進皮膚細胞Nrf2活化基因之抗氧化活性，對於皮膚細胞具有提升抗氧化之功效，能進一步達到抗皺及減緩老化之效果。

5.本發明所提供之組合物具有抑制紫外線UV所誘導之皮膚細胞MMP-1或MMP-3表現量之能力，降低皮膚細胞膠原蛋白分解流失，達到減緩皮膚細胞老化及保持皮膚細胞活性之效果。

(S1至S5:步驟)

(S6至S12:步驟)

(S13至S15:步驟)

圖1係說明海葡萄萃取物之製備方法流程圖。

圖2係說明海葡萄乾燥物、海葡萄水萃取物及海葡萄沉澱萃取物萃取之流程圖。

圖3係說明海葡萄萃取液進行乙醇-己烷水溶液分配萃取之流程圖。

圖4係本發明所製備之組合物促進NF-κB活性之直方圖。

圖5係本發明所製備之組合物與TNFα共同促進NF-κB活性之直方圖。

圖6係本發明所製備之組合物促進Smad活性之直方圖。

圖7係本發明所製備之組合物與TGFβ共同促進Smad活性之直方圖。

圖8係本發明所製備之組合物促進Nrf2活性之直方圖。

圖9係本發明所製備之組合物對於人類纖維母細胞CCD966SK內MMP-1或MMP-3於UVB誘導下其表現量之西方墨點分析。

圖10係本發明所提供CLJ-5針對人類纖維母細胞CCD966SK之MMP-1及MMP-3之西方墨點分析。

圖11係本發明所提供海葡萄乾燥物CLJP針對人類纖維母細胞CCD966SK之MMP-1及MMP-3之西方墨點分析。

本發明之一實施方式係一種海葡萄萃取物之用途，係將海葡萄萃取物用於製備皮膚抗發炎、抗癌組合物之用途，其係將一有效劑量投予至所需個體，以達到皮膚抗發炎或抗癌之功效。

請參閱圖1，係說明該海葡萄萃取物之製備方法流程圖；該海葡萄萃取物之製備方法包括：S1)將海葡萄Caulerpa lentillifera洗淨後，冷壓該海葡萄以獲得一海葡萄汁；S2)該海葡萄汁通過一濾網，以獲得一海葡萄濾液CLJ及一海葡萄濾渣CLD；S3)取該海葡萄濾渣CLD，於20~30℃浸泡於85~100%乙醇中獲得一乙醇濾渣混合物，並浸泡18~30小時；S4)該乙醇濾渣混合物通過濾網，以獲得一乙醇濾液；及S5)抽乾該乙醇濾液，獲得一海葡萄萃取液CLJ-5，其中，該冷壓步驟係以施以9000~11000kgf/m²壓力，持續壓榨該海葡萄60~80小時，該濾網孔徑介於3~9μm。

在一些實施例中，該冷壓步驟係使用直壓式榨油機，將海葡萄洗淨後置入直壓式榨油機，調整壓力至10000~10500kgf/m²壓力，持續壓榨該海葡萄72小時以獲得該海葡萄汁；該濾網孔徑為6μm。

在一些實施例中，為使海葡萄濾液CLJ在後端應用中，能充分保持其活性，該海葡萄濾液CLJ進一步經過防腐處理，該防腐處理步驟包括：S2-1)混合該海葡萄濾液CLJ及一防腐劑，獲得一海葡萄濾液混合物；S2-2)離心該海葡萄濾液混合物；及S2-3)取其上清液，獲得一澄清之海葡萄保存液，其中，該防腐劑包括對羥基苯乙酮(Hydroxyacetophenone)、生育酚乙酸酯(Tocopheryl Acetate)、苯氧乙醇(Phenoxyethanol)、苯甲醇、對羥基苯甲酸(parabens)、苯扎氯銨、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或氯丁醇，但不限於此。

在另一些實施例中，該組合物進一步包括一海葡萄乾燥物，請參閱圖2，該海葡萄乾燥物之製備方法包括：S6)抽乾該海葡萄濾液CLJ，以獲得該海葡萄乾燥物CLJP。

該海葡萄濾液CLJ可通過冷凍乾燥或噴霧乾燥方法形成該海葡萄乾燥物CLJP；所述冷凍乾燥係藉由降低材料周圍壓力，同時降溫使得材料中冷凍水由固相直接昇華為氣體的乾燥方法；所述噴霧乾燥係通過加熱空氣快速乾燥，適用於熱敏性材料或產生顆粒大小一致之材料，空氣是加熱的干燥介質，利用霧化器或噴嘴控制液體或漿料分散的液滴尺寸，來達到控制乾燥物顆粒大小的目的；在本實施方式中，並不限於上述乾燥方法；在一些較佳實施例中，為完整保留該海葡萄濾液CLJ中活性成分，採用冷凍乾燥方法加工該海葡萄濾液CLJ以形成該海葡萄乾燥物CLJP。

在另一些實施例中，該組合物進一步包括一海葡萄水萃取物，請繼續參閱圖2，該海葡萄水萃取物之製備方法包括：S7)取該海葡萄濾液CLJ，於20~30℃下加入85~100%乙醇進行分配萃取；S8)分配萃取後，獲得一水層及一沉澱物層；及S9)收集水層以獲得一海葡萄水萃取物CLJ-1；較佳者，該海葡萄濾液CLJ與該85~100%乙醇之體積比例為0.5：1~1.5：1；更佳者，於該海葡萄濾液CLJ加入95%乙醇，該體積比例為1：1。

在一些實施例中，該組合物進一步包括一海葡萄沉澱萃取物，請繼續參閱圖2，該海葡萄沉澱萃取物的製備方法包括：S10)取該海葡萄濾液CLJ，於20~30℃下加入85~100%乙醇進行分配萃取； S11)分配萃取後，獲得一水層及一沉澱物層；及S12)收集沉澱物層以獲得一海葡萄沉澱萃取物CLJ-2；較佳者，該海葡萄濾液CLJ與該85~100%乙醇之體積比例為0.5：1~1.5：1；更佳者，於該海葡萄濾液CLJ加入95%乙醇，該體積比例為1：1。

在一些實施例裡，該組合物進一步包括一海葡萄己烷萃取物或一海葡萄乙醇萃取物，請參閱圖3，係海葡萄萃取物CLJ-5進行乙醇-己烷水溶液分配萃取之流程圖，該海葡萄萃取物CLJ-5之乙醇-己烷水溶液分配萃取方法包括：S13)取該海葡萄萃取物CLJ-5，於20~30℃加入乙醇-己烷水溶液，進行分配萃取18~30小時，以獲得一己烷萃取層及一乙醇萃取層；及S14)收集該己烷萃取層以獲得一海葡萄己烷萃取物CLJ-5H；S15)收集該乙醇萃取層以獲得一海葡萄乙醇萃取物CLJ-5Et，其中，該乙醇-己烷水溶液體積配比分別為乙醇1~5份，己烷0.5~2份，水1.5~6.5份；較佳者，取該海葡萄萃取液CLJ-5，於25℃加入乙醇-己烷水溶液，進行分配萃取24小時。

在本實施方式中，該有效劑量為5~50μg/mL；較佳者，該有效劑量為10μg/mL。

在一些實施例中，該組合物係可以是粉劑、錠劑、溶液、凝膠、膠囊、乳液、乳霜、化妝水、溶液、無水基劑、凝膠、噴劑或軟膏。

以下列舉數個實施例及實驗例，來進一步說明本發明的技術特徵、運用技術手段及所預期達成之功效：

實施例1

取524g海葡萄Caulerpa lentillifera並洗淨後，置入直壓式榨油機並設定壓力10331.22kgf/m²，持續冷壓海葡萄72小時以獲得海葡萄汁；取得之海葡萄汁通過一孔徑6μm之濾網，獲得海葡萄濾液474.6g及海葡萄濾渣49.4g，產率分別為90.58%以及9.42%；取得海葡萄濾液後，取其中200ml(約200.68g)加入防腐劑，並均勻攪拌後，抽乾海葡萄濾液即獲得海葡萄乾燥物7.39g，產率為1.41%。另一方面，取200ml海葡萄濾液，另外製備95%之乙醇200ml，於25℃下加入95%乙醇以進行分配萃取；分配萃取後，獲得水層及沉澱物層，收集水層並抽乾以獲得海葡萄水萃取物，收集沉澱物層並抽乾以獲得海葡萄沉澱萃取物。

實施例2

在本實施例中，取實施例1中所存留之該海葡萄濾渣，並配置95%乙醇，於25℃將海葡萄濾渣浸泡於95%乙醇中24小時，過濾掉海葡萄濾渣後，抽乾乙醇濾液以獲得該海葡萄萃取物2.35g，產率為0.45%。

實施例3

取實施例2所得之海葡萄萃取物2.35g，於25℃加入乙醇-己烷水溶液以進行分配萃取，乙醇：己烷：水之體積比例為3：1：4，在經過24小時，獲得己烷萃取層及乙醇萃取層；收集己烷萃取層以獲得海葡萄己烷萃取物0.58g，產率為0.1%；收集乙醇萃取層以獲得海葡萄乙醇萃取物1.69g，產率為0.32%。

實驗例1：細胞毒殺性試驗(Cytotoxicity assay)

本實驗例利用人類纖維母細胞CCD966SK細胞株進行細胞毒殺性測試，測試各待測樣品對於人類纖維母細胞CCD966SK的細胞毒殺性；以每格1x10³或1x10⁴顆細胞兩種不同細胞密度將細胞培養於96孔盤中，經過24小時使細胞均勻貼附於盤底。每格依照實驗設計分別加入不同濃度的待測樣品(0、12.5、25、50、100和200μg/μL)；反應48小時後，將培養液替換為含有MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-ul)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)細胞活性試劑之培養液，放置37℃之恆溫培養箱作用4小時。吸除上清液，以DMSO溶解formazan結晶並逐一注入96孔盤的每一格，最後利用酵素免疫分析儀(Enayme-linked immunosorbent assay,ELISA；Thermo Multiskan Ascent)在550nm讀取吸光值的條件下偵測呈色反應，紀錄後用以下公式計算藥物對於細胞的存活率：

其中，ODA為待測樣品組之吸光值，ODB為控制組(DMSO)之吸光值；得到各待測樣品海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5於不同濃度下作用的吸光值後，以DMSO處置之控制組存活率為100%，求得各待測樣品對細胞存活度的影響，並計算出抑制50%細胞存活所需要的濃度(the half maximal inhibitory concentration；IC₅₀)。

結果請參閱表1，由表1可知，Doxorubicin在1x10³的細胞數下IC₅₀為0.57±0.02μM，其餘待測樣品在不同的細胞數下都較無毒性，在後續實驗例中，將選擇無毒性劑量10或20μg/mL以進行其他細胞活性實驗。

實驗例2

為了瞭解待測樣品海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄沉澱萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5是否具有增加免疫能力或抗發炎的活性，將帶有NF-κB reporter的293A細胞株種於96孔盤中；待細胞貼附後，依照表2的劑量單獨給予待測樣品，讓待測樣品反應24小時。之後加入螢光素(luciferin)試劑作用2分鐘並讀取其化學冷光訊號反應以計算螢光酵素(luciferase)之活性。

請參閱圖4，係海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄沉澱萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5於促進NF-κB活性之直方圖，可以看見，在單獨處置293A細胞的狀態下，海葡萄濾液CLJ在5%或10%的稀釋濃度下及海葡萄沉澱萃取物CLJ-2在10或20μg/mL的處置濃度下，均明顯的提升NF-κB活性，其中相對於控制組DMSO，海葡萄濾液CLJ促進NF-κB的活性更是達到了顯著差異，能夠有效的提升細胞的NF-κB活性。圖3中星號(*)表示為控制組與待測樣品比較的統計之意義，本次實驗採集樣本數3，採用T檢驗，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

實驗例3

為了瞭解海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5是否具有與TNFα共同促進免疫能力或抗發炎的活性；在本實驗例中，除了對細胞投予待測樣品之外，同時投予腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNFα)以誘導細胞產生發炎反應，模擬發炎狀態下，待測樣品待測樣品與TNFα 10ng/mL是否對於增加免疫能力或抗發炎的活性具有加乘效果。同樣將帶有NF-κB reporter的293A細胞株種於96孔盤中；待細胞貼附後，依照表3的劑量單獨給予待測樣品，並加入TNFα 10ng/mL，令TNFα及待測樣品共同與細胞反應24小時。之後加入螢光素(luciferin)試劑作用2分鐘並讀取其化學冷光訊號反應以計算螢光酵素(luciferase)之活性。

請參閱圖5，係海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5與TNFα共同促進NF-κB活性之直方圖，可以看見，在待測樣品與10ng/mL TNFα共同處置293A細胞的狀態下，海葡萄濾液CLJ在5%或10%的稀釋濃度下，相較於控制組DMSO要更明顯的提升了NF-κB活性，說明了海葡萄濾液CLJ具備與TNFα協同作用的能力，能夠有效的進一步提升細胞的NF-κB活性；一方面，作為陽性對照組的BAY 10μM係對於細胞投予NF-κB抑制因子，在NF-κB的作用下，其能顯著的抑制由TNFα所活化的發炎反應；其餘不同濃度待測樣品並無顯著的抑制NF-κB活性的情形。圖4中星號(*)表示為控制組與待測樣品比較的統計之意義，本次實驗採集樣本數3，採用T檢驗，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

實驗例4

在本實驗例中，為了瞭解海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5是否具有促進膠原蛋白生成或抗纖維化活性，將具有Smad報導基因的293A細胞株種於96孔盤中；待細胞貼附後，依表4投予細胞待測樣品後，讓藥物反應24小時之後，加入螢光素(luciferin)試劑作用兩分鐘，讀取其化學冷光訊號反應出螢光酶(luciferase)活性。

請參閱圖6，其係海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5促進Smad活性之直方圖，可以看見，相對於控制組DMSO，海葡萄萃取物CLJ-5以及海葡萄濾液CLJ對於Smad活性有明顯的提升。

實驗例5

在本實驗例中，為了瞭解待測樣品海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5是否具有促進膠原蛋白生成或抗纖維化活性；在本實驗例中，除了對細胞投予待測樣品之外，同時投予乙型轉化生長因子(Transforming Growth Factor β,TGFβ)以促進膠原蛋白生成或抗纖維化活性，以觀察待測樣品與TGFβ是否對於促進膠原蛋白生成或抗纖維化活性具有加乘效果。將具有Smad報導基因的293A細胞株種於96孔盤中，待細胞貼附後，依表5投予細胞待測樣品後，讓藥物反應24小時之後，加入螢光素(luciferin)試劑作用兩分鐘，讀取其化學冷光訊號反應出螢光酶(luciferase)活性。

請參閱圖7，係海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5於促進Smad活性之直方圖，可以看見，在單獨處置293A細胞的狀態下，海葡萄濾液CLJ在5%或10%的稀釋濃度下及海葡萄萃取物CLJ-5在10μg/mL的處置濃度下，與TGFβ共同作用下，均明顯的提升Smad活性，其中，CLJ的效果尤為明顯。圖6中星號(*)表示為控制組與待測樣品的比較，本次實驗採集樣本數3，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

實驗例6

在本實驗例中，為了瞭解待測樣品海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5 是否具備抗氧化之功效，本實驗例以Nrf2基因活性作為判斷之依據，觀察待測樣品是否具有促進Nrf2基因表現量之效果，以達到抗氧化之功效。

將具有氧化反應元件報導基因(antioxidant response element reporter,ARE reporter)之293A細胞株種植於96孔盤中，待細胞貼附後，依據表6投予細胞待測樣品，讓待測樣品反應24小時之後，加入螢光素(luciferin)試劑作用2分鐘並讀取其化學冷光訊號反應出螢光酵素(luciferase)活性。

請參閱圖8，其係海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5於促進Nrf2活性之直方圖；海葡萄萃取物CLJ-5在10或20μg/mL、CLJ在5或10%的處理濃度下，與陽性對照組蘿蔔硫素(sulforaphane,SFN)5或10μM都能明顯增加抗氧化能力，且與控制組相比均達到統計上的顯著差異，其中在CLJ-5 20μg/mL以及CLJ 10%的處理濃度下，抗氧化作用最強。圖7中星號(*)表示為控制組與待測樣品的比較，本次實驗採集樣本數3，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

實驗例7

基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)和基質金屬蛋白酶-3(MMP)-3是膠原蛋白分解酶其中的兩種，在光老化進程中扮演著重要角色，細胞受紫外線曝曬會引發基質金屬蛋白酶大量表現，加速降解胞外基質(Extracellular matrix,ECM)，從而造成膠原蛋白的降解流失。在本實驗例中，藉以證實待測樣品海葡萄濾液CLJ、海葡萄乾燥物CLJP、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2、海葡萄萃取物CLJ-5是否具有降低基質金屬蛋白酶活性之效果，並達到減緩膠原蛋白流失。

將人類纖維母細胞CCD966SK種植於培養盤中，待細胞貼附後，實驗組依表7添加待測樣品，對照組則以原培養液繼續培養；培養24小時後，以能量密度10mJ/cm²之UVB照射細胞，以誘發細胞大量表現MMP-1或MMP-3，並收集細胞以進行西方墨點分析。請參閱圖9，係針對海葡萄濾液CLJ、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2對於細胞內MMP-1或MMP-3於UVB誘導下其表現量之西方墨點分析；由圖8可見，在未受到UVB誘導的情況下，待測樣品海葡萄濾液CLJ、海葡萄水萃取物CLJ-1、海葡萄乙醇萃取物CLJ-2對於細胞MMP-1的表現量並無明顯影響，而MMP-3則因未受到UVB的誘導而未表現；在受到10mJ/cm² UVB誘導的情況下，可以觀察到MMP-3在UVB誘導下而有大量表現的情形，MMP-1表現量也有上升的趨勢；其中，在海葡萄濾液CLJ的作用下，相當成功的抑制了MMP-3的表現，在西方墨點分析上並沒有偵測到MMP-3的條帶，而MMP-1相對於控制組亦有受到抑制的情形，所偵測到的條帶相較於未處理的對照組MMP-1的條帶較小；由此可見，在UVB誘導下，海葡萄濾液CLJ具有抑制MMP-1及MMP-3的表現，從而具有減緩光照下膠原蛋白降解流失的功效。

實驗例8

在本實驗例中，測試不同濃度的海葡萄萃取物CLJ-5對於MMP-1以及MMP-3表現量的影響；將人類纖維母細胞CCD966SK種植於培養盤中，待細胞貼附後，分別添加0、1、10、100μg/mL之海葡萄萃取物CLJ-5，其中添加0μg/mL之海葡萄萃取物CLJ-5作為對照組；培養24小時後，以能量密度10mJ/cm²之UVB照射細胞，以誘發細胞大量表現MMP-1及MMP-3，並收集細胞以進行西方墨點分析。

請參閱圖10，其提供了CLJ-5針對人類纖維母細胞CCD966SKMMP-1及MMP-3之西方墨點分析；可以觀察到，在經過UVB誘導，MMP-1及MMP-3在10μg/mL的海葡萄萃取物CLJ-5的作用下，其表現量相較於對照組明顯受到抑制；在其他濃度1、100μg/mL的海葡萄萃取物CLJ-5作用下，同樣具有抑制效果，但相較於10μg/mL的劑量則較不顯著；由本實驗例可看出，海葡萄萃取物CLJ-5對於MMP-1及MMP-3均具有抑制效果，能有效抑制UVB誘導下MMP-1及MMP-3的表現量，具備減緩膠原蛋白降解流失之功效。

實驗例9

在本實驗例中，測試海葡萄乾燥物CLJP對於MMP-1以及MMP-3表現量的影響；將人類纖維母細胞CCD966SK種植於培養盤中，待細胞貼附後，分別添加0、10μg/mL之海葡萄萃取物CLJP，其中添加0μg/mL之海葡萄萃取物CLJP作為對照組；培養24小時後，以能量密度10mJ/cm²之UVB照射細胞，以誘發細胞大量表現MMP-1及MMP-3，並收集細胞以進行西方墨點分析。

請參閱圖11，其提供了海葡萄乾燥物CLJP針對人類纖維母細胞CCD966SKMMP-1及MMP-3之西方墨點分析；可以觀察到，在尚未經過UVB誘導前，MMP-1的表現量相較於對照組即受到了海葡萄乾燥物CLJP的抑制，在經過UVB誘導後，MMP-1在海葡萄乾燥物CLJP的作用下，其表現量相較於對照組也明顯受到抑制，且MMP-3的表現量也沒有受到UVB的誘導而產生表現量大增的情形；由本實驗例可看出，海葡萄乾燥物CLJP對於MMP-1及MMP-3均具有抑制效果，能有效抑制UVB誘導下MMP-1及MMP-3的表現量，具備減緩膠原蛋白降解流失之功效。

本發明所提供的海葡萄乾燥物用於製備皮膚抗發炎、抗癌組合物之用途，具備有以下幾種功效：透過本發明所揭示之萃取方式，海葡萄所含之活性成分能完整萃取出，且低溫的萃取流程避免了溫度變化對活性成分的破壞；再者，該組合物具有促進皮膚細胞NF-kB之活性，提升皮膚細胞的抗發炎反應能力，具有提升細胞免疫的效果；又，該組合物能可單獨或與TGFβ共同作用，促進Smad活性，具有提升皮膚細胞抗癌化能力的潛力；此外，本發明所提供之組合物具有促進皮膚細胞抗氧化活性，其透過了活化Nrf2基因以開啟下游抗氧化基因，能進一步達到抗皺及減緩老化之效果；最後，在紫外線UV誘導下，皮膚細胞MMP-1或MMP-3等膠原蛋白降解酶大量表現量，而本發明所提供之組合物能有效抑制MMP-1或MMP-3的表現量，減緩UV所導致的皮膚細胞老化並保持皮膚細胞活性。

(S1至S5:步驟)

Claims

一種海葡萄萃取物用於製備皮膚抗發炎、抗氧化及抗癌組合物之用途，係將一有效劑量投予至所需個體，以達到皮膚抗發炎、抗氧化及抗癌之功效，其中，該有效劑量為5~50μg/mL，該海葡萄萃取物的製備方法包括：將海葡萄Caulerpa lentillifera洗淨後，冷壓該海葡萄以獲得一海葡萄汁；該海葡萄汁通過一濾網，以獲得一海葡萄濾液CLJ及一海葡萄濾渣CLD；取該海葡萄濾渣CLD，於20~30℃浸泡於85~100%乙醇中獲得一乙醇濾渣混合物，並浸泡18~30小時；該乙醇濾渣混合物通過濾網，以獲得一乙醇濾液；及抽乾該乙醇濾液，獲得一海葡萄萃取物CLJ-5，其中，該冷壓步驟係以施以9000~11000kg/m²壓力，持續壓榨該海葡萄60~80小時，該濾網孔徑介於3~9μm。
如請求項1所述之用途，其中，該組合物進一步包括一海葡萄己烷萃取物，該海葡萄己烷萃取物的製備方法包括：取該海葡萄萃取物CLJ-5，於20~30℃加入乙醇-己烷水溶液；進行分配萃取18~30小時，以獲得一己烷萃取層及一乙醇萃取層；及收集該己烷萃取層以獲得一海葡萄己烷萃取物CLJ-5H。
如請求項1所述之用途，其中，該組合物進一步包括一海葡萄乙醇萃取物，該海葡萄乙醇萃取物的製備方法包括：取該海葡萄萃取物CLJ-5，於20~30℃加入乙醇-己烷水溶液；進行分配萃取18~30小時，以獲得一己烷萃取層及一乙醇萃取層；及收集該乙醇萃取層以獲得一海葡萄乙醇萃取物CLJ-5Et。
如請求項2或3所述之用途，其中，該乙醇-己烷水溶液體積配比分別為乙醇1~5份，己烷0.5~2份，水1.5~6.5份。
如請求項1所述之用途，其中，該組合物進一步包括一海葡萄濾液水萃取物或一海葡萄濾液乙醇沉澱萃取物，其製備方法包括：取該海葡萄濾液CLJ，於20~30℃下加入85~100%乙醇；分配萃取18~30小時，以獲得一水層及一乙醇沉澱物層；收集該水層為一海葡萄濾液水萃取物CLJ-1；或收集該乙醇沉澱物層為一海葡萄濾液乙醇沉澱萃取物CLJ-2。
如請求項5所述之用途，其中，該海葡萄濾液CLJ與該85~100%乙醇之比例為0.5：1~1.5：1。
如請求項1、2、3、5或6任一項所述之用途，其中，該海葡萄萃取物可增進NF-κB、Smad及氧化反應元件ARE活性之能力，具有促進皮膚發炎修復及抗氧化之功效。
如請求項1、2、3、5或6任一項所述之用途，其中，該海葡萄萃取物可抑制UV所誘導之MMP-1/MMP-3表現，達到促進皮膚膠原蛋白流失之功效。