CN117257828A - 竹节参多糖在防治非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱中的应用 - Google Patents

竹节参多糖在防治非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药保健食品及药品技术领域，具体涉及竹节参多糖的制备和竹节参多糖在治疗非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱中的应用。本发明通过高脂饮食构建小鼠非酒精性脂肪肝模型，经试验证明，竹节参多糖具有改善非酒精性脂肪肝与调节肠道菌群的药效。通过血清学指标分析、染色切片镜检等技术证明竹节参多糖具有降低血清学肝脏指标、减少肝细胞脂质积累、改善小鼠肥胖；同时，通过肠道菌群16S rRNA测序技术明确了其具有改善肠道菌群的功能。同时，本发明提取制备方法简单，易于转为进行现代工业化生产流程，极具开发潜力，因此能够取得良好的经济和社会效益。

Description

竹节参多糖在防治非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱中的应用
技术领域
本发明属于医药保健食品及药品技术领域，涉及竹节参多糖在防治非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱中的应用，具体涉及竹节参多糖的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种常见的代谢性肝脏疾病，包含肝脏从简单脂肪变性到肝纤维化的整个过程，被认为是慢性肝病的主要原因。NAFLD的成因复杂，与2型糖尿病、高血压、高血脂、代谢综合征、肠道菌群失调密切相关，是重要的公共健康问题。然而NAFLD具体的发病与发展机制还没有明确定论，相关的治疗药物同样缺乏。
肠道微生物联系着饮食与宿主健康，有越来越多的研究表明肠道微生物参与了NAFLD的发病过程。高脂饮食(HFD)会引起肠道菌群的紊乱，增加了厚壁菌门的丰度，降低拟杆菌门的丰度，并增加厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)的比率，进一步加重NAFLD的发展。同时有研究发现无菌小鼠在缺乏肠道微生物的情况下，对于NAFLD表现出明显的抵抗，而对于移植了患有代谢综合征的小鼠肠道菌群的表现出明显的易感性。因此NAFLD发展和肠道微生物密切相关。
竹节参为五加科人参属Panax japonicus C.A.Mey.的干燥块根，是民间常见的药食。在贵州地区，竹节参常用于炖肉、煲汤和泡酒，用以进补。传统医学认为其具有活血化瘀、滋补强壮、祛风除湿的功效。现代药理学研究表明，竹节参具有保肝降糖的作用，竹节参保护肝细胞免受CCl4损伤，改善非酒精性脂肪肝，对肝癌也有杀灭作用。竹节参水提物同样有报道称其具有降血糖作用。近年来竹节参皂苷也有大量的报道关于缓解非酒精性脂肪肝。近年来关于竹节参多糖抗炎和抗急性肝损伤的功能研究较多，但对于非酒精性脂肪肝的保护作用与改善肠道菌群紊乱缺乏系统性的研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供竹节参多糖在治疗非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱中的应用。本发明通过高脂饮食(HFD)构建小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型，经试验证明，竹节参多糖具有改善非酒精性脂肪肝与调节肠道菌群的药效。通过血清学指标分析、染色切片镜检等技术证明竹节参多糖具有降低血清学肝脏指标、减少肝细胞脂质积累、改善小鼠肥胖；同时，通过肠道菌群16S rRNA测序技术明确了其具有改善肠道菌群的功能。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供竹节参多糖在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱的产品中的应用。
所述产品包括但不限于食品和药品。
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
本发明中的竹节参多糖是从竹节参中提取获得的多糖成分，在本发明中，所述竹节参多糖通过水提醇沉法制备获得。
其中，所述治疗非酒精性脂肪肝至少表现为降低血清学肝脏指标、减少肝细胞脂质积累以及改善肥胖；
在本发明的一个具体实施方式中，所述非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱是由高脂饮食介导产生。
本发明的第二个方面，提供一种竹节参多糖的制备方法，所述制备方法包括：
S1、将干燥后的竹节参使用乙醇回流提取去除脂溶性物质，得剩余物；
S2、将步骤S1制得的剩余物加水煮沸后进行提取处理，获得水提物，离心去除不溶组分，收集上清液；
S3、将步骤S2获得上清液进行醇沉处理，收集沉淀即粗多糖；
S4、将步骤S3中的粗多糖去除蛋白后即得。
采用苯酚-硫酸法测定制得竹节参多糖的糖含量为87.06％。
发明人经试验证明，采用上述方法制得的竹节参多糖成分能够有效治疗非酒精性脂肪肝，并改善肠道菌群紊乱。
本发明的第三个方面，提供一种防治非酒精性脂肪肝以及改善肠道菌群紊乱的产品，所述产品至少包含上述竹节参多糖。
所述产品包括但不限于食品和药品。
本发明的第四个方面，提供一种防治非酒精性脂肪肝以及改善肠道菌群紊乱的方法，所述方法包括对受试者施用上述竹节参多糖或产品。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案中以竹节参为原料，采用水提醇沉法获得竹节参多糖，同时通过动物实验首次证明竹节参多糖具有治疗非酒精性脂肪肝与改善肠道菌群紊乱的功效，具有良好的保健及治疗价值。同时，本发明提取制备方法简单，易于转为进行现代工业化生产流程，极具开发潜力，因此能够取得良好的经济和社会效益。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为竹节参多糖对非酒精性脂肪肝小鼠肥胖的影响；其中，A为体重变化曲线，B为附睾脂肪重量，C为肝脏重量，D为肝脏指数(肝重体重比)；
图2为竹节参多糖对非酒精性脂肪肝小鼠血清脂质的影响；其中，A为TG含量，B为TC含量，C为HDL-C含量；
图3各组小鼠肝脏的病理切片；其中，A为HE、油红O和PAS染色结果，B为NAS评分，C为油红染色阳性面积图；
图4为竹节参多糖对非酒精性脂肪肝小鼠血清ALT、AST的影响；其中，A为ALT含量，B为AST含量；
图5为竹节参多糖对非酒精性脂肪肝小鼠脂代谢相关基因的影响；
图6为竹节参多糖对非酒精性脂肪肝小鼠炎症相关基因的影响；
图7为竹节参多糖对小鼠肠道菌群阿尔法多样性的影响；
图8为竹节参多糖对小鼠肠道菌群贝塔多样性的影响；其中，A为维恩图，B为基于weighted Unifrac distance的PCoA分析，C为基于unweighted Unifrac distance的聚类分析图；
图9为竹节参多糖在门水平上调节小鼠肠道菌群紊乱；
图10为竹节参多糖在属水平上调节小鼠肠道菌群紊乱；
图11为竹节参多糖对小鼠肠道菌群紊乱调节的LEfSe分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供竹节参多糖在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱的产品中的应用。
所述产品包括但不限于食品和药品。
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或者预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
本发明中的竹节参多糖是从竹节参中提取获得的多糖成分，在本发明中，所述竹节参多糖通过水提醇沉法制备获得。
其中，所述治疗非酒精性脂肪肝至少表现为降低血清学肝脏指标、减少肝细胞脂质积累以及改善肥胖。
在本发明的一个具体实施方式中，所述非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱是由高脂饮食介导产生。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种竹节参多糖的制备方法，所述制备方法包括：
S1、将干燥后的竹节参使用乙醇回流提取去除脂溶性物质，得剩余物；
S2、将步骤S1制得的剩余物加水煮沸后进行提取处理，获得水提物，离心去除不溶组分，收集上清液；
S3、将步骤S2获得上清液进行醇沉处理，收集沉淀即粗多糖；
S4、将步骤S3中的粗多糖去除蛋白后即得。
其中，所述步骤S1中，所述干燥可以为烘干处理，如在40-60℃(优选50℃)进行烘干处理；
所述乙醇回流提取的具体方法包括：使用高浓度乙醇(如95％乙醇)进行回流提取1～5次(优选为3次)，每次1～5小时(优选为2小时)；
所述步骤S2中，加水煮沸的具体条件包括：料液比为1:1～10(kg/L)，优选为1:5，煮沸处理时间为1～3h，优选为2h，加水煮沸次数为1～5次(优选为3次)；
所述步骤S3中，所述醇沉处理方法包括：向上清液中加入95％乙醇，静置后收集沉淀；静置处理时间为10-40小时(优选为24小时)；
所述步骤S4中，去除蛋白采用Sevage法进行，具体的，使用Sevage试剂(CH3Cl:BuOH＝4:1,v/v)去除蛋白质5～8次。
本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括对步骤S4获得的竹节参多糖进行经冻干处理。
采用苯酚-硫酸法测定制得竹节参多糖的糖含量为87.06％。
发明人经试验证明，采用上述方法制得的竹节参多糖成分能够有效治疗非酒精性脂肪肝，并改善肠道菌群紊乱。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种防治非酒精性脂肪肝以及改善肠道菌群紊乱的产品，所述产品至少包含上述竹节参多糖。
所述产品包括但不限于食品和药品。
其中，所述食品其可以理解为可以使任何可以被食用的形式，例如，本发明中的食品包括普通食品和特殊食品，本发明所述特殊食品包括保健食品和特殊医学用途配方食品；而普通食品时相对于特殊食品而言的，是适合所有人的食品。
所述药品可以单位剂量形式给药，给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂和擦剂等。所述药品可以是供人和非人动物使用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种防治非酒精性脂肪肝以及改善肠道菌群紊乱的方法，所述方法包括对受试者施用上述竹节参多糖或产品。
所述受试者可以是人或非人动物，其中，人是优选的
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：竹节参多糖的制备
通过如下步骤制备竹节参多糖：
竹节参多糖(PSPJ)采用水提醇沉法提取。
首先将竹节参在50℃烘箱中烘干，切片(1.0kg)。
然后使用95％乙醇回流提取2h，提取3次，除去脂溶性物质。
使用5L纯水煮沸2h，重复该步骤3次。
合并水提物并浓缩至1L，4000rpm离心15min除去不溶组分，收集上清液。
上清液使用6L 95％乙醇在室温下沉淀过夜，得到粗多糖。粗多糖完全溶解于纯水中。
使用Sevage试剂(CH3Cl:BuOH＝4:1,v/v)去除蛋白质污染物5次。
最后，将多糖溶液冷冻干燥，得到竹节参多糖PSPJ(21.7克)。
苯酚-硫酸法测定PSPJ的糖含量为87.06％。制得竹节参多糖PSPJ用于实施例2-3。
实施例2：竹节参多糖治疗高脂饲料(HFD)诱导的小鼠非酒精性脂肪肝
实验方法：
NAFLD小鼠模型的建立：6周龄雄性C57BL/6J小鼠(SPF级)，体重20-21g，预饲养一周后，称重并随机分为4组，每组8只。每4周进行一次称重，记录体重变化曲线。
NC组：饲喂正常饲料24周，从16周开始每日灌胃普通饮用水。
HFD组：饲喂HFD 24周，从16周开始每日灌胃普通饮用水。
PSPJL组：饲喂HFD 24周，从16周开始每日灌胃PSPJ溶液(25mg/kg/d)。
PSPJH组：饲喂HFD 24周，从16周开始每日灌胃PSPJ溶液(100mg/kg/d)。
试验结束后，小鼠麻醉处死，收集血液，肝脏和附睾脂肪样本。
血清学检查：取血后，于4℃静置2h后离心(3500rpm，15min)，收集上清。之后按照ALT、AST、TG、TC、LDL-C试剂盒说明书进行检测。
病理学检查：离体肝脏组织经过固定、包埋、切片、染色等步骤后，在显微镜下观察肝脏组织形态学变化。
qPCR：取适量离体肝脏组织，经过低温破碎后，使用Trizol法提取总RNA，反转成cDNA后进行按市售相关试剂盒说明进行qPCR。
结果分析：本实验采用HFD诱导小鼠非酒精性脂肪肝，以评价PSPJ对NAFLD的作用。造模16周后，胃内注射PSPJ。PSPJL组的灌胃剂量为25mg/kg/d，PSPJH组的灌胃剂量为100mg/kg/d。如图1A所示，在前16周内，HFD喂养的小鼠体重明显高于NC组。但灌胃PSPJ后，PSPJ组肥胖小鼠体重增加减少，而PSPJH组肥胖小鼠体重则有一定程度下降。小鼠附睾脂肪的积累可以反映小鼠的肥胖程度。处死小鼠后收集的附睾脂肪重量表明，PSPJ以剂量依赖性方式减少附睾脂肪的积累(图1B)。
HFD喂养24周后，与NC饮食小鼠相比，肝脏重量(LW)和肝脏重量与体重比(LW/BW)显着增加，而PSPJ治疗小鼠的LW和LW/BW显着下降(图1C,D)。与HFD相比，PSPJ组的血清脂质水平(TG、TC、LDL-C)显着降低(图2A,B,C)。
He染色和油红O染色结果显示，HFD组出现大面积肝细胞脂肪变性和少量气球样变，而PSPJ用药组则明显改善(图3A)。与NAS评分标准和油红O阳性面积相比，PSPJ显着改善NAFLD(图3B,C)。此外，我们还对肝脏进行了PAS染色，镜检结果显示，HFD组肝糖原含量最低，PSPJ组较HFD组肝糖原含量有所增加(图3A)。根据PSPJ组血清ALT和AST水平测量，HFD引起的肝损伤程度显着减轻(图4A,B)。
RT-PCR分析显示，PSPJ抑制脂肪酸摄取相关基因(Cd36和Fabp1)、脂肪酸合成相关基因(Fasn、Acaca、Scd1和Ppary)以及炎症相关基因(cxcl10、il-1β和tnf-α)(图5,6)。
总的来说，我们的研究表明PSPJ可以减轻HFD引起的小鼠非酒精性脂肪肝。
实施例3：竹节参多糖改善HFD诱导的小鼠肠道菌群紊乱。
实验方法、动物模型：同实施例2。
结果分析：本实验采用HFD诱导小鼠肠道菌群紊乱，以评价PSPJ对肠道菌群紊乱的调节作用。通过对小鼠结肠粪便进行了16S rRNA测序，α多样性分析表明，补充PSPJ不能改善HFD引起的微生物下降，并且添加PSPJ对观察到的otus和chao1指数没有显着影响。然而，PSPJ在一定程度上增加了微生物菌落的多样性，并且PSPJ增加了香农指数和辛普森指数(图7)。如图8A所示，与HFD组和NC组相比，PSPJL组和PSPJH组的OTU包含不同的1253(1250＝364+889)和1260(1260＝371+889)个物种。我们通过Bray-Curtis测量的PCoA和样本层次聚类树分析了β多样性，结果表明PSPJL和PSPJH组密不可分，而两者均与HFD和NC组显着不同(图8B,C)。在肠道菌群的门水平差异分析中，我们发现补充PSPJ降低了厚壁菌门的丰度，增加了拟杆菌门的丰度，并降低了厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)的比率(图9)，逆转了HFD的影响。在属水平差异分析中，PSPJ降低了图里奇杆菌属、杜博氏菌属和葡萄球菌属的丰度(图10)，同样逆转了HFD的影响。同时，我们使用LEfSe分析基于OTU的进化枝图，LDA值大于4的物种统计如图11所示。
这些结果表明，PSPJ可改善HFD喂养小鼠的肠道微生物群失调,减少致病菌的丰度。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.竹节参多糖在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱的产品中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述产品包括食品和药品。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述竹节参多糖通过水提醇沉法制备获得。
4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述治疗非酒精性脂肪肝至少表现为降低血清学肝脏指标、减少肝细胞脂质积累以及改善肥胖。
5.如权利要求1-4任一项所述应用，其特征在于，所述非酒精性脂肪肝与肠道菌群紊乱是由高脂饮食介导产生。
6.一种竹节参多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1、将干燥后的竹节参使用乙醇回流提取去除脂溶性物质，得剩余物；
S2、将步骤S1制得的剩余物加水煮沸后进行提取处理，获得水提物，离心去除不溶组分，收集上清液；
S3、将步骤S2获得上清液进行醇沉处理，收集沉淀即粗多糖；
S4、将步骤S3中的粗多糖去除蛋白后即得。
7.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述干燥为烘干处理，进一步的，在40-60℃进行烘干处理；
所述乙醇回流提取的具体方法包括：使用高浓度乙醇进行回流提取1～5次，每次1～5小时；
所述步骤S2中，加水煮沸的具体条件包括：料液比为1:1～10，kg/L；煮沸处理时间为1～3h，加水煮沸次数为1～5次。
8.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述醇沉处理方法包括：向上清液中加入95％乙醇，静置后收集沉淀；静置处理时间为10-40小时；
所述步骤S4中，去除蛋白采用Sevage法进行，具体的，使用Sevage试剂去除蛋白质5～8次。
9.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对步骤S4获得的竹节参多糖进行经冻干处理。
10.一种防治非酒精性脂肪肝以及改善肠道菌群紊乱的产品，其特征在于，所述产品至少包含权利要求6-9任一项所述制备方法获得的竹节参多糖；
进一步的，所述产品包括食品和药品。
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