CN110393724A - 灵芝多糖f31在制备抑制肝脏糖异生药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了灵芝多糖F31在制备抑制肝脏糖异生药物中的应用。本发明发现,灵芝多糖F31能抑制HepG2细胞的糖异生,因此为灵芝多糖F31用于改善NALFD的功能应用提供科学的应用基础;同时灵芝多糖F31也将成为非常具有应用前景的改善NALFD候选成分。
Description
技术领域:
本发明属于生物医药领域,具体涉及灵芝多糖F31在制备抑制肝脏糖异生药物中的应用。
背景技术:
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征。NAFLD是目前最常见的慢性肝病,它涉及广泛的肝损伤,可发生脂肪变性进展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化、肝细胞癌(hepatocellular cancer,HCC)。NAFLD正在成为世界上最常见的肝病病因,世界范围内NAFLD患病率为25%左右,我国一些大中城市成人NAFLD患病率已达15%左右,如广州、北京、上海、香港等。对NAFLD和NASH几乎没有有效的药物治疗,这一严峻形势促使对NAFLD的新药开发迫在眉睫。
灵芝Ganoderma lucidum,属于担子菌纲,多孔菌科,灵芝属,在我国被用于肝炎等肝部疾病的预防和治疗有两千多年的药用史。
肝脏葡萄糖输出的异常与NAFLD的形成密切相关,临床资料表明NAFLD患者肝糖异生量比健康人高30%;动物实验表明,果糖诱导的NAFLD小鼠的糖异生量显著增加。因此通过抑制肝脏糖原分解或糖异生关键性酶,减少葡萄糖生成,是治疗NAFLD的重要靶标之一。
葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸丙酮酸羧化酶(PEPCK)是糖异生的两个关键性酶。因此,抑制参与糖异生的酶,将行之有效地抑制肝葡萄糖的输出。AMPK(Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase)即AMP依赖的蛋白激酶,是生物能量代谢调节的关键分子,是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心。它表达于各种代谢相关的器官中,能被机体各种刺激激活,包括细胞压力、运动和很多激素及能影响细胞代谢的物质。遗传学和药理学研究表明,AMPK是机体保持葡萄糖平衡所必需的。由于分子机制十分复杂,药物分子激活AMP是一个巨大的挑战,但其激活能改善由II型糖尿病引起的代谢失衡。新近发现环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)辅激活物(TORC2)是启动糖异生的关键调控因子。TORC2蛋白是血糖调节中的“分子开关”,当血糖浓度降低时,胰高血糖素可以活化该蛋白从而开启产生葡萄糖所需基因的表达。AMPK通过磷酸化TORC2,阻止其进入细胞核,从而降低CREB的转录水平。激活AMPK,下调CREB,再通过调节一些重要的转录因子如过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、叉头转录因子1(FOXO1)、肝细胞核因子4α(HNF4α),最终将下调肝脏糖异生的关键性酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶G6Pase的表达。
发明内容:
本发明的目的是提供灵芝多糖F31在制备抑制肝脏糖异生药物中的应用。
本发明利用免疫印迹(WB)分析,在体外HepG2细胞实验中,灵芝多糖F31能抑制HepG2细胞的糖异生;能够抑制糖异生关键性酶G6Pase的蛋白水平的表达,能够极其显著地抑制HepG2细胞糖异生信号分子P-AMPK的蛋白表达水平(P<0.01);对于TORC2蛋白,灵芝多糖F31能抑制其表达水平和磷酸化水平,灵芝多糖F31能够极其显著地抑制HepG2细胞糖异生信号通路核转录因子PGC-1α,FOXO1和HNF4α的蛋白表达水平(P<0.05)。推测灵芝多糖F31可以通过激活AMPK/TORC2/PEPCK,G6Pase信号转导通路从而抑制糖异生。
因此,优选,所述的灵芝多糖F31是通过抑制G6Pase、P-AMPK的蛋白表达、核转录因子PGC-1α,FOXO1和HNF4α的蛋白表达来抑制肝脏糖异生。
所述的抑制肝脏糖异生药物是抑制肝脏细胞
本发明的第二个目的是提供一种抑制肝脏糖异生药物,其含有灵芝多糖F31作为活性成分。
由于通过抑制肝脏糖原分解或糖异生关键性酶,减少葡萄糖生成,是治疗NAFLD的重要靶标之一。因此,本发明的第三个目的是提供灵芝多糖F31在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种治疗非酒精性脂肪性肝病的药物,其含有灵芝多糖F31作为活性成分。
本发明的第五个目的是提供灵芝多糖F31在制备G6Pase、P-AMPK蛋白表达、核转录因子PGC-1α,FOXO1、HNF4α的蛋白表达抑制剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种G6Pase、P-AMPK蛋白表达、核转录因子PGC-1α,FOXO1、HNF4α的蛋白表达抑制剂,其含有灵芝多糖F31作为活性成分。
本发明发现,灵芝多糖F31能抑制HepG2细胞的糖异生,因此为灵芝多糖F31用于改善NALFD的功能应用提供科学的应用基础;同时灵芝多糖F31也将成为非常具有应用前景的改善NALFD候选成分。
附图说明:
图1是灵芝多糖F31抑制HepG2细胞糖异生的研究;
图2是灵芝多糖F31对HepG2细胞糖异生关键酶(PEPCK和G6Pase)的蛋白表达水平的影响;
图3是灵芝多糖F31对HepG2细胞糖异生信号分子(AMPK,TORC2)的蛋白和磷酸化蛋白表达水平;
图4是灵芝多糖F31对HepG2细胞糖异生信号通路核转录因子(CREB,PGC-1α、FOXO1、HNF4α)的蛋白表达水平的影响。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:
一、灵芝多糖F31抑制HepG2细胞糖异生作用的研究:
本发明的灵芝多糖F31的制备方法公开于中国专利:CN201210056087.5中,可以按照里面公开的方法制备得到灵芝多糖F31。
(1)HepG2细胞(人肝癌细胞),购于中科院上海细胞库,复苏好的细胞传三代后作为实验研究使用。
(2)HepG2细胞培养24小时,更换成无血清低糖DMEM培养基,同时分别在对照组和F31处理组里加入PBS和灵芝多糖F31(100ug/ml)饥饿诱导24h,用PBS润洗3次至彻底除去培养基,更换成加入无糖无酚红DMEM培养基(含20mM乳酸钠、2mM丙酮酸钠),同时分别在对照组和F31处理组里加入PBS和灵芝多糖F31(100ug/ml)培养7h;
(3)7h后吸取上清无糖无酚红DMEM,离心取上清液用Amplite FluorimetricGlucose Quantitation Kit测葡萄糖含量,(荧光分光光度计850v,Ex/Em=530/580),细胞用M-PER Mammalian Protein Extration Reagent裂解,每孔加200ul裂解液,冰裕裂解30min,裂解后转入1.5ml离心管12000rpm/min离心5min,取上清液用BCA蛋白定量试剂盒测细胞蛋白含量。
(4)糖异生的计算:细胞糖异生量=葡萄糖生成量/细胞蛋白含量。
二、研究灵芝多糖F31F31对肝脏糖异生信号转导通路的调控
(1)收集步骤一中(3)的HepG2细胞,加入含SDS的凝胶加样缓冲液裂解;组织用微量匀浆器PRO200匀浆器研磨均匀后再加入裂解液裂解,提取蛋白,用BCA蛋白定量试剂盒测细胞蛋白含量。
(2)收集步骤一中(3)的HepG2细胞,Western Blotting技术测定HepG2细胞中糖异生关键酶(PEPCK和G6Pase)及核转录因子(CREB,PGC-1α、FOXO1、HNF4α)的蛋白表达水平,测定信号分子(AMPK,P-AMPK,TORC2,P-TORC2)的蛋白和磷酸化蛋白表达水平。
在不连续缓冲系统下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),之后转移到硝酸纤维素膜(NC)上。采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭,用一抗孵育,之后再用酶联的二抗孵育,最后用增强化学发光(ECL)系统检测各蛋白的表达。经Imagescan软件转化各目的蛋白条带的灰度值,再进行统计分析。
(3)数据的处理用SPSS20.0软件中的单因素方差分析(one-wayANOVA)进行分析,并用最小显著性差异(LSD)法进行组间比较。所有数据均用均值±标准偏差(±SD)表示,P<0.05为显著差异,P<0.01为极其显著差异。
三、实验结果
实验结果如图1、2、3、4所示。
图1是灵芝多糖F31对HePG2细胞糖异生的抑制作用,其中HePG2为对照组,HePG2+F31为F31处理组,从图1可以看出,在HepG2细胞外加入糖异生底物后,灵芝多糖F31能够极其显著地抑制HepG2细胞糖异生(P<0.01)。
图2是灵芝多糖F31对HepG2细胞糖异生关键酶(PEPCK和G6Pase)的蛋白表达水平的影响,其中HePG2为对照组,HePG2+F31为F31处理组,从图2可以看出,灵芝多糖F31能够极其显著地抑制HepG2细胞糖异生关键酶G6Pase的蛋白水平的表达(P<0.01),但是对PEPCK的蛋白表达水平并没有显著改善。
图3是灵芝多糖F31对HepG2细胞糖异生信号分子(AMPK和TORC2)的蛋白和磷酸化蛋白表达水平,其中HePG2为对照组,HePG2+F31为F31处理组,从图3可以看出,灵芝多糖F31能够极其显著地抑制HepG2细胞糖异生信号分子P-AMPK的蛋白表达水平(P<0.01);对于TORC2蛋白,灵芝多糖F31能抑制其表达水平和磷酸化水平,然而对磷酸化TORC2(P-TORC2)的抑制作用并没有达到统计学意义。
图4是灵芝多糖F31对HepG2细胞CREB,PGC-1α,FOXO1和HNF4α的蛋白表达水平的影响,其中HePG2为对照组,HePG2+F31为F31处理组,从图4可以看出,灵芝多糖F31能够极其显著地抑制HepG2细胞糖异生信号通路核转录因子PGC-1α,FOXO1和HNF4α的蛋白表达水平(P<0.05),然而灵芝多糖F31反而使CREB的蛋白表达水平增加了。
四、结论
在体外HepG2细胞实验中,灵芝多糖F31能抑制HepG2细胞的糖异生;能够抑制糖异生关键性酶G6Pase的蛋白水平的表达,能够极其显著地抑制HepG2细胞糖异生信号分子P-AMPK的蛋白表达水平(P<0.01);对于TORC2蛋白,灵芝多糖F31能抑制其表达水平和磷酸化水平,灵芝多糖F31能够极其显著地抑制HepG2细胞糖异生信号通路核转录因子PGC-1α,FOXO1和HNF4α的蛋白表达水平(P<0.05)。推测灵芝多糖F31可以通过激活AMPK/TORC2/PEPCK,G6Pase信号转导通路从而抑制糖异生。
Claims (7)
1.灵芝多糖F31在制备抑制肝脏糖异生药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的应用是灵芝多糖F31是通过抑制G6Pase、P-AMPK的蛋白表达、核转录因子PGC-1α,FOXO1和HNF4α的蛋白表达来抑制肝脏糖异生。
3.一种抑制肝脏糖异生药物,其特征在于,其含有灵芝多糖F31作为活性成分。
4.灵芝多糖F31在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。
5.一种治疗非酒精性脂肪性肝病的药物,其特征在于,其含有灵芝多糖F31作为活性成分。
6.灵芝多糖F31在制备G6Pase、P-AMPK蛋白表达、核转录因子PGC-1α,FOXO1、HNF4α的蛋白表达抑制剂中的应用。
7.一种G6Pase、P-AMPK蛋白表达、核转录因子PGC-1α,FOXO1、HNF4α的蛋白表达抑制剂,其特征在于,其含有灵芝多糖F31作为活性成分。
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