CN108324947A

CN108324947A - 肿瘤坏死因子受体相关因子4及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN108324947A
Application number: CN201810103826.9A
Authority: CN
Inventors: 李红良; 李枫
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2038-02-01
Also published as: CN108324947B

Abstract

本发明公开了肿瘤坏死因子受体相关因子4及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。本发明以人正常肝脏L02细胞系、TRAF4敲低的L02细胞系、原代肝细胞以及TRAF4敲低的原代肝细胞为研究对象，通过棕榈酸酯（PA）及油酸（OA）刺激诱导肝脏细胞脂质堆积模型进而研究TRAF4基因的功能。研究发现，当TRAF4表达下降时，PA+OA刺激诱导的L02细胞脂质聚集显著减少，即TRAF4基因能够促进脂肪肝及相关疾病的发生发展。因此，TRAF4为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物提供靶标。

Description

肿瘤坏死因子受体相关因子4及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种肿瘤坏死因子受体相关因子4(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 4，TRAF4)作为药物靶标在筛选治疗脂肪肝及相关疾病的药物中的功能与应用，以及TRAF4的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。

背景技术

肝脏是机体脂质代谢的中心器官，肝内脂肪主要来源于食物和外周脂肪组织。正常人肝脏组织含有少量的脂肪，其重量约为肝重量的3％-5％，当肝脏对脂肪合成能力增加和(或)转运入血的能力下降时，脂类物质在肝内蓄积过多，超过肝脏重量的5％或组织学上肝细胞有50％以上有脂肪变性时，即可称为脂肪肝。脂肪肝正在严重威胁着人类的健康，目前已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，发病率正在不断上升，发病年龄日趋年轻化。

脂肪肝是由多种疾病和病因引起的肝脏脂肪变性，是一种常见的肝脏病理病变，不是一个独立的疾病。脂肪肝分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝两类，根据脂肪变性在肝脏累积的范围又可分为轻，中，重三型。脂肪肝由多种原因引起，最常见的病因为肥胖、酒精中毒、糖尿病，其次为营养失调、药物中毒、妊娠、遗传等，多数患者伴有高血压、冠心病、动脉硬化等疾病，但其具体的形成机制尚未完全明确。

肿瘤坏死因子受体相关因子4(Tumor necrosis factor receptor-associatedfactor4，TRAF4)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族中的一员，其编码一个由470个氨基酸组成，相对分子质量为54kD的衔接蛋白，在胞浆、细胞核以及细胞膜上均有定位。TRAF4蛋白主要包含3个结构域，从N端到C端依次为一个RING-finger结构域、7个连续的锌指结构域、1个TRAF结构域。关于TRAF4的功能已有许多研究，TRAF4参与胚胎发生^[1]和中枢神经系统髓鞘稳态^[2]，在发育过程中广泛而高度的表达^[3]，TRAF4的缺陷会导致呼吸系统、中轴骨骼和神经系统在发育过程中发生一些变化^[3,4]。TRAF4还能够激活NF-κB信号通路^[6]和JNK信号通路^[7]，调控细胞生长和凋亡^[8]。另外，TRAF4还可以激活RPS6KB1，以响应TNF信号^[9]。但是关于TRAF4与脂肪肝及相关疾病之间的直接关系暂未见报道。

参考文献

[1]Kedinger,V.&Rio,M.C.TRAF4,the unique family member.Advances inexperimental medicine and biology 597,60-71,doi:10.1007/978-0-387-70630-6_5(2007).

[2]Blaise,S.et al.In vivo evidence that TRAF4is required for centralnervous system myelin homeostasis.PloS one 7,e30917,doi:10.1371/journal.pone.0030917(2012).

[3]Regnier,C.H.et al.Impaired neural tube closure,axial skeletonmalformations,and tracheal ring disruption in TRAF4-deficientmice.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 99,5585-5590,doi:10.1073/pnas.052124799(2002).

[4]Shiels,H.et al.TRAF4deficiency leads to tracheal malformation withresulting alterations in air flow to the lungs.The American journal ofpathology 157,679-688,doi:10.1016/S0002-9440(10)64578-6(2000).

[5]Camilleri-Broet,S.et al.TRAF4overexpression is a commoncharacteristic of human carcinomas.Oncogene 26,142-147,doi:10.1038/sj.onc.1209762(2007).

[6]Li,S.et al.Ubiquitin ligase Smurf1targets TRAF family proteins forubiquitination and degradation.Molecular and cellular biochemistry 338,11-17,doi:10.1007/s11010-009-0315-y(2010).

[7]Abell,A.N.&Johnson,G.L.MEKK4is an effector of the embryonicTRAF4for JNK activation.The Journal of biological chemistry 280,35793-35796,doi:10.1074/jbc.C500260200(2005).

[8]Kedinger V.Tumor necrosis factor receptor-associated factor 4is adynamic tight junction-related shuttle protein involved in epitheliumhomeostasis.PloS one,doi:10.1371/journal.pone.0003518.g001(2008).

[9]Fleckenstein,D.S.,Dirks,W.G.,Drexler,H.G.&Quentmeier,H.Tumornecrosis factor receptor-associated factor(TRAF)4is a new binding partner forthe p70S6serine/threonine kinase.Leukemia Research 27,687-694,doi:10.1016/s0145-2126(02)00325-9(2003).

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种TRAF4基因的表达与脂肪肝及相关疾病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝及相关疾病的靶基因TRAF4的新用途，进而把TRAF4基因应用于脂肪肝及相关疾病的治疗中。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明以人正常肝脏L02细胞系、TRAF4敲低的L02细胞系、原代肝细胞以及TRAF4敲低的原代肝细胞为研究对象，通过棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)刺激诱导的肝脏细胞脂质堆积模型研究TRAF4基因的功能。研究发现，当TRAF4表达下降时，PA+OA刺激诱导的L02细胞和原代肝细胞脂质聚集显著减少，即TRAF4基因能够促进脂肪肝及相关疾病的发生发展。

在此基础上，本发明第一方面，提供肿瘤坏死因子受体相关因子4作为药物靶标在筛选保护肝脏的药物中的应用。

本发明第二方面，提供肿瘤坏死因子受体相关因子4作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

本发明第三方面，提供肿瘤坏死因子受体相关因子4的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

优选的，所述肿瘤坏死因子受体相关因子4的抑制剂是抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂、或者抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4的mRNA水平的抑制剂，其抑制活性是可逆的或不可逆的。

优选的，所述抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂包括肿瘤坏死因子受体相关因子4的抗体、抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物、无机物；所述抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂是指可以结合肿瘤坏死因子受体相关因子4但在结合时不产生生物应答的物质，或者所述抑制剂可以阻断、抑制或减弱由激动剂介导的应答，并可与激动剂竞争结合肿瘤坏死因子受体相关因子4。

优选的，所述肿瘤坏死因子受体相关因子4的抗体包括但不限于单克隆抗体、合成抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)(包括双特异性scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和任何上述的表位结合片段。特别地，用于本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。用于本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。优选地，抗体是人或人源化单克隆抗体。

如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从由人基因表达抗体的小鼠或其它动物分离的抗体。

优选的，抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4的mRNA水平的抑制剂可以是其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者其它能够抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4的mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、化合物。

本发明药物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。

本发明的药物可施用于会发生或已经发脂肪肝及相关疾病的任何动物。这些动物包括人类和非人类的动物，例如宠物或牲畜等。

本发明的药物可以本领域已知的途径施用于受试者，包括但不限于口服，胃肠外，皮下，肌内，静脉内，腹腔内，肝内，心肌内，肾内，阴道，直肠，颊，舌下，鼻内，透皮方式等。

施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。

所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现TRAF4的新功能，即TRAF4具有恶化脂肪肝及相关疾病的作用。

(2)基于TRAF4在恶化脂肪肝及相关疾病中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物提供靶标。

(3)TRAF4的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物。

附图说明

图1是在L02细胞中建立的shTRAF4稳转细胞系的Western验证结果。

图2是两种L02细胞系中，油红O染色的结果图。

图3是腺病毒感染小鼠原代肝细胞后的Western Blot检测结果。

图4是两种小鼠原代肝细胞中，油红O染色的结果图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。

细胞培养

人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)，人胚肾HEK293T细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)。上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10％FBS，1％青霉素-链霉素)置于5％CO₂的37℃恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10％DMSO的FBS冻存。

Western blot：

1)制胶

根据目的蛋白大小选择需要的分离胶浓度，一般8％-10％的分离胶可满足大部分实验需求。

2)蛋白提取

细胞用适量RIPA(50mM Tris-HCl PH7.4,150mM NaCl,1％Triton X-100or NP-40,1％Sodium deoxycholate,0.1％SDS,1mM EDTA，使用前加蛋白酶或磷酸酶抑制剂)冰上裂解10-30min；4℃，12000g离心10min，上清即为总蛋白；采用BCA Protein Assay Kit进行蛋白定量，取30-50μg总蛋白进行Western blot分析。

3)上样及电泳

保证上样量及上样体积一致，恒压电泳，上层胶采用80-90V，下层胶采用100V。

4)转膜

配制转膜液，提前预冷；PVDF膜使用前用甲醇浸泡1-2min；转膜，胶在负极侧，膜在正极侧，海绵、滤纸提前浸泡。转膜电压设为250V，电流设为0.2A，转移1.5h。

5)封闭

5％脱脂奶粉(in TBST)于震荡摇床室温封闭1h。

6)一抗孵育

封闭结束后用TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min，加一抗(TRAF4，Abcam，ab190986)，4℃孵育过夜。

7)二抗孵育

一抗孵育后膜用TBST洗3遍，每次5min，加一定比例二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司，BF03008/BF03008X)(in TBST)室温孵育1h。

8)显影。

孵育后用TBST洗涤3次，每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像系统检测目的条带。

TRAF4敲低质粒构建：

1)从上海毅乐生物科技有限公司订购两条shRNA序列：

5’-CCGGGAGAGTGTCTACTGTGAGAATCTCGAGATTCTCACAGTAGACACTCTCTTTTTG-3’；

5’-CCGGCCAGGACATTCGAAAGCGAAACTCGAGTTTCGCTTTCGAATGTCCTGGTTTTTG-3’。

2)将上述两条寡聚核苷酸分半加无菌水溶解，终浓度为100mM，进行融合；

3)将所得DNA产物和限制性内切核酸酶FastDigest restriction enzymes(Thermo)、 buffer或者 Green buffer、ddH₂O混合均匀(50μl体系)，置于37℃条件下反应。使用 AxyPrep^TM PCR Clean-Up Kit(Axygen)回收酶切产物；

4)使用 PCR一步定向克隆试剂盒(Novoprotein)，按照试剂盒说明书进行重组反应；

5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于37℃培养箱，过夜培养；

6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落PCR阳性克隆；

7)将菌液吸取60μl接种至6ml LB(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；

8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒DNA小提试剂盒)；

9)提取后的质粒可直接用于L02细胞瞬转或构建慢病毒稳转细胞系。

pLKO.1/shTRAF4稳转细胞系建立：

1)慢病毒载体构建和包装：

①用胰酶消化并记数HEK293T细胞，按1×10⁶个HEK293T/孔传至6孔板中；

②第二天细胞汇合度至80％时开始转染；

③取1.5ml灭菌EP管，加入2个包装质粒(pSpax2，1.5μg和pMD2.G，0.5μg)和pLKO.1/shTRAF4质粒2μg溶于250μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。

④取1.5ml灭菌EP管，取10μl Zlipo-2000溶于250μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。

⑤将DNA溶液和Zlipo-2000溶液轻柔混匀，室温孵育15min；

⑥将上述DNA-Zlipo-2000混合液，逐滴加入6孔板中；

⑦转染6h后，换新鲜培养基；

⑧转染后48h和72h收获含病毒的上清，用0.45μm的滤膜过滤；

⑨过滤后的病毒可立即用于感染或-80℃贮存。

2)L02细胞感染

将病毒液与待感染细胞(和普通转染密度一致)培养基混合，混合比率取决于病毒滴度和细胞承受能力(一般六孔板每孔500μl病毒液)，并随后加入聚凝胺polybrene(8mg/ml)2.5μl，使其终浓度为8μg/ml。混匀后，常温，3000rpm，离心1.5h。感染后最快2h即可换液终止感染，若细胞承受力强，最长可持续感染24h。感染24h后，进行第二次感染。感染时设置空白孔作为对照。

3)细胞筛选

感染48h后，加入puromycin进行细胞筛选，(一般细胞的耐药浓度是2μg/ml，为最低致死浓度，可使未转染的正常细胞完全死亡，而转染过的细胞不死亡的最小药物浓度)，一般加药24-36h后就可以看到细胞的死亡。空白孔细胞全部死亡后，收集六孔板中目的细胞，部分传代，部分做Western Blot进行稳转细胞验证。确定细胞筛选成功后，扩大培养，进行后续实验。

原代细胞分离培养：

采用Ⅳ型胶原酶消化法分离小鼠原代肝细胞。C57BL/6小鼠乙醚吸入麻醉，留直针穿刺门静脉，肝脏原位灌流(SC-1和SC-2轮流灌注)至肝脏消化完全，取下肝脏，反复吹打并过滤，收集肝细胞悬液。离心收集肝细胞于鼠尾胶包被的培养皿中，加完全培养基培养，6h后换液去除死细胞，继续培养。

1)培养皿包被(以六孔板为例)

①配适量的1×鼠尾胶(现用现配)：

用灭菌的超纯水将无水乙醇稀释为30％乙醇后，0.22μm滤器过滤，然后将100×的鼠尾胶稀释为1×。

②将200μl 1×鼠尾胶加入到培养皿，晃动，铺匀(要保证孔底每个地方都能接触到鼠尾胶)。

③开盖，在超净台吹风过夜。

2)细胞铺板

①鼠尾胶包被的培养皿开盖，紫外照射30min。

②台盼蓝染色进行细胞计数，根据实验目的，调整细胞密度，进行细胞铺板。

③铺板后2h换液。

④细胞大约6-8h贴壁，贴壁后即可进行后续操作。

腺病毒感染：

1)腺病毒由汉恒生物科技有限公司构建，共三条，分别是：HBAD-m-TRAF4shRNA1-GFP(07060207)、HBAD-m-TRAF4shRNA2-GFP(07060208)、HBAD-m-TRAF4 shRNA2-GFP(07060209)；

2)饥饿：

腺病毒感染前，弃去培养基，PBS洗一次，换成无血清的DMEM，使细胞饥饿过夜(12h)。

3)腺病毒感染：

饥饿后，将DMEM换成完全培养基，选择合适的MOI值(50-100)，根据腺病毒的滴度，添加合适量的腺病毒至培养皿中。

4)感染4-8h后换液。

油红O染色：(以六孔板为例)

1)细胞用1×PBS洗涤3次，加入1.5ml 4％多聚甲醛，37℃温箱固定15min；

2)加入1×PBS洗涤3次后，加入60％异丙醇(PBS:异丙醇＝2:3)漂洗30s；

3)加入1×PBS洗涤3次，通风橱吹干；

4)配置油红O工作液(PBS:油红＝2:3)，配置好之后静置10min；

5)每孔加入400μl油红O工作液染色1min；

6)(可选)加入1×PBS洗涤3次，60％异丙醇进行分选；

7)加入1×PBS洗3次；PBS浸润镜检，拍照。

【实施例1】在人肝细胞系L02细胞中，建立TRAF4敲低(shTRAF4)的稳转细胞系

根据实施方式中L02稳转细胞系建立的步骤，建立TRAF4敲低(shTRAF4)的稳转细胞系。之后收集细胞，Western Blot验证TRAF4的表达情况。结果如图1所示，可见感染shTRAF4慢病毒系统的L02细胞中，TRAF4的表达显著降低，说明细胞系建立成功。

【实施例2】在人肝细胞系L02细胞中，TRAF4敲低对肝细胞脂肪堆积的影响

L02细胞分为6组：pLKO.1对照组、shTRAF4对照组、pLKO.1实验组×2、shTRAF4实验组×2。细胞贴壁后向实验组中分别加入棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)(PA 0.1mM+OA 0.2mM)、(PA 0.2mM+OA 0.4mM)刺激，对照组中加入同等量的BSA，12h后进行油红O染色。

油红O染色结果如图2所示，对照组细胞无明显着色，而当加入PA+OA刺激后，被油红O染色的细胞相比于对照组显著增多，且shTRAF4实验组着色面积的增加程度较pLKO.1实验组小。该结果说明，TRAF4表达的下降可抑制PA刺激的L02细胞脂质堆积。

【实施例3】在小鼠原代肝细胞中，TRAF4敲低对原代肝细胞脂肪堆积的影响1)将由汉恒公司构建的3种腺病毒感染小鼠原代肝细胞，完成后Western Blot检测TRAF4的表达，结果如图3所示，可见，shTRAF4-3的腺病毒效果最明显。

2)将小鼠原代肝细胞分为2组：NC组，shTRAF4-3组。腺病毒感染36h后，加入棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)(PA 0.1mM+OA 0.2mM)，作用12h后进行油红O染色。

油红O染色结果如图4所示，加入PA+OA刺激后，NC组细胞着色明显，而shTRAF4-3组着色面积较NC组明显减少。该结果说明，在小鼠原代肝细胞中，TRAF4表达的下降可抑制PA+OA刺激导致的脂质堆积。

上述结果显示TRAF4基因敲低可显著抑制肝细胞脂质堆积，抑制脂肪肝及相关疾病的发生发展，TRAF4基因对脂肪肝及相关疾病具有显著的恶化作用。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 肿瘤坏死因子受体相关因子4及其抑制剂在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgggagagt gtctactgtg agaatctcga gattctcaca gtagacactc tctttttg 58

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggccagga cattcgaaag cgaaactcga gtttcgcttt cgaatgtcct ggtttttg 58

Claims

1.肿瘤坏死因子受体相关因子4作为药物靶标在筛选保护肝脏的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的保护肝脏的药物是抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4表达的药物。

3.肿瘤坏死因子受体相关因子4作为药物靶标在筛选制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物是抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4表达的药物。

5.肿瘤坏死因子受体相关因子4的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤坏死因子受体相关因子4的抑制剂是抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂、或者抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4的mRNA水平的抑制剂，其抑制活性是可逆的或不可逆的。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂包括肿瘤坏死因子受体相关因子4的抗体、抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物、无机物；所述抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂是指可以结合肿瘤坏死因子受体相关因子4但在结合时不产生生物应答的物质，或者所述抑制剂可以阻断、抑制或减弱由激动剂介导的应答，并可与激动剂竞争结合肿瘤坏死因子受体相关因子4。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4的mRNA水平的抑制剂是其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者其它能够抑制肿瘤坏死因子受体相关因子4的mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、化合物。

9.权利要求3-8任一项所述的应用，其特征在于，脂肪肝及其相关疾病包括但不限于：单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。