CN105779386B - 一种间充质干细胞在制备治疗m5型白血病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞在制备治疗M5型白血病药物中的应用。本发明提供的间充质干细胞是特定的炎性因子TNF‑α和IFN‑γ刺激后得到的间充质干细胞；所述间充质干细胞诱导肿瘤细胞凋亡的能力是通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL来实现的；所述间充质干细胞为离体间充质干细胞。TNF‑α和IFN‑γ的刺激使间充质干细胞表达TRAIL的能力显著提高，抗肿瘤能力显著增强，相较化疗，间充质干细胞移植的毒副作用更低，且其低的免疫原性也大大降低移植物抗宿主病的发病率，满足临床需求，为干细胞移植治疗提供了新的思路。可在制备治疗M5型白血病药物中应用。

Description

一种间充质干细胞在制备治疗M5型白血病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞在制备治疗M5型白血病药物中的应用。

背景技术

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一类常见的造血系统恶性肿瘤，具有进展快、病情重、死亡率高等特征，严重威胁人们的健康。急性单核细胞白血病(Acute Monocytic Leukemia，M5)是AML中较常见的类型，在我国，AML中M5发病率仅次于M2，占AML的23.2％-26.9％。大多数M5患者临床表现为白细胞过多症，易发生髓外浸润(包括肝、脾、淋巴结、齿龈、皮肤、中枢神经系统等)，不良染色体核型比率高、完全缓解(Complete Remission，CR)率低、易复发、预后不佳等。M5的异质性和复杂性决定其尚缺乏分子诊断和靶向治疗的特异性肿瘤相关标志物。

目前针对该白血病，国内仍以化疗为主要治疗手段，但化疗药物在杀伤白血病细胞的同时，常常对正常细胞、组织也有毒性损伤；此外，化疗过程中所出现的胃肠道反应、骨髓抑制、心肝肾等脏器损伤、出血、感染等毒副作用，使相当数量患者不能耐受。另外，异基因造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation，HSCT)显示有效的抗白血病作用，但因其配型困难，费用昂贵，更重要的是本体存在一些危及生命的并发症，如移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease，GVHD)，使得该项治疗方案仅适于少部分年轻合适的患者，大部分患者还不能接受本项治疗。随着医学科学的不断发展，诊疗水平的日益提高，白血病患者检出率显著增多，亟需一种有效、安全、经济且来源广泛的新药来治疗该项疾病。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)存在于几乎所有的组织中，并且已从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘和羊膜液中分离出。MSCs不仅具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，还具有免疫调控能力和低的免疫原性等特性，是移植领域应用前景广阔的再生来源细胞，也因此受到越来越多的生物学领域科学家和医学研究人员的青睐；目前已有大量研究显示MSCs具有一定的疾病治疗潜能，其中包括中风、脊髓损伤、帕金森症、自身免疫性疾病以及肿瘤等。

脐带来源的间充质干细胞是正常妊娠分娩过程中的副产品，便于取材，可用酶消化法等多种成熟的手段从新生儿脐带组织中获得，对供者不造成创伤以及无伦理道德制约，生物学特征与其它来源的间充质干细胞基本一致，由于其来源的广泛性，取材的无创性和简易性，病毒污染率低(由于胎血屏障的存在)和良好的体外扩增能力，使得脐带来源的间充质干细胞在医学上具有更为广阔的应用前景。

发明内容

本发明需要解决的问题是间充质干细胞在制备治疗M5型白血病药物中的应用。

本发明的技术方案：

1.本发明所述间充质干细胞是人脐带组织来源的间充质干细胞，并且该间充质干细胞需在体外进行特定炎性因子TNF-α(40ng/ml)和IFN-γ(100ng/ml)的联合刺激处理，使其高表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL，进而来发挥诱导急性单核白血病细胞凋亡的功能，使肿瘤细胞的凋亡率提升了约30％，从而在制备治疗M5型白血病的药物中发挥重要的作用。

2.本发明所述间充质干细胞的分离及原代培养方法：

本发明所述的脐带间充质干细胞的分离及原代培养的方法为：取新生婴儿脐带组织，无菌条件下清洗干净并去除脐静脉和脐动脉，剩余的华通氏胶剪碎成1-2mm³的小块，采用酶消化法进一步分离间充质干细胞，得到的细胞用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的α-MEM培养基重悬，接种于细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中贴壁培养，3-4天后首次换液，以后隔天换液，待细胞长至80％丰度时，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的细胞消化液消化细胞，重悬细胞，然后接种到新的培养皿中，传代细胞。待细胞长至90％融合后，进行下一次传代培养。

3.本发明所述脐带间充质干细胞的鉴定方法：

1)流式细胞术鉴定MSCs细胞表面标志物：取长至90％融合的P4-P6代的间充质干细胞，用细胞消化液消化下细胞，重悬细胞，离心弃上清，用PBS洗两遍后，用PBS重悬成1-2×10⁶/ml的单细胞悬液，每个流式管中分装0.1ml；分别加入荧光标记抗体CD14-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC、IgG1,κ-FITC、IgG2α，κ-FITC，冰上避光染色；PBS洗去未结合的抗体，然后加入500ulPBS重悬，上机检测；

2)MSCs成骨分化鉴定：采用广州赛业生物的MSCs成骨分化诱导培养基以及诱导方案进行诱导鉴定。

4.本发明所述TNF-α和IFN-γ对脐带间充质干细胞的刺激方法：

在间充质干细胞的细胞培养上清中加入炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ刺激间充质干细胞24h，所述TNF-α的用量为40ng/ml，IFN-γ的用量为100ng/ml；其中细胞培养上清为含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的α-MEM培养基。

5.本发明所述检测刺激后间充质干细胞中TRAIL的表达方法：

首先设计实验组别，单独的TNF-α刺激组，单独的IFN-γ刺激组，TNF-α和IFN-γ共同刺激组，以及未刺激的MSCs组；

1)间充质干细胞经TNF-α和IFN-γ刺激24h后，提取总RNA经行反转录，以未加处理的间充质干细胞作为对照，再以反转录得到的cDNA为模板，进行Real-time quantitativePCR实验，检测TRAIL的转录情况，以人源GAPDH作为内参；

2)间充质干细胞经TNF-α和IFN-γ刺激24h后，提取总蛋白质，以未加处理的间充质干细胞作为对照，进行western blotting实验，检测TRAIL的蛋白表达情况，以GAPDH作为内参。

6.本发明所述的间充质干细胞体外诱导急性单核白血病细胞凋亡的检测方法：

取长至90％融合的P4-P6代的间充质干细胞，消化下来，传代细胞，以10⁵/孔的数目接种到12孔板中，放到培养箱中细胞贴壁生长12h，设置两组，TNF-α和IFN-γ联合刺激的MSCs组，以及未刺激的MSCs组，其中TNF-α和IFN-γ的终浓度分别为40ng/ml和100ng/ml；待刺激24h后，吸去培养上清，PBS洗2遍，在每组MSCs孔中直接铺入3×10⁵个急性单核白血病细胞(THP-1细胞株，U937细胞株，人M5型白血病原代细胞)，进行体外共培养实验，以单独培养的急性单核白血病细胞(THP-1细胞株，U937细胞株，人M5型白血病原代细胞)为对照；共培养24h后，收取上层急性单核白血病细胞(THP-1细胞株，U937细胞株，人M5型白血病原代细胞)到1.5ml EP管中，PBS洗两遍，以单独培养的急性单核白血病细胞(THP-1细胞株，U937细胞株，人M5型白血病原代细胞)为对照，用BD公司的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，检测共培养后肿瘤细胞的凋亡比例。

7.本发明所述的收集炎性因子刺激过后的脐带间充质干细胞的方法：

用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的细胞消化液消化细胞，制备成细胞悬液，以1000r/min离心5min，收集细胞沉淀，用生理盐水重悬，再离心弃去上清，收集沉淀的间充质干细胞备用；进一步的，收集的间充质干细胞的活力保持在95％以上。

8.本发明所述的用于治疗M5型白血病的间充质干细胞进行外周静脉输注的有效剂量为(5-10)×10⁶/kg。该有效剂量是通过大量的动物模型试验取得治疗效果而确定的。

本发明的有益效果是：

1)本发明中，TNF-α和IFN-γ的联合刺激，使人脐带来源MSCs表达TRAIL的能力显著提高，相对于重组细胞，不需要脂质体转染，方便快捷；

2)本发明中，经TNF-α和IFN-γ联合刺激而制备的MSCs，其诱导急性单核白血病细胞凋亡的能力显著提高，被该MSCs诱导后发生凋亡的急性单核白血病细胞的比例增加了约30％；当用于静脉治疗时，相对于传统的化疗，避免了化疗药物对正常组织的毒副作用；而相对于骨髓移植治疗，MSCs的免疫原性低，大大降低移植物抗宿主病的发病率，满足临床需求。本发明所述间充质干细胞可在制备治疗M5型白血病药物中发挥应有的作用。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下将以本发明的较佳实施案例并配合附图进行详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1为MSCs的流式鉴定，流式检测标记物CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45的表达；MSCs成骨细胞的诱导分化鉴定；

图2为TRAIL在不同的炎性因子处理组MSCs和对照组MSCs中的mRNA转录水平对比；

图3为TRAIL在不同的炎性因子处理组MSCs和对照组MSCs中的蛋白表达水平对比；

图4为MSCs体外诱导急性单核白血病细胞凋亡的能力检测；

图5为MSCs静脉输注后对小鼠的白血病抑制作用检测。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：脐带间充质干细胞的分离及传代培养

1)取新生婴儿的脐带组织，在超净工作台中，先将脐带放入培养皿中用含0.1％双抗的PBS清洗干净，然后放入α-MEM培养基中，将脐带沿外壁剪开，剥离三条血管，将其中的华通氏胶及脐带壁剪碎成1-2mm³的组织块，等待消化；

2)配置组织消化酶(Ⅱ型胶原酶250U/ml，中性蛋白酶100U/ml，透明质酸酶10U/ml)，37℃溶解于α-MEM培养基，用0.22μm的滤器，过滤除菌备用；

3)将1)中剪碎的组织块与2)中配置的组织消化酶溶液按1:1的体积比例混合于50ml离心管中，置于37℃摇床中，200rpm振荡，消化3h左右，待组织块基本消化完全即可；

4)将消化后的组织液4℃，300g离心5min，弃上清。将沉淀用PBS重悬于50ml新鲜的α-MEM培养基中，4℃，300g离心5min，弃上清。同样的方式用PBS洗两次，最后一遍离心后，弃上清。将沉淀重悬于含有10％胎牛血清、1％双抗的α-MEM培养基中，接种于细胞培养皿中，放置在37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中静置贴壁培养；

5)3-4d左右，轻柔地吸取培养皿中约1/2培养液，再补加入新鲜的含有10％胎牛血清、1％双抗的α-MEM培养基，隔天换液，MSC细胞会在沿着贴壁的组织块或者贴壁的细胞长出；

6)待细胞长至80％丰度时，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA细胞消化液消化下细胞；重悬细胞，1000rpm/min离心5min，弃上清，同样的方式用PBS洗一遍，离心后弃上清，获得的细胞沉淀用新鲜的培养基重悬，然后接种到新的培养皿中，传代细胞。待细胞长至90％融合后，进行下一次传代培养。

实施例2：脐带间充质干细胞的鉴定

1)流式细胞术鉴定MSCs细胞表面标志物：取P4-P6代长至90％融合的MSCs，用细胞消化液消化后重悬离心，细胞沉淀用PBS重悬成1-2×10⁶/ml的单细胞悬液，每个流式管中分装0.1ml；分别加入荧光标记抗体CD14-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC、IgG1,κ-FITC、IgG2α，κ-FITC，冰上避光孵育40min；PBS洗去未结合的抗体，然后加入500ulPBS重悬，上机检测；其中CD14-FITC以IgG2α，κ-FITC为同型对照，其余的均以IgG1,κ-FITC为同型对照；鉴定结果见图1，标记物CD73、CD90、CD105表达在90％以上，CD14、CD34、CD45表达在5％以下；

2)MSCs成骨分化鉴定：采用广州赛业生物的MSCs成骨分化诱导培养基以及诱导方案进行诱导鉴定，鉴定结果见图1。

实施例3：Real-time quantitative PCR实验检测TRAIL的表达

1)取P4-P6代长至90％融合的MSCs，消化下细胞，重新接种到6孔细胞培养板中，2×10⁵/每孔，每孔2ml含有10％胎牛血清、1％双抗的α-MEM培养基，放置在37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中贴壁培养12h后，加入炎性因子刺激，设置4个组别，单独加TNF-α刺激组，单独加IFN-γ刺激组，TNF-α和IFN-γ联合刺激组，以及未刺激的对照组，其中TNF-α和IFN-γ的终浓度分别为40ng/ml和100ng/ml；

2)炎性因子刺激24h后吸去培养基，6孔板中每孔加1ml Trizol，反复吹打，裂解细胞5min，把Trizol液转移到1.5ml的RNase free的EP管中；

3)按200ul/ml Trizol加氯仿，用手晃混匀，室温放置15min，4℃12000g离心15min，离心后分三层，RNA存在于上层水相中，吸取上层水相到另一新的RNase free EP管中；

4)按500ul异丙醇/ml Trizol加异丙醇，用手来回晃混匀，室温放置10min，4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

5)用DEPC水配75％的乙醇，按1ml 75％乙醇/ml Trizol加乙醇，用手轻晃EP管悬浮沉淀，4°8000g离心5min，弃尽上清，室温晾干，约10min；

6)用50ulDEPC水溶解RNA，56℃水浴10min，涡旋混匀，用核酸定量仪测定RNA浓度；

7)用以上提取的总RNA作为模板，采用如下表1所示的反转录体系及程序进行反转录；

表1：

X是2ug RNA的体积；按25℃-10min，45℃-50min，85℃-5min的程序在PCR仪中进行反转录，得到cDNA产物放到4℃备用；

8)用上述步骤获得的cDNA为模板进行下一步的Q-pcr检测，Q-pcr体系如下表2所示；

表2：

上述cDNA模板是7)步中反转录得到的cDNA用ddH₂O稀释3倍后的产物，Q-pcr程 序用罗氏推荐的程序，Q-pcr仪品牌是Bio-Rad；

9)上述步骤8)中所用的人源Q-pcr引物如下表3所示；

表3：

10)Real-time Q-pcr实验检测TRAIL表达的结果见附图2所示，单独的IFN-γ刺激以及TNF-α和IFN-γ联合刺激能显著上调MSCs中TRAIL的转录水平，差别有统计学意义(P＜0.01)。

实施例4：Western blotting实验检测TRAIL的表达

1)取P4-P6代长至90％融合的MSCs，消化下细胞，重新接种到6孔细胞培养板中，2×10⁵/每孔，每孔2ml含有10％胎牛血清、1％双抗的α-MEM培养基，放置在37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中贴壁培养12h后，加入炎性因子刺激，设置4个组别，单独加TNF-α刺激组，单独加IFN-γ刺激组，TNF-α和IFN-γ联合刺激组，以及未刺激的对照组，其中TNF-α和IFN-γ的终浓度分别为40ng/ml和100ng/ml；

2)炎性因子刺激24h后吸去培养基，PBS洗一遍，用细胞消化液消化下细胞，重悬，离心，弃上清，加入50ul细胞全蛋白裂解液(含25×Roche蛋白酶抑制剂)，吹打混匀，放在冰上裂解10-15min；

3)4℃，12000g离心10min，吸取上清到另一新的1.5mlEP管中，即为提到的蛋白，冻存在-40°冰箱中备用；

4)用BCA法测定出蛋白浓度，每个样品每管分装50ug用于western blot检测；

5)配制12％的SDS-PAGE，待胶凝固后，备用；

6)在上述步骤4)中分装好的50ug样品中加入相应体积的5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，涡旋混匀后再离心把样品甩到管底，沸水浴煮蛋白10min(使蛋白变性)，取出，再次离心把样品甩到管底，准备上样；

7)取步骤5)配制的SDS-PAGE放到电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，拔去梳齿，上样，样品全部加到孔中，Marker上样5ul；

8)把电泳槽接到电泳仪上，打开电源，电压调到80V，跑电泳30min，使样品聚集到浓缩胶的底部；

9)30min后把电压调到110V，跑电泳约2h，使样品在分离胶上分离；

10)电泳结束后准备转膜，剪取4cm×5cm的PVDF膜，做好标记后放到甲醇中活化1min，另剪取同样大小的滤纸，备用；

11)准备好转膜缓冲液，待电泳结束后，取出电泳架，卸下玻璃胶板，用水冲洗干净， 用启胶板启开合在一起的两块玻璃板，切取4cm×5cm大小的胶块(与膜面积大小一致)做好标记，连同滤纸，活化好的PVDF膜一起放到转膜缓冲液中，浸泡15min左右；

12)用石墨转膜仪转膜50min；

13)提前用TBST配好5％的牛奶，待转膜结束后，快速的把PVDF膜转移到牛奶中，放置在摇床上封闭1h；

14)牛奶封闭结束后，包一抗，4℃孵育过夜；

15)包一抗过夜后取出膜，用配好的TBST放置在摇床上洗5遍，每遍5min；

16)包二抗，室温放置在摇床上孵育2h；

17)包二抗后取出膜，用配好的TBST放置在摇床上洗5遍，每遍5min；

18)配制辣根过氧化酶底物试剂，与洗好的膜反应5min后在化学发光仪上曝光，检测目的条带；

19)曝光后，取出膜，用一抗-二抗洗脱液洗脱30s，洗脱后的膜放在5％的牛奶中封闭30min，取出膜，包GAPDH抗体，室温放置在摇床上孵育2h，孵育结束后如上所述方式洗膜，与辣根过氧化酶底物试剂反应5min，然后用化学发光仪曝光，检测目的条带；

20)Western blot实验检测TRAIL表达结果见附图3所示，TNF-α和IFN-γ联合刺激能显著提高MSCs中TRAIL的蛋白表达量，差别有统计学意义(P＜0.001)。

实施例5：流式细胞术检测MSCs体外诱导急性单核白血病细胞凋亡的能力

1)体外建立MSCs与急性单核白血病细胞共培养模型，取P4-P6代长至90％融合的MSCs，消化下细胞，重新接种到12孔板中，1×10⁵/每孔，每孔1ml含有10％胎牛血清、1％双抗的α-MEM培养基，放置在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中贴壁培养12h后，设置两组，TNF-α和IFN-γ联合刺激组，以及未刺激的对照组，其中TNF-α和IFN-γ的终浓度分别为40ng/ml和100ng/ml；

2)刺激24h后，在每组MSCs孔中直接铺入3×10⁵个急性单核白血病细胞(THP-1细胞株，U937细胞株，人M5型白血病原代细胞)，以单独培养的急性单核白血病细胞(THP-1细胞株，U937细胞株，人M5型白血病原代细胞)为对照；

3)共培养24h后，收取上层急性单核白血病细胞到1.5ml EP管中，PBS洗两遍，取细胞沉淀备用；

4)凋亡检测使用BD公司的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒；

5)在上述3)步骤收集的细胞沉淀中加入100ul 1×Binding Buffer重悬细胞；

6)在100ul细胞悬液中加入5ul Annexin V-FITC和5ul PI Staining Solution，用枪头轻轻吹吸混匀，避光、室温反应10-20min。

7)再补加入400ul 1×Binding Buffer到染好的细胞悬液中，轻轻吹吸混匀，最后把所有500ul细胞液转移到流式管中，做好标记，准备检测；

8)样品在1小时内用流式细胞仪检测，在FL1通道下检测Annexin V-FITC，FL3通道下检测PI；

9)检测MSCs体外诱导急性单核白血病细胞凋亡的结果如图4所示，未处理的MSCs能显著诱导急性单核白血病细胞凋亡，而经TNF-α和IFN-γ联合刺激后的MSCs诱导急性单核细胞白血病细胞凋亡的能力比未处理的MSCs要高出10％左右，差别有统计学意义(P＜0.01)。

实施例6：MSCs对小鼠白血病的抑制作用检测

1)NOD/SCID mouse购自南京大学模式动物研究中心，在SPF级条件下饲养，动物6-8周龄，所有实验操作都符合南京大学实验动物条例；

2)构建急性单核白血病小鼠模型：U937细胞株，10⁷/只，尾静脉注射构建急性单核白血病动物模型，所构模型在发病后进行了骨髓肿瘤细胞浸润检测，髓外脏器肿瘤细胞浸润检测，外周血中肿瘤细胞比例检测等，评估结果显示，所构白血病模型符合白血病的病理学特征，模型构建成功；

3)把构建好的白血病小鼠随机分组，每组5-8只，分成4组，以注射生理盐水的sham组为对照；

4)治疗组别为：炎性因子TNF-α和IFN-γ联合刺激的MSCs治疗组，炎性因子TNF-α和IFN-γ联合刺激的MSCs并联合阿糖胞苷(Ara-c)治疗组，以及单独的阿糖胞苷(Ara-c)治疗组；

5)治疗方式为，白血病细胞静脉输注1周后开始进行治疗，MSCs静脉注射治疗2次，每周1次，每次输注剂量为10⁷/kg；阿糖胞苷化疗剂量为40-60mg/kg，每两天一次，持续两周；

6)待到明显观察到小鼠出现弓背，体重减轻等现象时，统一处死小鼠，流式细胞术检测外周血中CD45+的肿瘤细胞的比例，骨髓中CD45+肿瘤细胞的比例；取小鼠脏器称重，观察各脏器的肿大情况，福尔马林固定脏器组织后，送检，做石蜡切片，病理分析各脏器中肿瘤细胞的浸润情况及脏器损伤情况；

7)结果如图5所示，白血病组外周血及骨髓中都有大量CD45+肿瘤细胞，另外各脏器中也有大量的肿瘤细胞浸润；而治疗后，外周血和骨髓中肿瘤细胞的比例显著下降，各脏器浸润的肿瘤细胞也有明显的减少；差别有统计学意义(P＜0.05)

以上所述仅为本发明的优选实例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种间充质干细胞在制备治疗M5型白血病药物中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞在受到特定的炎性因子TNF-α和IFN-γ的联合刺激后，能高表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL，诱导M5型白血病细胞凋亡；所述间充质干细胞是人脐带来源的间充质干细胞；所述间充质干细胞通过外周静脉输注治疗M5型白血病，有效剂量为5×10⁶个细胞/kg体重-10×10⁶个细胞/kg体重。