CN108210884A - 含otu功能域的泛素醛结合蛋白1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 - Google Patents
含otu功能域的泛素醛结合蛋白1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。本发明以正常人肝细胞L02细胞系为研究对象,利用慢病毒构建OTUB1敲除及过表达载体系统,得到OTUB1基因敲除或过表达的L02细胞。通过棕榈酸(PA)、油酸(OA)联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究OTUB1基因在脂肪变性中的功能。结果显示,在相同的PA+OA刺激下,与OTUB1基因正常表达的L02细胞相比,OTUB1基因敲除的L02细胞内红色脂肪滴大而多;相反的,OTUB1基因过表达的L02细胞内红色脂肪滴小而少。结果表明OTUB1基因能显著抑制肝脏脂质沉积,抑制脂肪肝的发生。
Description
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域,特别涉及一种去泛素化酶,即含OTU 功能域的泛素醛结合蛋白1(OTU Domain-Containing Ubiquitin Aldehyde-Binding Protein 1,OTUB1)在脂肪肝中的功能和应用,以及OTUB1作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史,以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征[1][2]。随着人类社会经济发展和医疗水平的提高,多种慢性肝病发病率保持稳定甚至下降,而 NAFLD的发病率却呈现快速上升的趋势。最新流行病学调查显示,NAFLD是世界范围内慢性肝病的首要病种,在普通人群中发病率为25%-30%,其中 10%-20%病人发展为非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH),即以肝脏脂肪变性、炎症和纤维化为主要特征的肝脏疾病[3][4]。据统计,NAFLD 的单纯脂肪变性与严重肝脏疾病的发病率和病死率并无显著相关,但进展到 NASH则显著增高肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌等疾病的发病风险[5][6]。在NASH 病人中15%-50%出现肝纤维化,7%-25%则出现肝硬化及更为严重的肝细胞癌[7]。然而,针对该疾病目前尚无确证的临床用药和治疗手段[3][8]。由于发病率高、并发症多、死亡率高等特点,NASH及其导致的肝脏和代谢性疾病给家庭和社会带来巨大的经济负担,并成为威胁我国居民健康和社会发展的重大公共卫生问题。因此,寻求积极有效的NASH预防措施和治疗手段迫在眉睫。
OTUB1是半胱氨酸蛋白酶OTU超家族中的一员。其编码的蛋白可以从多聚泛素链上切除泛素基团,是一个高度特异性的泛素肽酶。OTUB1在不同的信号通路中都发挥了重要的生物学功能。首先,OTUB1参与炎症反应,可以和泛素化E3连接酶TRAF3相互作用而抑制免疫系统中IRF3基因的表达[8]。其次, OTUB1在肿瘤的发生发展过程中也起到了十分重要的作用。它可以通过和RAS 蛋白相互作用而稳定RAS蛋白并且激活RAS信号通路,从而促进了肿瘤细胞生长[9]。而另一方面,OTUB1能够稳定p53的蛋白水平并且激活DNA损伤信号通路[10]。但是关于本发明OTUB1在NAFLD中的功能及其应用目前尚未见报道。
参考文献
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发明内容
为解决现有技术的缺陷和不足,本发明旨在提供一种OTUB1基因的表达与脂肪肝之间的相互关系,提供一个用于治疗脂肪肝的靶基因OTUB1的新用途,进而把OTUB1基因应用于脂肪肝的治疗中。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
本发明第一方面,提供含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备保护肝脏的药物中的应用。
优选地,所述药物具有抑制肝脏脂质堆积的功能。
本发明第二方面,提供含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。
本发明涉及的含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用,所述的药物的活性成分是含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1。
本发明涉及的含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用,具体的是含OTU功能域的泛素醛结合蛋白 1作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物,所述药物是提高含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1表达量的试剂。
优选地,提高含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1表达量的试剂,给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG 修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法,或蛋白微球制剂皮下注射法。
所述的含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1或OTUB1,包括基因或蛋白。所述的OTUB1基因在对象体内经转录翻译为含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1 蛋白产物。
所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于:胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎,肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
本发明通过试验确定了含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1的表达与脂肪肝及相关疾病之间的关系:
本发明以正常人肝细胞L02细胞系为研究对象,利用慢病毒构建OTUB1敲除及过表达载体系统,得到OTUB1基因敲除或过表达的L02细胞。通过棕榈酸(palmitate)、油酸(oleic acid)(PA+OA)联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究 OTUB1基因在脂肪变性中的功能。结果显示,在相同的PA+OA刺激下,与OTUB1基因正常表达的L02细胞相比,OTUB1基因敲除的L02细胞内红色脂肪滴大而多;相反的,OTUB1基因过表达的L02细胞内红色脂肪滴小而少。结果表明OTUB1基因能显著抑制肝脏脂质沉积,抑制脂肪肝的发生。
本发明人的研究证明了:在PA+OA联合刺激诱导的L02细胞脂肪肝体外模拟模型中,OTUB1具有抑制脂质沉积、保护肝细胞的作用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明发现OTUB1基因的新功能,即OTUB1基因具有能够保护脂肪肝的作用。
(2)基于OTUB1在保护脂肪肝中的作用,其可以用于制备预防、缓解和/ 或治疗脂肪肝的药物。由于OTUB1是机体内源性蛋白质,因此作为药物的安全性很高。
附图说明
图1是OTUB1稳定过表达(左)及敲低(右)L02细胞系的WB鉴定结果图;
图2是OTUB1稳定敲低L02细胞系在PA+OA刺激之后的油红O染色结果图;
图3是OTUB1稳定过表达L02细胞系在PA+OA刺激之后的油红O染色结果图;
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明中的实验所涉及的试剂在国内外市场购买,或按照说明书中的配方自行配制;未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。
实验用细胞及培养:
人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6),人胚肾 HEK293T细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection,ATCC)。上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10%FBS,1%青霉素-链霉素)置于5% CO2的37℃恒温细胞专用培养箱培养,实验用细胞培养时间不超过三个月,每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10%DMSO的FBS冻存。
Western blot实验操作过程:
1)细胞中蛋白提取
细胞加入裂解液,裂解完成后离心取上清,运用BCA Protein Assay Kit定量收集蛋白样品。
2)上样与电泳
配置好电泳凝胶,并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到SDS-PAGE 胶加样孔内,点样完成后开始电泳。
3)转膜
①配制转膜液,于4℃预冷。
②将PVDF在甲醇中浸泡15s后放入转膜液中备用。
③取出凝胶板中的凝胶,用转膜液洗涤凝胶,将凝胶平铺在负极的滤纸上,将PVDF膜覆盖其上,夹上夹板。
④将夹板放入转膜槽中,灌满转膜液以淹没凝胶。
⑤转膜槽接通电源,电压设为250V,电流设为0.2A。转移1.5h。
⑥转移结束后,取出PVDF膜。
4)封闭
把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中,洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中,在摇床上缓慢摇动,室温封闭1-4h。
5)一抗孵育
①用TBST洗涤蛋白膜3次,每次5min。
②封口机将薄膜封入杂交袋中,加上一抗(CST OTUB1(D8F7)Rabbit mAb #3783)。
③将杂交袋放入4℃摇床中,过夜。
6)二抗孵育
①将薄膜取出用TBST洗涤3次,每次5min,回收一抗。
②将膜放入对应的加有二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司, BF03008/BF03008X)的二抗稀释液中,避光孵育1h。
7)蛋白检测
孵育后用TBST洗涤3次,每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像系统检测目的条带。
油红O染色实验操作:
1)样品组和对照组用1×PBS洗涤2次,加入300μl 3%多聚甲醛固定20min;
2)加入1×PBS洗涤2次后,加入60%异丙醇漂洗10s;
3)加入1×PBS洗涤2次,通风橱吹干;
4)每孔500μl加入油红O染色1h;
5)加入1×PBS洗涤2次,60%异丙醇进行分选,再加入1×PBS洗2次;镜检,拍照。
稳定转染细胞系的构建:
1.OTUB1慢病毒过表达质粒的构建
1)PCR扩增OTUB1基因,引物为:
正向:5’-CGC GGATCCATGGACGAGAAGACCACCGG-3’;
反向;5’-CCG CTCGAGCG TTTGTAGAGGATATCGTAGTGTCC-3’;
2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,随后使用DNA凝胶回收试剂盒(天根) 进行DNA片段的回收;
3)将所得DNA产物和限制性内切核酸酶FastDigest restriction enzymes(Thermo)、buffer orGreen buffer、ddH2O混合均匀(50μl体系),置于37℃条件下反应。使用AxyPrepTM PCR Clean-Up Kit(Axygen)回收酶切产物;
4)使用PCR一步定向克隆试剂盒(Novoprotein)按照试剂盒说明书进行重组反应;
5)制作大肠杆菌感受态细胞,将上述连接产物进行转化实验,涂板,置于 37℃培养箱,过夜培养;
6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板,挑克隆摇菌,并检测菌落PCR 阳性克隆;
7)将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5ml LB(含抗性)培养基中,在220rpm,37℃摇床中过夜培养;
8)取出过夜培养的菌液,对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒DNA 小提试剂盒);
9)提取后的质粒可直接用于OTUB1瞬转或构建慢病毒稳转细胞系。
2.OTUB1慢病毒敲低表达质粒的构建
1)OTUB1靶向干扰序列为shOTUB1-1:5’AGGAGTATGCTGAAGATGACA 3’和shOTUB1-2:5‘TGTGGTTGTAAATGGTCCTAT 3’;
2)将shOTUB1的序列克隆到pCDH-EF1-copGFP-T2A-Puro的(从addgene 购买,Plasmid#72263))载体中,并进行转化和氨苄抗性筛选;
3)所得质粒可用于慢病毒介导的OTUB1敲低细胞系构建。
3.慢病毒载体构建和包装:
1)用胰酶消化并记数HEK293T细胞,按1×106个HEK293T/孔传至6孔板中;
2)第二天细胞汇合度至80%时开始转染;
3)取1.5ml灭菌EP管,加入2个包装质粒psPAX2(Addgene,12260)和 pMD2.G(Addgene,12259)和过表达或干扰质粒各1μg溶于100μl的无血清培养基。轻柔混匀,室温孵育5min。
4)取1.5ml灭菌EP管,取3μl PEI(1.6μg/μl)溶于100μl无血清培养基中。轻柔混匀,室温孵育5min。
5)将DNA溶液和PEI溶液轻柔混匀,室温孵育15min;
6)将上述DNA-PEI混合液,逐滴加入6孔板中;
7)转染6h后,换新鲜培养基;
8)转染后48-72h收获含病毒的上清,3000rpm离心10min,去除沉淀,并用0.45μm的滤膜过滤;
9)过滤后的病毒可立即用于感染或-80℃贮存。
4.细胞感染:
(1)细胞铺板:每种病毒感染两个孔,并留出一孔作为空白对照,以便后期筛选细胞用。
(2)第一次感染:将病毒液与待感染的细胞(和普通转染密度一致)培养基混合,混合比率取决于病毒滴度和细胞承受能力(本次每孔使用500μl病毒液 +2ml完全培养基),并随后加入2.5μl聚凝胺(8mg/ml),使其终浓度为8μg/ml。
(3)感染后最快2h即可换液终止感染,若细胞承受力强,最长可持续感染 24h。
(4)第二次感染:感染24h后,再感染一次。
5.加药筛选细胞
第一次感染48h后,在六孔板中(包括空白孔)加入含有嘌呤霉素的完全培养基(终浓度为1μg/mL),待空白孔细胞完全死亡,将六孔板中细胞传代至T25 培养瓶,一般空白细胞在24~48h后全部死亡。待细胞长满后,收取一部分细胞做WB验证过表达,并冻存部分细胞。
【实施例1】建立OTUB1稳定转染的L02细胞系
根据实施方式中L02稳定转染细胞系建立的步骤,建立OTUB1过表达和敲低的L02稳转细胞系。之后收集细胞,WB验证OTUB1的表达情况。结果如图 1所示,可见感染OTUB1过表达慢病毒系统的L02细胞中,OTUB1的表达显著升高;感染OTUB1敲低慢病毒系统的L02细胞中,OTUB1的表达显著降低,说明细胞系建立成功。
【实施例2】OTUB1敲低对肝细胞脂肪堆积的影响
(1)实验细胞分组:正常L02细胞对照组、OTUB1稳定敲低L02细胞对照组、正常L02细胞实验组、OTUB1稳定敲低L02细胞实验组。
(2)脂肪肝细胞模型的建立与检测:待细胞一贴壁,细胞培养到50%愈合度之后,向两个实验组中加入棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)(PA 0.2mM+OA 0.4 mM)进行刺激,对照组中加入同等量的BSA,12h后收集各组细胞样品,进行油红O染色。
油红O染色结果如图2所示,对照组细胞无明显红色,实验组在加入PA+OA 刺激后,细胞中红色脂肪滴的面积显著增多,且OTUB1稳定敲低L02细胞中的红色脂肪滴面积的增加程度更为明显。该结果说明OTUB1表达的敲低可加重 PA+OA联合刺激诱导的的脂质沉积。
【实施例3】OTUB1过表达对肝细胞脂肪堆积的影响
1.实验细胞分组:正常L02细胞对照组、OTUB1稳定过表达L02细胞对照组、正常L02细胞实验组、OTUB1稳定过表达L02细胞实验组。
2.脂肪肝细胞模型的建立与检测:待细胞贴壁,细胞培养到50%愈合度之后,向两个实验组中加入棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)(PA 0.2mM+OA 0.4mM) 刺激,对照组中加入同等量的BSA,12h后收集各组细胞样品,进行油红O染色。
油红O染色结果如图3所示,对照组细胞无明显红色,而当实验组中加入 PA+OA进行刺激后,实验组中红色脂肪滴的面积的细胞相比于对照组显著增多,而OTUB1稳定过表达L02细胞中的红色脂肪滴的面积相对于对照组phage中则显著减少。该结果说明,OTUB1过表达可抑制因PA+OA刺激产生的脂质沉积。
上述结果显示OTUB1基因过表达可显著抑制肝细胞脂质堆积,抑制脂肪肝的发生发展。OTUB1基因对脂肪肝病具有显著的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcggatcca tggacgagaa gaccaccgg 29
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgctcgagc gtttgtagag gatatcgtag tgtcc 35
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggagtatgc tgaagatgac a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtggttgta aatggtccta t 21
Claims (7)
1.含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备保护肝脏的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的药物具有抑制肝脏脂质蓄积的功能。
3.含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,脂肪肝及相关疾病包括但不限于:胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎,肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
5.权利要求1-4任一项所述的应用,其特征在于,所述的药物的活性成分是含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1。
6.根据权利要求1-4任一项所述的应用,其特征在于,所述的应用是含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物,所述药物是提高含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1表达量的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的提高含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1表达量的试剂,给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法,或蛋白微球制剂皮下注射法。
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Title |
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CLAUDIA EINER ET AL.: "Data on chow, liver tissue and mitochondrial fatty acid compositions as well as mitochondrial proteome changes after feeding mice a western diet for 6-24 weeks", 《DATA IN BRIEF》 * |
JOSEPH J. SACCO ET AL.: "Emerging Roles of Deubiquitinases in Cancer-Associated Pathways", 《IUBMB LIFE》 * |
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN114450030A (zh) * | 2019-05-07 | 2022-05-06 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 免疫治疗中的靶向otub1 |
CN113925972A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-01-14 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | Otub1蛋白用于治疗骨质疏松症的应用 |
CN113925972B (zh) * | 2021-12-16 | 2022-03-22 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | Otub1蛋白用于治疗骨质疏松症的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN108210884B (zh) | 2020-12-01 |
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