CN107802838A - PLCE1抑制剂与NF‑κB通路抑制剂联合在制备治疗食管鳞癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，提供了一种PLCE1抑制剂与NF‑κB通路抑制剂联合在制备治疗食管鳞癌的药物中的应用。本发明联合运用PLCE1抑制剂和NF‑κB通路抑制剂，可以有效地抑制食管鳞癌细胞和异种移植肿瘤的生长。本发明以PLCE1检测为基础，联合使用NF‑κB通路抑制剂，提出了食管鳞癌的个性化治疗方案，易于临床使用推广。

Description

PLCE1抑制剂与NF-κB通路抑制剂联合在制备治疗食管鳞癌的 药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，涉及PLCE1抑制剂与NF-κB通路抑制剂联合在制备治疗食管鳞癌的药物中的应用。

背景技术

食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)死亡率居世界癌症死因的第六位，我国是全球食管鳞癌发病率和死亡率最高的国家之一。食管鳞癌的发生、发展是一个缓慢的、多阶段、双向转化的过程，经历不同程度的炎症，不典型增生，低级别上皮内瘤变，高级别上皮内瘤变，最终发展成癌，在这个过程中炎症对食管鳞癌的发生发展起到重要作用，但其发生发展机制尚不明确。研究表明肿瘤的生长和迁移依赖于大量新生血管的生成和细胞凋亡抑制。

现有的食管鳞癌治疗方案除了手术治疗，还需要化放疗作为辅助的治疗手段。 但是由于肿瘤对药物的耐药性的存在，严重影响食管鳞癌治疗的效果。

磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon 1,PLCE1)基因是包括本课题组在内的王立东等合作团队运用全基因组关联分析(Genome-wide association studies, GWAS)技术首次证实的中国汉族食管鳞癌的易感基因，且在食管鳞癌组织和细胞中高表达，前期研究发现PLCE1在食管鳞癌组织和细胞中高表达，其高表达与淋巴结转移和临床分期密切相关；敲除 PLCE1 基因可明显抑制食管鳞癌细胞的增殖、促进食管鳞癌细胞凋亡、提高食管鳞癌细胞对紫杉醇和顺铂的敏感性；因此，作为食管鳞癌的易感基因， PLCE1 可能在食管鳞癌细胞的抗凋亡及促增殖过程中起到关键的推动作用。

近年来，越来越多的研究显示PLCE1作为ras基因的下游效应因子，可以通过调节炎性因子的表达从而导致炎症，进而促进肿瘤的发生和发展。NF-kB是一种关键性的转录因子，是炎症相关肿瘤的启动因子，与慢性炎症所致肿瘤形成有关，其可能参与非可控性炎症恶性转化的调控网络。在多种肿瘤组织中都存在NF-κB 的异常活化，而活化的NF-κB通路对肿瘤的影响一方面表现可作用于肿瘤细胞影响肿瘤细胞的增殖、凋亡及迁移侵袭等生物学行为；另一方面又可影响微环境中炎性细胞的功能，譬如促进炎性细胞分泌促炎因子TNF-α、IL6等为肿瘤细胞提供生长信号或者分泌促血管生成相关的因子等。Cui XB等研究发现PLCE1在哈萨克族ESCC中高表达，并与NF-κB相关蛋白表达呈显著正相关性,尤其是IKKβ和p50。在哈族ESCC患者中PLCE1上调与NF-κB-相关蛋白表达增加相关,表明PLCE1与NF-κB 信号通路可能有助于ESCC的致癌作用。Sommermann TG等研究表明PLCE通过NF-kB通路增强TNFa刺激CCL2/MCP1表达在人类角化细胞中。Shuzo Ikuta也发现PLCE1可能通过NF-kB通路来增强炎症反应，促进肿瘤的发展。表明PLCE1基因参与NF-kB介导的肿瘤生成。

发明内容

本发明的目的在于提供PLCE1抑制剂和NF-κB通路抑制剂的新的用途，所述的这种新的用途要解决现有技术中手术治疗或者药物治疗食管鳞癌的效果不佳的技术问题。

本发明提供了PLCE1抑制剂与NF-κB通路抑制剂联合在制备治疗食管鳞癌的药物中的应用。

进一步的，所述的食管鳞癌为PLCE1高表达型。

进一步的，所述的PLCE1抑制剂是shR-PLCE1，或其它能使磷脂酶C降解功能的物质。

进一步的，所述的NF-κB通路抑制剂，是Bay11-7082或其它能抑制NF-κB通路的物质。

本发明还提供了一种用于治疗食管鳞癌的药物，其活性成分为PLCE1抑制剂和NF-κB通路抑制。

所述的NF-κB通路抑制剂，是能抑制NF-κB通路功能的物质，包括但不限于：Bay11-7082，以及其它能引起同样效应的物质例如蛋白酶体核心组分蛋白的 shRNA，或调节蛋白酶体组成蛋白的 microRNA 等。

本发明所述的联用、联合用药物，包括同时或顺序的施用有效量PLCE1抑制剂与NF-κB通路抑制剂。所述的顺序可以是先用PLCE1抑制剂，再用NF-κB通路抑制剂；也可以是先用用NF-κB通路抑制剂，再用PLCE1抑制剂。

本发明所述的联合用药物，可以药物组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包合物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、熔胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等，用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、脂质体、微囊、微球、毫微粒等，也可将其制成各种缓释、控释制剂。优先的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、微丸、栓剂和注射剂，特别优先特定部位靶向释放的制剂。

在本发明的优选实施例，以PLCE1抑制剂与NF-κB通路抑制剂的给药方式包括静脉注射、口服和局部给药等。

本发明所述的联合用药物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的肿瘤种类和严重程度等变化，本发明所述的有效量，可以是 0.001-1000mg/kg体重，优选日剂量可以是0.01-100mg/kg 体重，更优为 0.1-50mg/kg 体重。可以一次或多次施用。

本发明所述的联合用药物，用于治疗食管鳞癌，优选用于治疗 PLCE1高表达的食管鳞癌。

本发明可通过检测食管鳞癌患者肿瘤中PLCE1的表达水平，联合PLCE1抑制剂和NF-κB通路抑制剂对PLCE1高表达的食管鳞癌患者进行给药。

本发明经实验证实，PLCE1在75的食管鳞癌肿瘤组织中表达为阳性，PLCE1的表达显著影响肿瘤患者的预后，PLCE1表达阴性的食管鳞癌患者预后存活更好。

PLCE1高表达的食管鳞癌细胞系由慢病毒敲除PLCE1后出现死亡，PLCE1能够特异性诱导NF-κB通路上调。

联合应用PLCE1抑制剂和NF-κB通路抑制剂可以有效地抑制PLCE1高表达的食管鳞癌细胞增殖、血管生成并促进其凋亡。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明联合运用PLCE1抑制剂和NF-κB通路抑制剂，可以有效地抑制食管鳞癌细胞和异种移植肿瘤的生长。本发明以 PLCE1检测为基础，联合使用NF-κB通路抑制剂，提出了食管鳞癌的个性化治疗方案，易于临床使用推广。

附图说明

图1显示了PLCE1在正常食管组织及食管鳞癌不同TNM分期中的免疫组化染色情况。

图2显示 PLCE1阳性组和阴性组患者的生存曲线。

图3A和图3B显示PLCE1可以激活NF-κB通路。

图4A~图4G显示了单独抑制和共同抑制PLCE1和NF-κB后，对食管鳞癌细胞系Eca109，EC9706增殖、凋亡和血管生成能力的影响。

图5A~图5D显示了单独抑制和共同抑制PLCE1和NF-κB后对人食管鳞癌异种移植瘤的治疗效果。稳定感染shR-PLCE1和GFP慢病毒的Eca109细胞，左侧腋下注射到6 到 8周龄的裸鼠，当移植瘤长到直径 0.5-1cm 左右，腹腔注射生理盐水或Bay11-7082。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

pSIH1-H1-copGFP/shR-PLCE1及pSIH1-H1-copGFP质粒构建的慢病毒均购自上海吉凯生物公司 ；NF-κB抑制剂 Bay11-7082购自德国默克公司。

免疫组化所用PLCE1 抗体购自sigma公司，货号HPA015598；western blot 所用PLCE1 抗体购自santa公司，货号sc-28404。

食管鳞癌细胞系Eca109和 EC9706均购自上海复祥生物科技有限公司。

实施例1

通过免疫组织化学方法检测食管鳞癌患者手术切除术后石蜡包埋的癌及癌旁正常食管组织中 PLCE1 的表达水平。

选取104例食管鳞癌患者的肿瘤组织的石蜡切片 ( 食管鳞癌组织切片均来自石河子大学医学院附属医院，由 2 名病理科医生确诊为食管鳞癌 )，采用免疫组化方法检测PLCE1 蛋白在食管鳞癌组织中的表达量并计算免疫组化评分，并结合患者临床统计资料，以 PLCE1 免疫组织化学检测分析食管鳞癌患者预后情况。

抗原修复 8 分钟，一抗使用兔抗人多克隆PLCE1抗体 1:150，4℃孵育过夜；Dako公司Envision A液标记的二抗 37℃孵育 0.5 小时，DAB 显色。根据免疫组化的方法检测食管鳞癌患者的癌和癌旁肝组织标本中PLCE1的表达水平，参考王光辉2013年Identification of MXRA5 as a novel tissue biomarker for colorectal cancerprogression进行评分。方法如下 <5％细胞阳性为0分；6%-25％细胞阳性为1分；26％-50％细胞阳性为2分；51％-75％细胞阳性为3分；>75％细胞阳性为4分。着色强度按细胞显色的有无及深浅评分：细胞无显色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。然后结合阳性细胞百分比及着色强度相乘分级，所得分数为0-1分时，分级为（-）； 2-4分为（+）；5-8分为（++）；9-12分为（+++）。 其中-为阴性；+为弱阳性；++/+++为强阳性。

图1和图2显示在食管鳞癌手术患者中，PLCE1 的表达与肿瘤患者的预后存活关系。其中，图 1 显示 PLCE1在食管鳞癌肿瘤组织中的染色情况，正常组织为阴性，食管鳞癌TNM分期中Ⅰ和Ⅲ均为阳性 ；通过对104例食管鳞癌患者的肿瘤组织进行 PLCE1 的免疫组织化学评分，发现其中有75例样本 (72%) PLCE1 表达为阳性，这表明 PLCE1 在食管鳞癌中高表达。结合临床统计资料，以 Kaplan-Meier 法比较 PLCE1 阴性 / 阳性表达的总体生存时间 (图2所示)，均体现出显著差异，PLCE1 阴性的患者预后更好。这提示 PLCE1 可以作为食管鳞癌评估预后的重要因素，同时干预 PLCE1的表达也可能是治疗食管鳞癌的潜在靶点。

实施例 2 ：基因芯片及western blot分析食管鳞癌细胞系在PLCE1 抑制后的信号通路变化

在 10cm 细胞培养皿中传入食管鳞癌细胞 Eca109和 EC9706，达到 50％融合度后分别加入 shR-PLCE1 及对照 GFP 慢病毒，24h 后换液，然后继续培养 72h，弃去培养基，用PBS轻轻冲洗一次，加入 1ml Trizol，提取细胞的 RNA 用于表达谱基因芯片分析。使用芯片为 affymetrix 2.0 人基因表达谱芯片得到全基因mRNA表达丰度，数据分析由博奥生物有限公司完成。用倍数法对两种细胞的对照组和实验组进行两两差异筛选 ( 横向和纵向)，得到差异的 mRNA，并富集分析NF-κB通路分子以及下游分子表达情况。在6孔板中传入食管鳞癌细胞 Eca109和 EC9706，达到 50％融合度后分 别加入 shR-PLCE1 及对照 GFP 慢病毒，24h 后换液，然后继续培养 72h，弃去培养基，用PBS轻轻冲洗一次，含PMSF的RIPA提取蛋白，western blot检测NF-κB通路关键分子IκB，p-IκB，IKK，p-IKK的表达情况。

如图3所示，其中A是基因表达谱芯片得到全基因mRNA表达丰度后，用倍数法对两种细胞的对照组和实验组进行两两差异筛选 ( 横向和纵向 )，得到差异的 mRNA，并富集分析NF-κB通路分子以及下游分子表达情况。B是western blot检测沉默PLCE1后，NF-κB通路关键分子IκB，p-IκB，IKK，p-IKK的表达情况。

分析结果显示，在 Eca109和 EC9706 细胞中，抑制PLCE1后NF-κB通路分子以及下游分子表达改变显著，IL-5，HIF3A，BCL2，TLR2等分子表达均呈降低趋势，可能与NF-κB通路被抑制相关。Western blot检测NF-κB通路关键分子IκB，p-IκB，IKK，p-IKK的表达情况，抑制PLCE1后p-IκB，IKK，p-IKK表达均呈降低改变，相反，IκB表达升高，表明抑制PLCE1后NF-κB通路被抑制，同理，PLCE1可以激活NF-κB通路。

实施例 3 ：联合运用PLCE1抑制剂和NF-κB抑制剂对食管鳞癌细胞系的影响

将食管鳞癌细胞系 Eca109和 EC9706传入 96 孔板中，每孔 4000 个细胞。待细胞贴壁后分为 4 组，每组设 3 个副孔，2组加入 shR-PLCE1慢病毒其它2组加入对照 GFP 慢病毒，24h 后换液，分别加入Bay11-7082和DMSO，即四组处理分别为：

1)GFP+DMSO

2)GFP+ Bay11-7082

3)shR-PLCE1+ DMSO

4)shR-PLCE1+ Bay11-7082

加药处理前设置为 0 时刻。分别在 0、24、48h 、72h、96h加入20ul的 MTT 检测试剂（锡箔纸避光），37℃孵箱孵育4h吸掉培养基，每孔加入125ul DMSO后检测 490nm 处的吸光度值。用各时间点所测的吸光度值绘制生长曲线。

同样的分组在24孔板中处理细胞，处理后用 0.5％胰酶消化细胞，离心后用 PBS洗涤细胞后，加入 PI 和FITC对细胞进行染色，10分钟后离心，PBS 液洗涤一次后用流式细胞仪检测。

同样的分组在24孔板中处理细胞，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定30分钟，PBS洗涤后，用适量的TUNEL检测液，37℃避光孵育60后洗涤封片，荧光显微镜观察并拍照。

融化matrigel胶，每孔50ul加至96孔板，37℃孵育30分钟用，脐静脉内皮细胞每孔2×10⁴个细胞，每孔加入上述分组处理的Eca109和 EC9706细胞上清50ul，37℃孵育6h观察拍照。

取200ul脐静脉内皮细胞悬液加入Transwell小室中（脐静脉内皮细胞10万细胞/孔），24孔板下室加入上述分组处理的Eca109和 EC9706细胞上清600ul，培养48h后，弃液体后PBS冲洗，4%多聚甲醛固定20分钟，结晶紫染色拍照。

将两株食管鳞癌细胞系 Eca109和 EC9706分别传入 6 孔板中，待细胞长到 80％的融汇度后，用 150ul 的 RIPA 裂解液 ( 碧云天) 收取细胞蛋白，经 SDS-PAGE 电泳，转膜后用 5％的 BSA或脱脂牛奶封闭，一抗 4℃孵育过夜，再用二抗孵育曝光。

由图4AB可知联合运用PLCE1抑制剂和NF-κB抑制剂后对食管鳞癌细胞系Eca109和EC9706生长抑制效果良好，且优于单独使用；图 4C 为各处理组中细胞的凋亡率，Eca109和EC9706中单独使用PLCE1抑制剂和NF-κB抑制剂后细胞凋亡率明显增加，联合运用shR-PLCE1 和Bay11-7082后细胞凋亡率最高；图4D TUNEL染色凋亡检测结果同上，联合运用shR-PLCE1 和Bay11-7082后细胞凋亡率最高。图4E小管形成实验说明，单独使用shR-PLCE1和Bay11-7082后脐静脉内皮细胞小管形成数量显著减少，同时联合运用shR-PLCE1 和Bay11-7082后脐静脉内皮细胞小管形成数量最少；图4F transwell实验表明，联合运用shR-PLCE1 和Bay11-7082后侵袭迁移能力最低；图4G显示单独抑制PLCE1和NF-κB后Bcl-2，VEGFC表达显著降低，Bax表达显著增加，联合抑制PLCE1和NF-κB后Bcl-2，VEGFC表达最低，Bax表达最高。

实施例 4 ：联合运用PLCE1抑制剂和NF-κB抑制剂在体内对食管鳞癌肿瘤生长的影响。

嘌呤霉素筛选稳定感染shR-PLCE1和GFP慢病毒的Eca109细胞6 到 8 周龄的裸鼠(50 只，新疆医科大学动物中心 )，随机分成4组分别进行如下处理：

1）GFP稳转Eca109细胞系左侧腋下注射，生理盐水 4 mg/kg（当移植瘤长到直径 0.5-1cm 左右，腹腔注射）

2）GFP稳转Eca109细胞系左侧腋下注射，Bay11-7082 4 mg/kg（当移植瘤长到直径0.5-1cm 左右，腹腔注射）

3）shR-PLCE1稳转Eca109细胞系左侧腋下注射，生理盐水 4 mg/kg（当移植瘤长到直径0.5-1cm 左右，腹腔注射）

4）shR-PLCE1稳转Eca109细胞系左侧腋下注射，Bay11-7082 4 mg/kg（当移植瘤长到直径 0.5-1cm 左右，腹腔注射）

每 3 天测量一次肿瘤直径，计算各组肿瘤体积后，绘制肿瘤生长曲线图。

取裸鼠肿瘤组织40mg剪碎超声后，加入200ul裂解液提取蛋白，western blot检测PLCE1、p-IkBa、Bcl2、VEGFC的表达水平。

通过免疫组织化学方法检测石蜡包埋的裸鼠肿瘤组织中 PLCE1、P65、Ki67、Bcl2、CD34的表达水平。

如图5 AB所示，抑制PLCE1和抑制NF-κB通路后，裸鼠肿瘤大小和体积显著减小，联合运用PLCE1抑制剂和NF-κB抑制剂后，裸鼠肿瘤大小和体积较单独处理组减小更加显著；如图5C 所示图联合运用PLCE1抑制剂和NF-κB抑制剂后，凋亡以及血管生成相关蛋白Bcl2、VEGFC表达显著降低且低于单独抑制组；如图5D表明，抑制PLCE1和抑制NF-κB通路后，凋亡以及血管生成相关蛋白Bcl2、CD34表达显著降低，联合运用PLCE1抑制剂和NF-κB抑制剂后Bcl2、CD34表达最低。

Claims (5)

1.PLCE1抑制剂与NF-κB通路抑制剂联合在制备治疗食管鳞癌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的食管鳞癌为PLCE1高表达型。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的PLCE1抑制剂是shR-PLCE1或其它能使磷脂酶C降解功能的物质。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的NF-κB通路抑制剂是Bay11-7082或其它能抑制NF-κB通路的物质。

5.一种用于治疗食管鳞癌的药物，其特征在于：其活性成分为PLCE1抑制剂和NF-κB通路抑制。