CN110872626A - Plce1基因启动子区甲基化的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了PLCE1基因启动子区甲基化的应用。所述的用于食管癌早期诊断或预后评估的试剂盒，其特征在于，包括用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂。利用本发明所述引物及实验方法检测食管鳞癌组织中PLCE1基因启动子区特定CpG位点呈低甲基化状态，而在癌旁正常组织细胞中，PLCE1基因启动子区特定CpG位点呈相对高甲基化状态，表明该基因启动子区特定CpG位点的甲基化状态对食管鳞癌组织具有特异性。

Description

PLCE1基因启动子区甲基化的应用

技术领域

本发明属于癌症防治领域，尤其涉及一种食管癌相关基因PLCE1甲基化生物标记物在食管鳞癌早期诊断和预后评估的应用。

背景技术

食管癌(esophageal carcinoma,EC)是全球第八大常见癌症，在癌症引起的死亡中位于第六位。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是包括中国在内的发展中国家常见的食管癌类型，每年全球大约有一半将近50万的ESCC新增病例发生在中国。目前普遍认同食管癌是多个基因参与、多种因素作用、多个阶段发展的疾病，但其发生和发展的确切机制尚未完全阐明。流行病学和病因学的研究表明，环境和遗传因素对食管癌的发生发展有非常重要的作用。

磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon 1，PLCE1)是由Shibatohge等人在1998年发现的一种新的蛋白，是磷脂酶C家族的新成员。PLCE1蛋白的相对分子量为210kD。其基因全长334.3kb，位于常染色体10q23.32～24.1，为单拷贝基因，其中包含34个外显子。包含本课题组在内的王立东教授合作团队于2010年通过全基因组关联分析技术(Genome-wideassociation studies,GWAS)，在中国汉族和哈族人群样本中首次发现了PLCE1基因在食管鳞癌组织中高表达，是食管鳞癌的易感基因。我们在中国哈族食管鳞癌患者组织样本中同样发现了PLCE1在食管鳞癌组织中高表达，且其高表达与淋巴结转移、TNM分期以及肿瘤浸润密切相关。同时，我们还发现PLCE1影响预后，可以被miR-145调控，对食管鳞状细胞癌的增殖和转移起到关键的促进作用。此外，Abne等人研究发现PLCE1基因rs2274223位点是中国食管鳞癌患者的易感基因位点。我们课题组前期研究发现PLCE1基因的2个单核苷酸位点(rs753724和rs2274223)能够增加食管癌的患病风险，且rs2274223位点显著与新疆哈族食管鳞癌患者的低分化及晚期的临床分期有关。

随着分子生物学机制在肿瘤发生过程中的研究深入，表观遗传学所起到的作用日益受到重视。DNA甲基化作为肿瘤表观遗传修饰的一种重要方式是形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，即胞嘧啶的第五个碳原子接受了S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)的甲基基团，这种修饰的完成需要DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化。甲基化可作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。异常DNA甲基化对致癌或抑癌基因表达的影响可以在多种肿瘤中发现。王晓亮等人采用亚硫酸盐测序法(Bisulfite DNASequencing，BSP)和甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)法检测结直肠癌组织中抑癌基因PLCE1启动子区磷酸胞苷酰(Cytosines positioned 5′to Guanosines，CpG)位点的甲基化，研究发现，结直肠癌组织中PLCE1基因启动子区12个CpG位点的甲基化率均高于其对应的癌旁正常组织。

发明内容

本发明的目的是提供一种食管癌相关甲基化生物标记物及应用，旨在解决现有食管癌诊断敏感性低以及预后差的问题。

为了达到上述问题，本发明提供了一种用于食管癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，包括用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂。

本发明还提供了一种用于食管癌预后评估的试剂盒，其特征在于，包括用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂。

优选地，所述的用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂包括用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的质谱甲基化检测引物。

优选地，所述的质谱甲基化检测引物的上游引物序列为：5’-aggaagagagGTTGGGTATATTGATGGGGTTTAAT-3’；下游引物序列为：cagtaatacgactcactatagggagaaggctACCCCTAAAAACCATCCTTTCTAAC-3’。

优选地，所述的质谱甲基化检测引物扩增的片段为PLCE1基因转录起始位点上游301bp-579bp共279bp的片段。该片段包含12个CpG位点，9个CpG单位，其中因CpG_1和CpG_11.12无法覆盖，能成功检测CpG_2、CpG_3、CpG_4、CpG_5.6、CpG_7.8、CpG_9.10。其中CpG_5.6为筛选出早期诊断和预后判断的敏感位点。

优选地，所述的质谱甲基化检测引物扩增的片段包含CpG_5.6位点。

优选地，所述的用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂为检测CpG_5.6位点甲基化状态的试剂。

优选地，所述的食管癌为食管鳞癌。

本发明还提供了一种定量检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的方法，其特征在于，包括如下步骤：食管鳞癌石蜡组织样本DNA提取，亚硫酸氢盐处理DNA，PCR扩增反应，SAP酶消化反应，转录和酶切反应，树脂纯化，上机检测，收集数据。

优选地，所述的PCR扩增反应体系为：DNA模板2.0ul，浓度为10pmol/μL的正向引物0.2ul，浓度为10pmol/μL的反向引物0.2ul，浓度为5U/μL的PCR Enzyme 0.2ul，反应终浓度为200μM的dNTPs 1.0μL，反应终浓度为1×的10×PCR Buffer 1.0μL，ddH₂O补足体积至10μL。

优选地，所述的PCR扩增反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，45个循环，最后72℃延伸3min，4℃保存。

本发明进一步提供了检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂在制备预判或防治食管癌的试剂盒或药物中的应用。

优选地，所述的甲基化状态指的是甲基化频率。

本发明首次通过质谱甲基化的方法在食管癌中成功验证了易感基因PLCE1启动子区特定CpG位点的低甲基化，进一步了解其对患者预后的不良影响。因此推断该基因特定CpG位点的低甲基化状态可能是一个新的食管癌分子标记物。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、利用本发明所述引物及实验方法检测食管鳞癌组织中PLCE1基因启动子区特定CpG位点呈低甲基化状态，而在癌旁正常组织细胞中，PLCE1基因启动子区特定CpG位点呈相对高甲基化状态，表明该基因启动子区特定CpG位点的甲基化状态对食管鳞癌组织具有特异性。

2、应用本发明所述引物及反应体系、反应条件可以使检测食管鳞癌组织的灵敏度大大提高，这说明PLCE1启动子区特定CpG位点的低甲基化状态可以作为食管癌的一个新的分子标记。

3、本发明首选食管癌中PLCE1基因作为目标基因，具有首创性。因此，应用本发明的引物及实验方法来检测PLCE1启动子区特定CpG位点的低甲基化状态可作为食管癌早期诊断、预后判断等的有力手段，而且操作简便、特异性好，具有深远的临床意义和推广价值。

4、通过检测样品中PLCE1的甲基化频率可以辅助判断待检者罹患食管癌的级别分期以及预后。

5、由于甲基化修饰有可能被逆转，本发明的标志物有可能用来治疗食管癌。

附图说明

图1为MALDI-TOF MS法甲基化检测原理图。DNA样本中没有发生甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐的处理下全部转化为尿嘧啶(相当于DNA中的胸腺嘧啶)。对样本进行扩增，引物为特殊设计，扩增产物带有T7RNA聚合酶启动子序列。利用T7RNA聚合酶，在体外转录体系中将扩增产物转录为RNA片段；携带有CpG位点的小片段由RNA片段切割而成，利用RNase A能够特异性的识别并切割RNA中U 3’端的特性。产物检测使用Agena

飞行质谱分析系统。CpG和CpA之间相差的16Da为同一片段中分子量仅有的差别，即质谱图中两者峰之间的差距。

图2为PLCE1基因启动子区26号引物扩增序列CpG位点图示。上图序列为正向序列，CpG位点用圆点表示。深色标记可以检测到的CpG位点，浅色标记因序列问题无法检测到的CpG位点。

图3为PLCE1基因PCR扩增产物(320bp)电泳图。K:空白对照；M:DNA marker；1-6:食管鳞癌；7-13:癌旁正常组织。

图4为食管鳞癌和癌旁正常组织中PLCE1基因启动子区平均甲基化水平比较。

图5为食管鳞癌组织中PLCE1基因启动子区CpG单位甲基化状态与患者预后。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明采用基质辅助激光解析电离时间飞行质谱仪(matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)检测132例ESCC和104例癌旁正常组织中PLCE1基因启动子区甲基化状态，探讨甲基化与ESCC临床病理特征(性别、年龄、肿瘤部位、高/中/低分化程度、淋巴结转移、TNM分期)以及预后之间的关系，为进一步了解PLCE1基因在食管鳞癌中的发病机制及意义提供理论依据。

本发明通过检测食管癌易感基因PLCE1启动子区特定CpG位点的甲基化率为生物标记物。该生物标志物获取的具体过程包括：收集患者食管鳞癌及癌旁正常食管组织样本，石蜡组织包埋。QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(REF 56404)提取食管鳞癌和癌旁正常样本石蜡组织DNA，采用EZ-96 DNA Methylation-Gold^TM Kit进行亚硫酸氢盐修饰。修饰后的DNA采用飞行质谱法检测PLCE1基因启动子区CpG位点的甲基化频率为生物标记。通过研究发现PLCE1基因启动子区低甲基化，且其低甲基化的患者预后不良。说明PLCE1基因的甲基化检测可用于辅助食管癌患者的早期诊断和预后评价。本发明对更好的理解食管癌的发生机理，制定食管癌风险评估具有极其重要的意义，而且操作简便、稳定性好，有深远的临床意义和推广性。

本发明实施例中所用的石蜡组织DNA提取试剂盒购自凯杰试剂盒(QIAamp DNAFFPE Tissue Kit)；亚硫酸氢盐及纯化试剂盒(EZ-96 DNA Methylation-Gold^TM Kit)。

实施例

食管鳞状细胞癌组织中PLCE1基因的甲基化改变及其临床病理学意义。

DNA的制备：选取132例食管鳞癌患者肿瘤组织及其对应的104例癌旁正常组织，福尔马林固定、石蜡包埋。其中癌旁正常组织均为食管正常组织蜡块并选自距食管鳞癌组织2cm以上部位的样本。应用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit按照操作说明分别提取基因组DNA，紫外分光光度仪测定吸光度值确定其含量及纯度，凝胶电泳确保提取的DNA质量。

亚硫酸氢盐处理：使用ZYMO EZ-96 DNA Methylation-Gold^TM Kit按照操作说明进行亚硫酸氢盐修饰。得到DNA立即使用或-20℃保存备用。

PCR扩增反应：设计PLCE1基因启动子区扩增片段的引物。采用Blend Taq-Plus试剂盒扩增片段如图2，引物序列如表1。

表1实验相关PCR引物序列

反应体系：

反应物	反应物终浓度	体积(μL)
			ddH<sub>2</sub>O	-	5.4
10×PCR Buffer	1×	1.0
			dNTPs	200μM	1.0
PCR Enzyme(5U/μL)	0.4-0.6unit/reaction	0.2
			forward primer(10pmol/μL)	200nM	0.2
reverse primer(10pmol/μL)	200nM	0.2
			DNA模板	-	2.0
Total Volume		10.0

反应条件：

操作步骤：

(1)按上述反应体系配制PCR反应溶液(反应体系配制过程应在冰上完成，防止高温中长时间暴露而失活)；

(2)将微孔板用板式封口膜封闭，微孔板3000xg离心1分钟，按照上述反应条件用PCR仪孵育微孔板中样本；

(3)取PCR产物3μl与1μl 6×loading buffer(TaKaRa、AH70434A)混匀，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，160V、20min后观察结果，如结果良好可继续后续实验(图3)。

采用(Agena、0000025381)试剂盒，虾碱性磷酸酶处理PCR扩增产物(SAP)：

反应体系：

反应物	体积(μL)
		RNase-free ddH<sub>2</sub>O	1.70
Shrimp alkaline phosphotase(SAP)Enzyme	0.30
		PCR products	8.00
Total Volume	10.00

反应条件：

37℃ 20min

85℃ 5min

4℃ ∞

操作步骤：

(1)在384反应板的每个孔中加入10μL SAP反应液，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象；

(2)混匀板并3000xg离心微孔板1分钟；离心后按照上述反应条件进行后续程序。

采用(Agena、0000025381)试剂盒，进行T切/RNase A消化反应：

反应体系：

反应条件：37℃孵育3h,4℃存储。

操作步骤：

(1)按上述反应体系配制混合液；

(2)取2μL PCR产物和5μL T转录/RNaseA混合物至新的384孔板；

(3)盖上封板膜，3000xg离心微孔板1分钟；

(4)按上面反应条件在PCR仪中孵育微孔板中样本。

MALDI-TOF-MS甲基化质谱结果分析：

本发明中PLCE1基因扩增子中包含12个CpG位点，T裂解后为8个CpG单位(其中CpG单位CpG_1和CpG_11、12不能被覆盖，不可分析)，实际包含6个CpG单位，9个CpG位点(见图1)。本实验236例样本中研究CpG单位总数为1416个，其中1270个CpG单位可被分析(89.7％)。

以每例样本所检测到的启动子区全部CpG位点甲基化水平的均值表示该例样本启动子区的整体甲基化水平。对食管鳞癌和癌旁正常组织中各样本PLCE1基因启动子整体甲基化水平进行Mann-Whitney U检验，食管鳞癌组织中PLCE1基因启动子区平均甲基化水平(0.0957±0.0456)低于癌旁正常组织(0.1144±0.0464)，且差异具有统计学意义(Z＝-3.814,P＝0.0001)(图4)。

运用SPSS17.0软件对食管鳞癌及癌旁正常组织进行PLCE1基因甲基化水平Mann-Whitney U检验，进一步比较PLCE1基因6个CpG单位在两组样本中的甲基化差异，筛选甲基化差异性CpG单位。结果显示PLCE1基因4个CpG单位(CpG_2、CpG_5.6、CpG_7.8、CpG_9.10)在两组中甲基化分布均存在差异(P<0.05)，见表2。

表2食管鳞癌和癌旁正常组织中PLCE1各CpG位点甲基化率比较

注：ESCC表示食管鳞状细胞癌，Normal表示癌旁正常组织。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

对食管鳞癌和癌旁正常组织样本比较筛选出的4个CpG单位(CpG_2、CpG_5.6、CpG_7.8、CpG_9.10)与肿瘤分化程度(高分化/中分化/低分化)之间进行统计学分析比较。这4个CpG单位在肿瘤分化程度(高分化/中分化/低分化)三组的平均甲基化率及Kruskal-WallisH检验比较结果如表3所示，CpG_9.10单位甲基化率在不同肿瘤分化程度间具有统计学差异(P<0.05)，且平均甲基化率低分化<高分化<中分化。

表3分化程度组间PLCE1基因甲基化状态比较

注：N表示被分析CpG单位个数，

表示平均甲基化率，S表示标准差。*表示P<0.05。P<0.05有统计学意义。

对食管鳞癌和癌旁正常组织样本比较筛选出的4个CpG单位(CpG_2、CpG_5.6、CpG_7.8、CpG_9.10)与TNM分期(I期+Ⅱ期/Ⅲ期+Ⅳ期)之间进行统计学分析比较。这4个CpG单位在TNM分期(I期+Ⅱ期/Ⅲ期+Ⅳ期)两组的平均甲基化率及Mann-Whitney U检验比较结果如表4所示，CpG_7.8单位存在统计学差异(P<0.05)，且平均甲基化率(Ⅲ期+Ⅳ期)<(I期+Ⅱ期)。

表4 TNM分期组间PLCE1基因甲基化状态比较

注：N表示被分析CpG单位个数，

表示平均甲基化率，S表示标准差。*表示P<0.05。P<0.05有统计学意义。

对食管鳞癌和癌旁正常组织样本比较筛选出的4个CpG单位(CpG_2、CpG_5.6、CpG_7.8、CpG_9.10)与患者年龄、肿瘤部位、淋巴结转移比较，甲基化率均没有差异(P>0.05)。

采用Kaplan-Meier生存分析比较食管鳞癌中PLCE1基因甲基化状态与患者预后的关系，结果如图5所示，除CpG_5.6(P＝0.046)外，其他CpG位点不同甲基化率与生存预后并无统计学意义(P＝0.268、0.749、0.705)，筛选CpG_5.6位点的甲基化频率作为筛查和诊断食管癌生存预后的生物标志物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 石河子大学

<120> PLCE1基因启动子区甲基化的应用

<160> 3

<170> PatentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aggaagagag gttgggtata ttgatggggt ttaat 35

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tacccctaaa aaccatcctt tctaac 56

<210> 3

<211> 274

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gtattaaatg aacgagtgac agaacagatt cgagacttgg tgctgccatc tactacagag 60

accttgatcg tgtcctttat ctgccgtgaa cctcagtttc catatctgtc aaccaggggt 120

ggttccctgg ggtagtgtga gagtaaattc ccgccgcctg aggtgtgcag agttcccgcc 180

cttcccggag ccgggcgccc caggagcgct ctctctggct cccgccagaa aggatggctc 240

ctaggggtca gggccagggg tctgggaagg ggtc 274

Claims (9)

1.一种用于食管癌早期诊断或预后评估的试剂盒，其特征在于，包括用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂包括用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的质谱甲基化检测引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的质谱甲基化检测引物的上游引物序列为：5’-aggaagagagGTTGGGTATATTGATGGGGTTTAAT-3’；下游引物序列为：cagtaatacgactcactatagggagaaggctACCCCTAAAAACCATCCTTTCTAAC-3’。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的质谱甲基化检测引物扩增的片段为PLCE1基因转录起始位点上游301bp-579bp共279bp的片段。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的质谱甲基化检测引物扩增的片段包含CpG_5.6位点。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的食管癌为食管鳞癌。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂为检测CpG_5.6位点甲基化状态的试剂。

8.检测PLCE1基因启动子区CpG位点甲基化状态的试剂在制备预判或防治食管癌的试剂盒或药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的甲基化状态指的是甲基化频率。

Images