CN116064820A - 用于检测早期肝癌的生物标记物、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本申请实施例公开了一种用于检测早期肝癌的生物标记物、试剂盒及其使用方法。本申请实施例的试剂盒以如SEQ ID NO.1所示的第一DNA分子和/或如SEQ ID NO.2所示的第二DNA分子作为检测标记物,通过判断离体样本中第一DNA分子和/或第二DNA分子中CpG位点的甲基化程度来判定该离体样本是否为早期肝癌阳性样本,从而指示源于该离体样本的生物体是否发生早期肝癌病变。本申请实施例的试剂盒基于其特定的生物标记物,对早期肝癌的阳性判断具有良好的特异性和灵敏度,可应用于早期肝癌的筛查。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域,具体涉及用于检测早期肝癌的生物标记物、试剂盒及其使用方法。
背景技术
肝癌是中国常见的恶性肿瘤之一。大部分肝癌患者一经发现就是中晚期,其中位生存期仅为1到1.5年,而早期肝癌的5年术后生存率超过70%,因此,肝癌的早筛、早诊、早治可极大改善患者的预后。
目前用于肝癌检测的血液标志物是甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)。然而,甲胎蛋白在检测早期肝癌时存在灵敏度和特异性不足的问题。
发明内容
本申请实施例提供一种用于检测早期肝癌的生物标记物、试剂盒及其使用方法,能够解决采用甲胎蛋白检测早期肝癌时存在的灵敏度和特异性不足的问题。
本申请实施例提供了一种分离的生物标记物或生物标记物组合作为早期肝癌的生物标记物的用途,生物标记物包括:如SEQ ID NO.1所示的第一DNA分子和/或如SEQ IDNO.2所示的第二DNA分子。第一DNA分子和第二DNA分子不仅包括DNA的碱基排列顺序信息,也包括自然存在的DNA片段物质。第一DNA分子和第二DNA分子各自独立地包括甲基化CpG位点和/或未甲基化CpG位点。
可选地,在一些实施例中,用作生物标记物的第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为甲基化CpG位点。在另一些实施例中,用作生物标记物的第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为非甲基化CpG位点。
本申请实施例提供了一种分离的生物标记物或生物标记物组合作为用于判定离体样本是否为早期肝癌阳性样本的试剂盒的检测对象的用途,生物标记物组合包括:如SEQID NO.1所示的第一DNA分子和/或如SEQ ID NO.2所示的第二DNA分子。第一DNA分子和第二DNA分子各自独立地包括甲基化CpG位点和未甲基化CpG位点。
可选地,在一些实施例中,用作生物标记物的第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为甲基化CpG位点。在另一些实施例中,用作生物标记物的第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为非甲基化CpG位点。
可选地,在一些实施例中,第一DNA分子选自基因组坐标为chr2:74555005-74555272的DOK1基因。第二DNA分子选自基因组坐标为chr5:135027454-135027645的PITX1基因。
本申请实施例提供了一种用于鉴定早期肝癌阳性样本的试剂盒。该试剂盒通过鉴定某个离体样本是否为早期肝癌阳性样本来指示早期肝癌。该试剂盒包括:转化试剂、第一引物对和第一荧光探针。在其它的实施例中,该试剂盒还可以包括第二引物对和第二荧光探针。
在一些实施例中,转化试剂能够将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子A;转化试剂还能够将cfDNA样本中不含有甲基化CpG位点的第一DNA分子中的所有胞嘧啶都转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子B。第一DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些实施例中,转化试剂还能够将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第二DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子A,将cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第二DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子B。第二DNA分子如SEQ ID NO.2所示。在一些实施例中,转化试剂包括亚硫酸氢盐。
在一些实施例中,第一引物对用于PCR扩增第一转化后DNA分子A。第一荧光探针包括依次相连的第一荧光基团、第一DNA探针和第一淬灭基团。含有甲基化CpG位点的第一DNA分子在转化为第一转化后DNA分子A之后,未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,但是CpG位点中甲基化的胞嘧啶仍保持不变;不含有甲基化CpG位点的第一DNA分子被转化为第一转化后DNA分子B之后,所有胞嘧啶都被转化为尿嘧啶。因此,第一转化后DNA分子A与第一转化后DNA分子B的核苷酸序列存在不同。而本申请实施例中的第一引物对和第一荧光探针针对第一转化后DNA分子A进行设计,故其能够特异性扩增和结合第一转化后DNA分子A,而并不会扩增或结合第一转化后DNA分子B。
在一些实施例中,第二引物对用于PCR扩增第二转化后DNA分子。第二荧光探针包括依次相连的第二荧光基团、第二DNA探针和第二淬灭基团。含有甲基化CpG位点的第二DNA分子在转化为第二转化后DNA分子A之后,未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,但是CpG位点中甲基化的胞嘧啶仍保持不变;不含有甲基化CpG位点的第二DNA分子被转化为第二转化后DNA分子B之后,所有胞嘧啶都被转化为尿嘧啶。因此,第二转化后DNA分子A与第二转化后DNA分子B的核苷酸序列存在不同。而本申请实施例中的第二引物对和第二荧光探针针对第二转化后DNA分子A进行设计,故其能够特异性扩增和结合第二转化后DNA分子A,而并不会扩增或结合第二转化后DNA分子B。
在一些实施例中,cfDNA样本在进行PCR扩增时的每一个循环中,第一DNA探针对应整合入每条新扩增的第一转化后DNA分子A中,并且第一荧光基团与第一淬灭基团相分离。当第一荧光基团与第一淬灭基团相分离后,第一荧光基团的荧光发射不受第一淬灭基团的淬灭作用的影响。
在一些实施例中,cfDNA样本在进行PCR扩增时的每一个循环中,第二DNA探针对应整合入每条新扩增的第二转化后DNA分子A中,并且第二荧光基团与第二淬灭基团相分离。当第二荧光基团与第二淬灭基团相分离后,第二荧光基团的荧光发射不受第二淬灭基团的淬灭作用的影响。
在一些实施例中,第一荧光基团和第二荧光基团各自独立地选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX。
在一些实施例中,第一荧光基团和第二荧光基团为不同种类的荧光基团。
在一些实施例中,cfDNA样本来自血液、血清或血浆。
在一些实施例中,PCR为荧光定量PCR。
在一些实施例中,第一DNA探针与第一转化后DNA分子A相同或互补的序列具有10至25个连续的核苷酸。
在一些实施例中,第二DNA探针与第二转化后DNA分子A相同或互补的序列具有6至15个连续的核苷酸。
在一些实施例中,第一引物对包括如SEQ ID NO.3所示的第一正向引物和如SEQID NO.4所示的第一反向引物。
在一些实施例中,第二引物对包括如SEQ ID NO.5所示的第二正向引物和如SEQID NO.6所示的第二反向引物。
在一些实施例中,第一DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一些实施例中,第二DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一些实施例中,试剂盒还包括:第三引物对和第三荧光探针。第三引物对用于PCR扩增cfDNA样本中的内参基因。第三荧光探针包括依次相连的第三荧光基团、第三DNA探针和第三淬灭基团。第三DNA探针与内参基因的部分序列相同或互补。
在一些实施例中,内参基因选自ACTB基因(β-actin基因,或称肌动蛋白基因)、RNasn P基因(核糖核酸酶P基因)、GAPDH基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)、TBP基因(TATA结合蛋白基因)、HPRT基因(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因)中的任意一种。
在一些实施例中,第三引物对包括如SEQ ID NO.9所示的第三正向引物和如SEQID NO.10所示的第三反向引物。
在一些实施例中,第三DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在一些实施例中,cfDNA样本在进行PCR扩增时的每一个循环中,第三DNA探针一一对应整合入每条新扩增的内参基因中,并且第三荧光基团与第三淬灭基团相分离。
在一些实施例中,第三荧光基团选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX。
在一些实施例中,第三荧光基团与第一荧光基团、第二荧光基团为不同种类的荧光基团,以避免三种荧光基团共存于PCR反应液中时各自荧光的相互干扰。
在一些实施例中,PCR为荧光定量PCR。
在一些实施例中,第三DNA探针与内参基因相同或互补的序列具有7至12个连续的核苷酸。
在一些实施例中,试剂盒还包括:提取试剂和PCR扩增试剂等。
其中,提取试剂用于从离体样本中提取到cfDNA样本。离体样本为血浆、血清或血液。
PCR扩增试剂用于利用第一引物对和第一荧光探针对第一转化后DNA分子A进行PCR扩增,利用第二引物对和第二荧光探针对第二转化后DNA分子A进行PCR扩增。当PCR反应液中的还存在第三引物对和第三荧光探针时,PCR扩增试剂还能够利用第三引物对和第三荧光探针对内参基因进行PCR扩增。
在一些实施例中,本申请的试剂盒对于某个离体样本是否为早期肝癌阳性样本的判定方法如下:
采用转化试剂将cfDNA样本进行转化,然后将上述的各个试剂混合后制成PCR反应液,再进行PCR扩增,并实时检测PCR反应液的荧光强度。PCR反应液至少包括转化后的DNA样本、第一引物对、第一荧光探针、第二引物对、第二荧光探针和PCR扩增试剂。
在PCR反应液中的第一荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值并且第一转化后DNA分子A的扩增循环数(Ct值)大于第一循环阈值(如38至44)的条件下,对第一DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性。
在PCR反应液中的第二荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值并且第二转化后DNA分子A的扩增循环数(Ct值)大于第二循环阈值(如38至44)的条件下,对第二转化后DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性。
在对第一DNA分子和第二DNA分子的任意一者或两者判定为甲基化阳性时,判定cfDNA样本为早期肝癌阳性样本,否则判定cfDNA样本为早期肝癌阴性样本。具体而言,包括如下情况:
1.对cfDNA样本中的第一DNA分子判定为甲基化阴性,并且对cfDNA样本中的第二DNA分子判定为甲基化阴性时,则判定cfDNA样本为早期肝癌阴性样本。
2.对cfDNA样本中的第一DNA分子判定为甲基化阳性,并且对cfDNA样本中的第二转化后DNA分子判定为甲基化阴性时,则判定cfDNA样本为早期肝癌阳性样本。
3.对cfDNA样本中的第一DNA分子判定为甲基化阴性,并且对cfDNA样本中的第二转化后DNA分子判定为甲基化阳性时,则判定cfDNA样本为早期肝癌阳性样本。
4.对cfDNA样本中的第一DNA分子判定为甲基化阳性,并且对cfDNA样本中的第二转化后DNA分子判定为甲基化阳性时,则判定cfDNA样本为早期肝癌阳性样本。
在另一些实施例中,PCR反应液还包括第三引物对和第三荧光探针。此时,在PCR反应液中的第三荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值并且内参基因的扩增循环数(Ct值)小于或等于第三循环阈值(如30至32)的条件下,对本次的PCR扩增判定为有效扩增,那么本次的PCR扩增结果可以采信,否则判定为无效扩增,那么本次的PCR扩增结果不能采信,需要重新进行PCR扩增。
本申请的一些实施例提供了上述试剂盒的使用方法,该用方法包括如下步骤:
1.采用转化试剂将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子A,将cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第一DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子B,从而获得第一DNA样本;第一DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
2.提供第一引物对和第一荧光探针;第一引物对用于PCR扩增第一转化后DNA分子A;第一荧光探针包括依次相连的第一荧光基团、第一DNA探针和第一淬灭基团;
3.在第一DNA样本中加入第一引物对、第一荧光探针和PCR扩增试剂,得到第一PCR反应液,进行PCR扩增;
4.检测第一PCR反应液的荧光强度,在第一PCR反应液中的第一荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数;
5.在第一转化后DNA分子A的扩增循环数大于第一循环阈值的条件下,对第一DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性;
在对第一DNA分子判定为甲基化阳性时,判定cfDNA样本为早期肝癌阳性样本,否则判定cfDNA样本为早期肝癌阴性样本。
本申请的一些实施例提供了上述试剂盒的使用方法,该用方法包括采用提取试剂处理离体样本,得到cfDNA样本。
本申请的一些实施例提供的上述试剂盒的使用方法还包括:
采用转化试剂将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子A,将cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第一DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子B,从而获得第一DNA样本;第一DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。采用转化试剂将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第二DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子A,将cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第二DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子B,从而获得第二DNA样本;第二DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
提供第一引物对、第一荧光探针、第二引物对和第二荧光探针。第一引物对用于PCR扩增第一转化后DNA分子A。第一荧光探针包括依次相连的第一荧光基团、第一DNA探针和第一淬灭基团。第二引物对用于PCR扩增第二转化后DNA分子A。第二荧光探针包括依次相连的第二荧光基团、第二DNA探针和第二淬灭基团。
在转化后的DNA样本(含有上述的第一DNA样本和第二DNA样本)中加入第一引物对、第一荧光探针、第二引物对、第二荧光探针和PCR扩增试剂,得到第二PCR反应液,进行PCR扩增。
检测第二PCR反应液的荧光强度,在第二PCR反应液中的第一荧光基团的荧光强度和第二荧光基团的荧光强度均达到或超过荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数。
在第一转化后DNA分子A的扩增循环数大于第一循环阈值的条件下,对第一DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性;在第二转化后DNA分子A的扩增循环数大于第二循环阈值的条件下,对第二DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性;
在对第一DNA分子和第二DNA分子的任意一者或两者判定为甲基化阳性时,判定cfDNA样本为早期肝癌阳性样本,否则判定cfDNA样本为早期肝癌阴性样本。具体的判断方法详见关于试剂盒的描述部分,在此不再赘述。
在一些实施例中,第一循环阈值为38至44。
在一些实施例中,第二循环阈值为38至44。
在一些实施例中,试剂盒的使用方法还包括如下步骤:
1.提供第三引物对和第三荧光探针;第三引物对用于PCR扩增cfDNA样本中的内参基因;第三荧光探针包括依次相连的第三荧光基团、第三DNA探针和第三淬灭基团;
2.将第三引物对和第三荧光探针加入到上述的第一PCR反应液或第二PCR反应液中,进行PCR扩增;
3.在第三荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数;
4.在内参基因的扩增循环数小于或等于第三循环阈值的条件下,对PCR扩增判定为有效扩增,否则判定为无效扩增。
在本申请的一些实施例中,试剂盒包括能特异性检测如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的DNA分子的甲基化水平的试剂。
在本申请的一些实施例中,试剂盒还包括阳性参照物。上述的生物标记物的核苷酸序列中的所有的CpG位点均被甲基化后成为上述的阳性参照物,因此,阳性参照物中所有的CpG位点均为甲基化CpG位点。
在本申请的一些实施例中,试剂盒还包括阴性参照物。上述的生物标记物的核苷酸序列中的所有的CpG位点均被去甲基化后或者非甲基化成为上述的阴性参照物,因此,阴性参照物中所有的CpG位点均为非甲基化CpG位点,其不包括任何的甲基化CpG位点。
本申请实施例提供的生物标记物可作为检测早期肝癌时的阳性参照物和阴性参照物,可有效指示检测结果并修正检测结果的准确性。
由于采用上述任意实施例中的技术方案,本申请取得了如下的有益效果
本申请实施例的试剂盒以如SEQ ID NO.1所示的第一DNA分子和如SEQ ID NO.2所示的第二DNA分子作为检测标记物。本申请实施例利用转化试剂将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA分子转化为第一转化后DNA分子A,和/或,将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第二DNA分子转化为第二转化后DNA分子A。通过荧光定量PCR来判断第一DNA分子和/或第二DNA分子中CpG位点的甲基化程度,进而判定该cfDNA样本是否为早期肝癌阳性样本,从而指示源于该离体样本的生物体是否发生早期肝癌病变。本申请实施例的试剂盒基于其特定的生物标志物,对早期肝癌的阳性判断具有良好的特异性和灵敏度,可应用于早期肝癌的筛查。
具体实施方式
下面对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
需说明的是,以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外,在本申请的描述中,术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的型式存在;应当理解,以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁,不应理解为对本发明范围的硬性限制;因此,应当认为的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。
本申请实施例提供了一种分离的生物标记物或生物标记物组合作为早期肝癌的生物标记物的用途。生物标记物包括:如SEQ ID NO.1所示的第一DNA分子和/或如SEQ IDNO.2所示的第二DNA分子。第一DNA分子和第二DNA分子各自独立地包括甲基化CpG位点和未甲基化CpG位点。
可选地,在一些实施例中,用于生物标记物的第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为甲基化CpG位点。在另一些实施例中,用于生物标记物的第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为非甲基化CpG位点。
实验证明,可以根据受测者的cfDNA样本中第一DNA分子和第二DNA分子的CpG位点的甲基化程度来判定该受测者是否早期肝癌阳性患者或为早期肝癌阴性患者。如果判定为早期肝癌阳性患者,再结合组织学检测、影像学检测或者其它理化指标进行进一步的判断。
其中,第一DNA分子对应DOK1基因,其基因组坐标为chr2:74555005-74555272。第二DNA分子对应PITX1基因,其基因组坐标为chr5:135027454-135027645。基因组坐标均为hg38版本的人类参考基因组坐标。
在本申请的一些实施例中,“分离”的生物标记物是指从个体或生物样本中经提取分离、纯化的生物标记物,或者通过本领域已知的化学/生物方法合成的生物标记物,只需要具有的核苷酸序列即可。
在本申请的实施例中,生物标记物可以通过人工合成而成为全部CpG位点均被甲基化的核苷酸序列,从而该生物标记物可作为阳性参照物。在另一些实施例中,生物标记物组合可以通过人工合成而成为包括全部甲基化CpG位点的核苷酸序列,从而该生物标记物组合物可作为阳性参照物。
在本申请的实施例中,“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。哺乳动物的DNA甲基化一般发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸位点中的胞嘧啶上,表现为5-甲基胞嘧啶(5mC),而非CpG位点中的胞嘧啶一般不被甲基化修饰。使用亚硫酸氢盐对DNA进行处理后,DNA中非甲基化的胞嘧啶会被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶仍然保持不变。因此,在一般情况下,如果DNA分子中含有甲基化的CpG,那么在亚硫酸氢盐处理后,甲基化的CpG中的胞嘧啶由于被甲基化修饰而保持不变,而其他非甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶;如果DNA分子中不含有甲基化的CpG,那么所有胞嘧啶由于未被甲基化修饰则都会被转化为尿嘧啶。该尿嘧啶在PCR过程中与腺嘌呤相配对。
在本申请的实施例中,“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。寡核苷酸可以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
本申请实施例中的肝癌特指肝细胞癌。
本申请实施例提供了一种分离的生物标记物或生物标记物组合在制备用于检测早期肝癌的试剂盒中的用途,生物标记物包括:如SEQ ID NO.1所示的第一DNA分子和/或如SEQ ID NO.2所示的第二DNA分子。
在一些实施例中,用作生物标记物的第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为甲基化CpG位点。CpG位点全部被甲基化的核苷酸序列可以作为阳性参照。
在一些实施例中,用作生物标记物的第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为非甲基化CpG位点。而CpG位点全部未被甲基化的核苷酸序列可以作为阴性参照。
本申请实施例提供了一种分离的生物标记物组合作为用于判定离体样本是否为早期肝癌阳性样本的试剂盒的检测对象的用途,生物标记物组合包括:如SEQ ID NO.1所示的第一DNA分子和如SEQ ID NO.2所示的第二DNA分子。第一DNA分子和第二DNA分子各自独立地包括甲基化CpG位点和未甲基化CpG位点,或者第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为甲基化CpG位点,或者第一DNA分子和/或第二DNA分子的所有CpG位点均为非甲基化CpG位点。
本申请实施例提供了上述试剂盒的使用方法,该用方法包括如下步骤:
1.采用转化试剂将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子A;将cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第一DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子B,从而获得第一DNA样本。第一DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。转化试剂可以采用Zymo亚硫酸氢盐转化试剂盒。
2.提供第一引物对和第一荧光探针;第一引物对用于PCR扩增第一转化后DNA分子A。第一荧光探针包括依次相连的第一荧光基团、第一DNA探针和第一淬灭基团。
3.在第一DNA样本中加入第一引物对、第一荧光探针和PCR扩增试剂,得到第一PCR反应液,进行PCR扩增。
4.检测第一PCR反应液的荧光强度,在第一PCR反应液中的第一荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数;
在第一转化后DNA分子A的扩增循环数大于第一循环阈值的条件下,对第一DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性;
在对第一DNA分子判定为甲基化阳性时,判定cfDNA样本为早期肝癌阳性样本,否则判定cfDNA样本为早期肝癌阴性样本。
本申请实施例提供了一种检测早期肝癌的试剂盒,其用于鉴定离体样本是否为早期肝癌阳性样本。该试剂盒包括:第一引物对、第一荧光探针、第二引物对和第二荧光探针。
其中,第一引物对用于PCR扩增第一转化后DNA分子A。本申请实施例中的PCR可以为甲基化特异性荧光定量PCR。甲基化特异性荧光定量PCR在PCR扩增的指数时期,被扩增的DNA的Ct值(Cycle threshold,循环阈值)、最终荧光强度与该DNA的起始拷贝数存在线性关系,故能够进行定量。
第一荧光探针包括依次相连的第一荧光基团、第一DNA探针和第一淬灭基团。第一荧光基团可以选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX等荧光基团。上述各个荧光基团的性质如下表1所示。
表1各个荧光基团性质表
第一淬灭基团可以选自BHQ-1羧酸、BHQ-2羧酸、BHQ-3羧酸、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)和4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)。例如,VIC的淬灭基团可以为BHQ1,Cy5的淬灭基团可以为BHQ2。
在第一荧光探针中,第一荧光基团与第一DNA探针的5’末端相连,而第一淬灭基团与第一DNA探针的3’末端相连。当第一荧光探针完整时,第一荧光基团发射的荧光信号被第一淬灭基团吸收,从而第一荧光探针不发出荧光信号。当在甲基化特异性荧光定量PCR扩增的指数期时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将第一荧光探针酶切降解,使第一荧光基团与第一淬灭基团分离,并且第一DNA探针中与第一转化后DNA分子A相同或互补的序列对应整合入每条新扩增的第一转化后DNA分子A中。由此,当每一个第一荧光探针被酶切降解,其中的部分相关序列整合入每条新扩增的第一转化后DNA分子A后,就会有一个第一荧光基团被释放,此时,第一荧光基团与第一淬灭基团相分离,其荧光不会受到第一淬灭基团的淬灭作用。因此,第一荧光基团的数目和荧光强度与扩增的第一转化后DNA分子A存在线性关系,由此实现定量。第一DNA探针与第一转化后DNA分子A的部分序列相同或互补,因此,在PCR扩增的指数时期,也即DNA样本在进行PCR扩增时的每一个循环中,第一DNA探针中与第一转化后DNA分子A相同或互补的序列一一对应整合入每条新扩增的第一转化后DNA分子A中。本申请实施例中的第一引物对和第一荧光探针针对第一转化后DNA分子A进行设计,故其能够特异性扩增和结合第一转化后DNA分子A,而并不会扩增或结合第一转化后DNA分子B。
第二引物对用于PCR扩增转化后cfDNA样本中的第二转化后DNA分子A。
第二荧光探针包括依次相连的第二荧光基团、第二DNA探针和第二淬灭基团。第二荧光基团可以选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX等荧光基团,但是第二荧光基团与第一荧光基团为不同种类的荧光基团,以避免不同荧光基团所发射的荧光之间的相互干扰。第二淬灭基团可以选自BHQ-1羧酸、BHQ-2羧酸、BHQ-3羧酸、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)和4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)。在第二荧光探针中,第二荧光基团与第二DNA探针的5’末端相连,而第二淬灭基团与第二DNA探针的3’末端相连。第二荧光探针的作用机理可以参照第一荧光探针。第二DNA探针与第二转化后DNA分子A的部分序列相同或互补,从而转化后cfDNA样本在进行PCR扩增时的每一个循环中第二DNA探针中与第二转化后DNA分子A相同或互补的序列一一对应整合入每条新扩增的第二转化后DNA分子A中。本申请实施例中的第二引物对和第二荧光探针针对第二转化后DNA分子A进行设计,故其能够特异性扩增和结合第二转化后DNA分子A,而并不会扩增或结合第二转化后DNA分子B。
在本申请的实施例中,DNA样本来自血液、血清或血浆。例如,DNA样本可以为无细胞DNA(cell-free DNA,cfDNA)。cfDNA是人类外周血和其他循环体液中的片段化DNA。
cfDNA在血液中可以主要以缠绕核小体的形式存在,因为在该种情况下没有缠绕在核小体上的cfDNA会很快被降解。一个核小体上缠绕的cfDNA大约170bp,因此,cfDNA的主要片段在170bp存在一个主峰(相当于一个核小体),然后在340bp有一个小峰(相当于两个核小体),以此类推。
在另一些实施例中,cfDNA的长度也可以位于170bp至210bp之间(包括本数)。然而,在其它一些实施例中,cfDNA的长度也可以为180bp、185bp、190bp、195bp、200bp等。
在其它的一些实施例中,cfDNA的长度可以为170bp至210bp之间的任意一个数值的整数倍(根据所缠绕的核小体的个数确定)。例如为340bp、420bp等。
研究表明,在癌症患者的血浆中,cfDNA能够携带肿瘤DNA的突变和表观遗传畸变,特别是在肝癌早期会发生异常的DNA甲基化变化。哺乳动物的DNA甲基化主要发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸中的胞嘧啶上,表现为5-甲基胞嘧啶(5mC)。相对于正常肝组织,肝癌组织中常发生基因组DNA的全局低甲基化,以及位于CpG岛的DNA局部或全局高甲基化等。CpG岛的异常高甲基化可调控癌症相关基因的表达,从而在肝癌发生、发展过程中发挥重要作用。发明人研究发现,DOK1基因和PITX1基因的甲基化水平的异常与早期肝癌密切相关,表现在早期肝癌患者的血浆中,DOK1基因和PITX1基因的相关序列发生异常的甲基化,而非肝癌人群的血浆中,DOK1基因和PITX1基因的相关序列没有甲基化。因此,本申请实施例通过检测cfDNA样本中的DOK1基因和PITX1基因的特定序列的甲基化水平来对早期肝癌进行检测。
在本申请的实施例中,第一引物对包括如SEQ ID NO.3所示的第一正向引物和如SEQ ID NO.4所示的第一反向引物。第二引物对包括如SEQ ID NO.5所示的第二正向引物和如SEQ ID NO.6所示的第二反向引物。
在本申请的实施例中,第一DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。该段核苷酸序列在PCR扩增的每个循环中能够嵌入每条新扩增的第一转化后DNA分子A中,并且第一荧光基团和第一淬灭基团也会随着第一荧光探针的结构完整性被破坏而相分离。
在本申请的实施例中,第二DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。该段核苷酸序列在PCR扩增的每个循环中能够嵌入每条新扩增的第二转化后DNA分子A中,并且第二荧光基团和第二淬灭基团也会随着第二荧光探针的结构完整性被破坏而相分离
在本申请的实施例中,试剂盒还包括:第三引物对和第三荧光探针。
其中,第三引物对用于PCR扩增cfDNA样本中的内参基因。内参基因选自ACTB基因(β-actin基因,或称肌动蛋白基因)、RNasn P基因(核糖核酸酶P基因)、GAPDH基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)、TBP基因(TATA结合蛋白基因)、HPRT基因(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因)中的任意一种。第三引物对包括如SEQ ID NO.9所示的第三正向引物和如SEQ IDNO.10所示的第三反向引物。其中,ACTB基因相关区域的基因组坐标为chr7:5529432-5529682,其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
第三荧光探针包括依次相连的第三荧光基团、第三DNA探针和第三淬灭基团。第三荧光基团可以选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX等荧光基团,但是第三荧光基团与第一荧光基团、第二荧光基团为不同种类的荧光基团,以便荧光的相互干扰。第三淬灭基团可以选自BHQ-1羧酸、BHQ-2羧酸、BHQ-3羧酸、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)和4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)。第三荧光基团和第三淬灭基团的作用机理参照第一荧光基团和第一淬灭基团。第三DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。该段碱基序列在PCR扩增的每个循环中能够嵌入每条新扩增的内参基因中,并且第三荧光基团和第三淬灭基团也会随着第三荧光探针的结构完整性被破坏而相分离。
在一些实施例中,试剂盒还包括:提取试剂和/或PCR扩增试剂等。
其中,提取试剂用于从离体样本中提取到cfDNA样本。离体样本可以为血浆、血清或血液。使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)试剂盒作为提取试剂提取血清样本中的cfDNA。
PCR扩增体系包括25μL的Taq Pro HS Probe Master Mix。转化后的cfDNA样本的添加量为10μL。PCR的反应条件为:先在95℃时运行120s,进行预变性;然后在95℃时持续10s,60℃时持续30s,一共持续50个循环,最后在4℃时保存。当PCR反应液中还存在第三引物对和第三荧光探针时,PCR扩增试剂还能够利用第三引物对和第三荧光探针对cfDNA样本中的内参基因进行扩增。
在一些实施例中,本申请实施例还提供了一种试剂盒的使用方法,该使用方法包括如下步骤:
1.1采用转化试剂将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子A,将cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第一DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子B,从而获得第一DNA样本。采用转化试剂将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第二DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子A,将cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第二DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子B,从而获得第二DNA样本;
1.2提供第一引物对、第一荧光探针、第二引物对和第二荧光探针;第一引物对用于PCR扩增第一转化后DNA分子A;第一荧光探针包括依次相连的第一荧光基团、第一DNA探针和第一淬灭基团;第二引物对用于PCR扩增第二转化后DNA分子A;第二荧光探针包括依次相连的第二荧光基团、第二DNA探针和第二淬灭基团;
1.3在转化后的DNA样本(包括第一DNA样本和第二DNA样本)中加入第一引物对、第一荧光探针、第二引物对、第二荧光探针和PCR扩增试剂,得到第二PCR反应液,进行PCR扩增。检测第二PCR反应液的荧光强度,在第二PCR反应液中的第一荧光基团的荧光强度和第二荧光基团的荧光强度均达到或超过荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数;
1.4在第一转化后DNA分子A的扩增循环数大于第一循环阈值的条件下,对第一DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性;在第二转化后DNA分子A的扩增循环数大于第二循环阈值的条件下,对第二DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性。在对第一DNA分子和第二DNA分子的任意一者判定为甲基化阳性时,判定cfDNA样本为早期肝癌阳性样本,否则判定cfDNA样本为早期肝癌阴性样本。
第一循环阈值可以为38至44,例如为38、39、40、41、42、43、44。
第二循环阈值可以为38至44,例如为38、39、40、41、42、43、44。
在一些实施例中,试剂盒的使用方法包括如下步骤:采用提取试剂处理离体样本,得到上述的cfDNA样本。
在一些实施例中,试剂盒的使用方法包括如下步骤:
3.1提供第三引物对和第三荧光探针;第三引物对用于PCR扩增DNA样本中的内参基因;第三荧光探针包括依次相连的第三荧光基团、第三DNA探针和第三淬灭基团;
3.2将第三引物对和第三荧光探针与PCR扩增试剂一起加入转化后的cfDNA样本中,进行PCR扩增;在第三荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数;
3.3在内参基因的扩增循环数小于或等于第三循环阈值的条件下,对PCR扩增判定为有效扩增,否则判定为无效扩增。
其中,第3.3步用于判断某次PCR扩增产物是否可以采信。如果可以采信,说明本次PCR扩增结果有效,可以进行后继判定工作。如果不可以采信,说明本次PCR扩增结果无效,需要进行新的PCR扩增。
在上述实施例的试剂盒的使用方法中,需要获得每个基因的荧光信号达到荧光阈值所需的循环数(即Ct值)。上述的每个基因指的是对应于第一DNA分子的DOK1基因、对应于第二DNA分子的PITX1基因、对应于内参基因的ACTB基因。但是内参基因也不限于ACTB基因。
在一些实施例中,与三种荧光基团所对应的荧光阈值可以相同,也可以不同。例如,第一荧光基团的荧光值可以对应第一荧光阈值,第二荧光基团的荧光值可以对应第二荧光阈值,第三荧光基团的荧光值可以对应第三荧光阈值。那么此时第一荧光阈值、第二荧光阈值和第三荧光阈值的具体数据存在不同。
以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明。
本申请的各个实施例采用的离体样本包括:分别来自于100例健康人(无肝癌)的血液样本、分别来自于150例乙肝和肝硬化患者(无肝癌)的血液样本、以及分别来自于150例肝癌患者的血液样本。血液样本均保存于游离DNA专用采血管(Streck)中,内含抗凝剂和细胞稳定剂等成分。然后采用本申请实施例中的试剂盒对上述离体样本分别按照以下的方法进行处理。
本实施例的方法包括如下步骤:
1.采用提取试剂处理离体样本(即血液样本),得到cfDNA样本。该步骤具体包括:
对上述的离体样本(血液样本)分别进行离心,获取血浆样本。使用QIAampCirculating Nucleic Acid Kit(Qiagen)试剂盒提取血浆样本中的cfDNA样本。提取方法参照该试剂盒的使用说明书。
2.采用转化试剂处理cfDNA样本,将cfDNA样本中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到转化后cfDNA样本(含有第一转化后DNA分子A、第一转化后DNA分子B、第二转化后DNA分子A和第二转化后DNA分子B)。该步骤具体包括:
从步骤1获得的cfDNA样本取10ng cfDNA,采用Zymo亚硫酸氢盐转化试剂盒对cfDNA进行转化。转化过程是将cfDNA样本中非甲基化的胞嘧啶都转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则会仍保持胞嘧啶不变。
3.提供第一引物对、第一荧光探针、第二引物对、第二荧光探针、第三引物对、第三荧光探针和PCR扩增试剂,具体如下所示:
第一引物对包括如SEQ ID NO.3所示的第一正向引物和如SEQ ID NO.4所示的第一反向引物。第一引物对用于PCR扩增转化后cfDNA样本中的第一转化后DNA分子A。第一DNA分子来自DOK1基因。
第一荧光探针包括依次相连的第一荧光基团、第一DNA探针和第一淬灭基团。第一荧光基团为FAM。第一DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,其与第一转化后DNA分子A具有相同的连续碱基序列:AACCTCCTTCCCCGTCG。第一淬灭基团为BHQ-3。
第二引物对包括如SEQ ID NO.5所示的第二正向引物和如SEQ ID NO.6所示的第二反向引物。第二引物对用于PCR扩增第二转化后DNA分子A。第二DNA分子来自PITX1基因。
第二荧光探针包括依次相连的第二荧光基团、第二DNA探针和第二淬灭基团。第二荧光基团为Cy5。第二DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,其与第二转化后DNA分子A相同的连续碱基序列为CGCACC。第二淬灭基团为BHQ-2。
第三引物对包括如SEQ ID NO.9所示的第三正向引物和如SEQ ID NO.10所示的第三反向引物。第三引物对用于PCR扩增内参基因,内参基因为ACTB基因,其核苷酸序列如SEQID NO.12所示。
第三荧光探针包括依次相连的第三荧光基团、第三DNA探针和第三淬灭基团。第三荧光基团为VIC。第三DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示,其与内参基因相同的连续碱基序列为TCATCATC。第三淬灭基团为BHQ-1。
PCR扩增试剂包括Taq Pro HS Probe Master Mix,其含有DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。
4.在DNA样本中加入第一引物对、第一荧光探针、第二引物对、第二荧光探针、第三引物对、第三荧光探针和PCR扩增试剂,得到PCR反应液,进行PCR扩增。检测所获得的PCR反应液的荧光强度,在第一荧光基团的荧光值、第二荧光基团的荧光值、第三荧光基团的荧光值均超过各自的荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数。采用Bio-Rad荧光定量PCR仪进行PCR扩增和荧光检测。其中,第一荧光基团的荧光值需要超过第一荧光阈值,第二荧光基团的荧光值需要超过第二荧光阈值,第三荧光基团的荧光值需要超过第三荧光阈值。
其中,PCR反应液的组分如下表2所示。
表2PCR反应液的组分
在表2中,正向引物包括第一正向引物、第二正向引物和第三正向引物。反向引物包括第一反向引物、第二反向引物和第三反向引物。荧光探针包括第一荧光探针、第二荧光探针和第三荧光探针。本实施例中,上述引物和荧光探针与DNA样本混合在一起检测,因为第一荧光基团FAM为绿色光,第二荧光基团Cy5为红色光,第三荧光基团VIC为黄色光,三种荧光基团的发光颜色不同,相互之间不会产生干扰,因此,能够混合在一起检测。在其它实施例中,第一引物对和第一荧光探针、第二引物对和第二荧光探针、第三引物对和第三荧光探针还可以分别与转化后cfDNA样本和PCR扩增试剂相混合,并单独进行检测。
PCR反应的条件如下表3所示。
表3PCR反应的条件
5.在第一转化后DNA分子A(对应DOK1基因)的扩增循环数(Ct值)大于第一循环阈值(数值为40)的条件下,对第一DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性。因为甲基化cfDNA来自于癌细胞,癌细胞数目的多少决定了甲基化cfDNA的丰度和含量。cfDNA样本中甲基化程度越高,则Ct值小。而cfDNA样本中甲基化程度越低,则Ct值大。由此,可以根据Ct值来判断甲基化程度。
在第二转化后DNA分子A(对应PITX1基因)的扩增循环数(Ct值)大于第二循环阈值(数值为40)的条件下,对第二DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性。在对第一DNA分子和第二DNA分子的任意一者判定为甲基化阳性时,判定DNA样本为早期肝癌阳性样本,否则判定DNA样本为早期肝癌阴性样本。
具体而言,包括如下情况:
1.对DNA样本中的第一DNA分子判定为甲基化阴性,并且对DNA样本中的第二DNA分子判定为甲基化阴性时,则判定DNA样本为早期肝癌阴性样本。
2.对DNA样本中的第一DNA分子判定为甲基化阳性,并且对DNA样本中的第二DNA分子判定为甲基化阴性时,则判定DNA样本为早期肝癌阳性样本。
3.对DNA样本中的第一DNA分子判定为甲基化阴性,并且对DNA样本中的第二DNA分子判定为甲基化阳性时,则判定DNA样本为早期肝癌阳性样本。
4.对DNA样本中的第一DNA分子判定为甲基化阳性,并且对DNA样本中的第二DNA分子判定为甲基化阳性时,则判定DNA样本为早期肝癌阳性样本。
另外,在PCR反应液中的第三荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值并且内参基因的扩增循环数(Ct值)小于或等于第三循环阈值(如30至32)的条件下,对PCR扩增判定为有效扩增,那么本次的PCR扩增结果可以采信,否则判定为无效扩增,那么本次的PCR扩增结果不能采信,需要重新进行PCR扩增。在排除掉不可采信的结果之后,对于能够采信的结果进行统计,结果如表4所示。
另外,因为甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)是常见的肝癌检测的血液标志物,故以AFP的检测结果作为对照实验。通过甲胎蛋白检测试剂盒(免疫层析法)来检测上述离体样本(血液样本)中的AFP浓度。当血清中的AFP浓度大于20ng/μL时,则判定该离体样本为肝癌检测阳性样本;当血清中的AFP浓度小于或等于20ng/μL时,则判定该样本为肝癌检测阴性样本。将判定结果与受检者的病理检验结果相对照,计算出使用AFP进行检测的灵敏度和特异性。结果如表4所示。
表4本申请实施例中的检测结果表
根据表4的结果可知,当仅对DOK1基因和PITX1基因进行检测时,其灵敏度和特异性已经高于AFP。而当对DOK1基因和PITX1基因进行联合检测时,可以到达较高的肝癌检测灵敏度和特异性,其性能明显好于传统的血清蛋白标志物AFP。
本领域技术人员可以理解,可采用本领域已知的DNA甲基化水平检测方法检测上述核苷酸序列的甲基化水平,例如甲基化特异性PCR方法、亚硫酸氢盐处理及测序方法、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析方法、甲基化特异性荧光定量PCR方法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析方法或焦磷酸测序方法。相应地,反应试剂及检测试剂为上述方法中所必须的试剂。在一些实施例中,反应试剂选自重亚硫酸盐或其衍生物。
本申请中,“患者”或“受试者”是指首诊罹患早期肝癌的人类,患者可以是正在接受早期肝癌治疗的个体,或是希望使用本申请方法进行检测或诊断的任何个体。
“甲基化水平”代表核苷酸序列中一个或多个位点处于甲基化状态的比例,例如全基因组DNA中一个区域/区间的甲基化水平是指该区域/区间中所有CpG位点处于甲基化状态的比例,全基因组DNA的平均甲基化水平是指全基因组DNA中所有区域/区间的甲基化水平的均值。本领域知晓将检测DNA甲基化的方法(例如简化甲基化测序)所得的结果转化为甲基化水平的过程。
本申请一些实施例中的DNA可以为单链DNA(SinglestrandedDNA,或称ssDNA)。本申请一些实施例中的DNA可以为双链DNA(DoublestrandedDNA,或称dsDNA)。
在本申请中,DNA分子A、DNA分子B仅用于区分不同的DNA分子,并非意味着DNA分子A、DNA分子B是同一DNA分子的互补链。例如,第一转化后DNA分子A与第一转化后DNA分子B是不同的DNA分子,二者的核苷酸序列不同,但是并不互补。例如,第二转化后DNA分子A与第二转化后DNA分子B是不同的DNA分子,二者的核苷酸序列不同,但是并不互补。
文中的较佳实施方法与材料仅作示范之用,但不能限制本申请的内容。
除非另有说明,本申请实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过本领域已知方法制备。
本申请实施例中涉及的试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)购自凯杰生物技术(上海)有限公司。Zymo亚硫酸氢盐转化试剂盒购自Zymo公司。检测离体样本(血清样本)中的AFP浓度采用甲胎蛋白检测试剂盒(免疫层析法)。PCR扩增试剂盒购自诺唯赞公司。荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司。
本申请实施例中所有操作均符合制造商的说明。
以上对本申请实施例所提供的用于检测早期肝癌的生物标记物、试剂盒及其应用进行了详细介绍,本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想;同时,对于本领域的技术人员,依据本申请的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,综上,本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
Claims (10)
1.一种分离的生物标记物作为早期肝癌的生物标记物的用途,所述生物标记物包括:如SEQ ID NO.1所示的第一DNA分子和/或如SEQ ID NO.2所示的第二DNA分子。
2.一种分离的生物标记物作为用于判定离体样本是否为早期肝癌阳性样本的试剂盒的检测对象的用途,所述生物标记物包括:如SEQ ID NO.1所示的第一DNA分子和/或如SEQID NO.2所示的第二DNA分子;
可选地,所述第一DNA分子选自基因组坐标为chr2:74555005-74555272的DOK1基因;和/或
所述第二DNA分子选自基因组坐标为chr5:135027454-135027645的PITX1基因。
3.一种用于鉴定早期肝癌阳性样本的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
转化试剂,将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子A,将所述cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的所述第一DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子B;所述第一DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;和/或,将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第二DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子A,将所述cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的第二DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子B,所述第二DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
第一引物对,用于PCR扩增所述第一转化后DNA分子A,以及,第一荧光探针,包括依次相连的第一荧光基团、第一DNA探针和第一淬灭基团;和/或,第二引物对,用于PCR扩增所述第二转化后DNA分子A,以及,第二荧光探针,包括依次相连的第二荧光基团、第二DNA探针和第二淬灭基团;
其中,所述PCR为甲基化特异性荧光定量PCR。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述第一荧光基团和所述第二荧光基团各自独立地选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX;和/或
所述第一荧光基团和所述第二荧光基团为不同种类的荧光基团;和/或
所述cfDNA样本来自血液、血清或血浆;和/或
所述第一引物对包括如SEQ ID NO.3所示的第一正向引物和如SEQ IDNO.4所示的第一反向引物;和/或
所述第二引物对包括如SEQ ID NO.5所示的第二正向引物和如SEQ IDNO.6所示的第二反向引物;和/或
所述第一DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;和/或
所述第二DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:
第三引物对,用于PCR扩增所述cfDNA样本中的内参基因;以及
第三荧光探针,包括依次相连的第三荧光基团、第三DNA探针和第三淬灭基团。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述内参基因选自ACTB基因、RNasn P基因、GAPDH基因、TBP基因、HPRT基因中的任意一种;和/或
所述第三引物对包括如SEQ ID NO.9所示的第三正向引物和如SEQ IDNO.10所示的第三反向引物;和/或
所述第三DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示;和/或
所述第三荧光基团选自FAM、Cy5、VIC、TET、HEX、JOE、ROX;和/或
所述第三荧光基团与所述第一荧光基团、所述第二荧光基团为不同种类的荧光基团。
7.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:提取试剂,从离体样本中提取到所述cfDNA样本;和/或
所述转化试剂包括亚硫酸氢盐;和/或
PCR扩增试剂,利用所述第一引物对和所述第一荧光探针对所述第一转化后DNA分子A进行PCR扩增;和/或,利用所述第二引物对和所述第二荧光探针对所述第二转化后DNA分子A进行PCR扩增。
8.用于鉴定早期肝癌阳性样本的试剂盒的使用方法,其特征在于,所述使用方法包括如下步骤:
采用转化试剂将cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第一DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子A,将所述cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的所述第一DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第一转化后DNA分子B,从而获得第一DNA样本;所述第一DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
提供第一引物对和第一荧光探针;所述第一引物对用于PCR扩增所述第一转化后DNA分子A;所述第一荧光探针包括依次相连的第一荧光基团、第一DNA探针和第一淬灭基团;
在所述第一DNA样本中加入所述第一引物对、所述第一荧光探针和PCR扩增试剂,得到第一PCR反应液,并进行PCR扩增;
检测所述第一PCR反应液的荧光强度,在所述第一PCR反应液中的所述第一荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数;
在所述第一转化后DNA分子A的扩增循环数大于第一循环阈值的条件下,对所述第一DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性;
在对所述第一DNA分子判定为甲基化阳性时,判定所述cfDNA样本为早期肝癌阳性样本,否则判定所述cfDNA样本为早期肝癌阴性样本。
9.根据权利要求8所述的使用方法,其特征在于,所述使用方法包括如下步骤:采用提取试剂处理离体样本,得到所述cfDNA样本;和/或
所述使用方法包括如下步骤:
采用所述转化试剂将所述cfDNA样本中含有甲基化CpG位点的第二DNA分子中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子A,将所述cfDNA样本中不含甲基化CpG位点的所述第二DNA分子中所有的胞嘧啶转化为尿嘧啶,得到第二转化后DNA分子B,从而获得第二DNA样本;所述第二DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
提供第二引物对和第二荧光探针;所述第二引物对用于PCR扩增所述第二转化后DNA分子A;所述第二荧光探针包括依次相连的第二荧光基团、第二DNA探针和第二淬灭基团;
在所述第二DNA样本中加入所述第二引物对、所述第二荧光探针,并与所述第一PCR反应液混合后得到第二PCR反应液,进行PCR扩增;
检测所述第二PCR反应液的荧光强度,在所述第二PCR反应液中的所述第一荧光基团的荧光强度和所述第二荧光基团的荧光强度均达到或超过荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数;
在所述第一转化后DNA分子A的扩增循环数大于第一循环阈值的条件下,对所述第一DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性;在所述第二转化后DNA分子A的扩增循环数大于第二循环阈值的条件下,对所述第二DNA分子判定为甲基化阴性,否则判定为甲基化阳性;
在对所述第一DNA分子和所述第二DNA分子中的任意一者或两者判定为甲基化阳性时,判定所述cfDNA样本为早期肝癌阳性样本,否则判定所述cfDNA样本为早期肝癌阴性样本。
10.根据权利要求9所述的使用方法,其特征在于,所述使用方法包括如下步骤:
所述第一循环阈值为38至44;和/或
所述第二循环阈值为38至44;和/或
所述使用方法包括如下步骤:
提供第三引物对和第三荧光探针;所述第三引物对用于PCR扩增所述cfDNA样本中的内参基因;所述第三荧光探针包括依次相连的第三荧光基团、第三DNA探针和第三淬灭基团;
将所述第三引物对和所述第三荧光探针加入所述第一PCR反应液或所述第二PCR反应液,进行所述PCR扩增;
在所述第三荧光基团的荧光强度达到或超过荧光阈值后,记录下所需的PCR扩增循环数;
在所述内参基因的扩增循环数小于或等于第三循环阈值的条件下,对所述PCR扩增判定为有效扩增,否则判定为无效扩增。
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