CN106011295A - 一种在食管鳞癌显著上调的基因的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在食管鳞癌显著上调的基因的应用，该基因为KRT80，实验证明，KRT80基因在食管鳞癌组织中表达上调，KRT80基因的过表达能促进食管鳞癌细胞的生长，抑制KRT80基因的过表达可以抑制食管鳞癌细胞的过度增殖，促进食管鳞癌细胞的凋亡。鉴于此，KRT80可作为可能的靶标应用于临床，用于食管鳞癌患者的诊断和治疗。

Description

一种在食管鳞癌显著上调的基因的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种在食管鳞癌显著上调的基因的应用，具体的涉及在食管鳞癌显著上调的KRT80的应用。
背景技术
食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全球肿瘤发病率的第八位，死亡率占癌症相关死亡率的第六位。根据组织病理类型分类，食管癌可分为两种主要类型：食管腺癌和食管鳞癌。它们的病因学因素、流行病学特点和地理分布存在很大的差异。食管腺癌主要分布在西方国家，并且近20年来也表现出发病率上升的趋势。其中的原因目前尚不完全清楚，但也发现了一些主要的危险因素，包括男性、白色人种和慢性返流疾病家族史等因素。相对而言，食管鳞癌主要分布于发展中国家，并且在中亚和里海地区的发病率非常集中，这些地区被称为“中亚食管癌带”。
食管鳞癌在所有食管癌病例中约占90％，而中国是食管鳞癌的高发地区，其中约70％发生在中国。在过去三十年中，食管鳞癌的诊断，分期和治疗水平均有很大提高。然而，食管鳞癌的长期预后仍然难言乐观，五年生存率只有15％-25％。与其它已经被广泛研究的肿瘤如乳腺癌、肺癌不同，人们对食管鳞癌的发病机制的认识仍然很有限，这给食管鳞癌的早期诊断和治疗带来了很多困难。
食管鳞癌已经成为目前世界上严重威胁人类生命健康的疾病之一。与其他的恶性肿瘤一样，食管鳞癌的演进是一个复杂的病理过程，其一般演进模式为正常食管鳞癌上皮—食管上皮基底细胞过度增生—不典型增生—原位癌—食管鳞癌。其不仅包括了正常细胞的恶变，还包括了肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。但是，到目前为止，食管鳞癌的发病机制尚不十分清楚，而对于食管鳞癌的治疗目前并行之有效的方法。因此，探讨食管鳞癌的发生、发展、浸润和转移的确切机制，寻找食管鳞癌诊断的分子标志物，对于更有效的预防和治疗食管鳞癌都具有重要的临床意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食管鳞癌的分子靶标，用于食管鳞癌的诊断和治疗。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种基因及其表达产物在制备诊断食管鳞癌的产品中的应用，，所述基因为KRT80。
进一步，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测KRT80基因及其表达产物的表达水平以诊断食管鳞癌的产品。
其中，所述用RT-PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增KRT80基因的引物；所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增KRT80基因的引物；所述用免疫检测诊断食管鳞癌的产品包括：与KRT80蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断食管鳞癌的产品包括：与KRT80基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断食管鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KRT80蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KRT80基因的核酸序列杂交的探针。
进一步，所述用实时定量PCR诊断管鳞癌的产品至少包括的一对特异扩增KRT80基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种诊断食管鳞癌的产品，所述产品能够通过检测样本中KRT80基因的表达水平来诊断食管鳞癌。
其中，所述“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为组织。
进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KRT80基因转录水平的针对KRT80基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KRT80蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KRT80基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KRT80蛋白的特异性抗体。
进一步，所述试剂包括针对KRT80基因的引物和/或探针。
本发明所述的基因芯片或基因检测试剂盒可用于检测包括KRT80基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括KRT80蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。将食管鳞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。
本发明提供了KRT80基因及其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括KRT80基因和/或其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制KRT80基因表达的物质、抑制KRT80基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制KRT80基因表达产物活性的物质。
进一步，所述抑制剂是针对KRT80基因的siRNA、针对KRT80蛋白的抗体；优选的，所述抑制剂为siRNA。
在本发明的具体实施方式中，所述针对KRT80基因的siRNA的序列如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了一种治疗食管鳞癌的药物组合物，所述药物包含KRT80基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制KRT80基因表达的物质、抑制KRT80基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制KRT80基因表达产物活性的物质。
进一步，上述的药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
本发明的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。
本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。
本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。本发明的药物组合物可以用于补充内源性的KRT80蛋白的缺失或不足，通过提高KRT80蛋白的表达或增强KRT80蛋白的功能，从而治疗因KRT80蛋白减少导致的食管鳞癌。
本发明的药物还可与其他治疗食管鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。
本发明所述的药物组合物也可以脂质体输送系统形式给药，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可有多种磷脂形成，如胆甾醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。
本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
在本发明中，“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleic acid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleicacid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
本发明中所述KRT80蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段、组合抗体等，只要它们展现出期望的生物学活性。
本发明中“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。
克隆抗体在本发明中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
“完整抗体”在本发明中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。优选的是，完整抗体具有功能性Fc区。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2指定的编码序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。
在本发明的上下文中，KRT80基因表达产物包括人KRT80蛋白以及KRT80蛋白的部分肽。所述KRT80蛋白的部分肽含有与食管鳞癌病相关的功能域。
“KRT80蛋白”包括KRT80蛋白以及KRT80蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括KRT80蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物或其突变体。突变体包括等位变异体、天然突变体、诱导突变体、其氨基酸序列通过缺失、替代、增加和/或插入发生变异的突变体、在高或低的严紧条件下能与人KRT80的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是KRT80蛋白的融合蛋白。对于与KRT80蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留KRT80蛋白的生物学活性即可。
在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
在本发明中，术语“治疗”是指包括但不限于治愈，减缓(减少)靶定的病理状况或病症或防止复发。包括但不限于，(1)抑制作用，在一定程度上抑制疾病进展，其包括减缓以及完全抑制；(2)减少疾病发作和/或症状的数量；(3)减少病灶尺寸；(4)抑制(即减少、减缓或完全阻止)疾病细胞渗透到相邻的周边器官和/或组织；(5)抑制(即减少、减缓或完全阻止)疾病传播；(6)在一定程度上缓解与疾病相关联的一种或多种症状；(7)治疗后增加无病表现的时间长度；(8)在治疗后的给定时间点减少死亡率；和/或(9)治疗后无副作用。本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了与食管鳞癌发生发展相关的分子标志物—KRT80，通过检测受试者食管组织中KRT80的表达，可以判断受试者是否患有食管鳞癌。
本发明提供了治疗食管鳞癌的分子靶标，通过靶向于分子标志物来治疗疾病具有敏感性和特异性。
本发明对食管鳞癌的机制研究提供了一定的理论基础。
附图说明
图1显示利用QPCR检测KRT80基因在食管鳞癌组织中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测KRT80基因在食管细胞中的表达情况；
图3显示利用QPCR检测siRNA对KRT80基因表达的影响；
图4显示软琼脂克隆形成实验检测KRT80表达对细胞增殖的影响；
图5显示利用transwell小室检测KRT80基因对食管鳞癌细胞侵袭的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与食管鳞癌相关的基因标志物
1、样品收集
各收集6例周围正常食管粘膜组织和食管鳞癌组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)
取出冻存于液氮中的组织样本，把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：
1)加入Trizol，室温放置5min；
2)加入氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；
3)12000rpm离心15min，将上层水相移到另一新的离心管中(注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质)，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；
4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混匀，4℃，12000rpm离心5min；
5)弃去乙醇液体，室温下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；
6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃冰箱。
3、逆转录和标记
用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。
4、杂交
基因芯片采用Aglient公司的人全基因组表达谱芯片,每张芯片包括45015个寡核苷酸，其中有43376个人基因探针和1639个实验控制探针。按芯片使用说明书的步骤进行，温度在65℃，经17h 10r/min滚动杂交，37℃洗片。
5、数据处理
杂交后芯片用Agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描1次，2次结果Agilent软件自动合并。扫描图像数据采用FeatureExtraction进行处理分析，得到的原始数据应用Bioconductor程序包进行后续数据处理。最后Ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准：ratio≥4为上调基因，ratio≤0.25为下调基因。
6、结果
与正常食管粘膜组织相比，KRT80基因在食管鳞癌组织中的表达量显著上调。
实施例2QPCR测序验证KRT80基因的差异表达
1、对KRT80基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常食管组织和食管鳞癌组织各50例。
2、RNA提取步骤如实施例1所述。
3、逆转录：
1)反应体系：
试剂 体积
MgCl2 2μl
10×RT Buffer 1μl
无Rnase水 3.75μl
dNTP混合液 1μl
Rnase抑制剂 0.25μl
AMV反转录酶 0.5μl
寡聚dT适配子引物 0.5μl
实验样品 1μl
2)逆转录反应条件
按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆转录反应条件进行。
42℃～55℃60min，99℃2min，5℃5min。
3)聚合酶链反应
1)引物设计
根据Genebank中KRT80基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：
KRT80基因：
正向引物为5’-GGAGAAGGTTGAGGAGTT-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GCTGAACAAAGGTGAACT-3’(SEQ ID NO.4)。
管家基因GAPDH的引物序列为：
正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)
反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)
2)按照表1配制PCR反应体系：
表1PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
Takara Ex Taq HS 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃45s)×30个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与周围正常食管粘膜组织相比，KRT80基因在食管鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3KRT80基因在食管癌细胞系中的差异表达
1、细胞培养
人食管鳞癌细胞株KYSE 150、KYSE450购自中科院肿瘤研究所，正常食管上皮细胞株Het-1a购自于广州吉尼欧公司。以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、细胞总RNA的提取
1)胰酶消化贴壁细胞，吹打获得的细胞经离心、重悬、清洗后，以1640培养基(10％小牛血清)重悬；
2)将重悬的细胞转移至6孔板(/孔)，添加培养基至2m1/孔，轻摇6孔板使细胞均匀重悬；
3)细胞贴壁生长48h，去培养基；
4)以1ml Trizol试剂裂解细胞，反复吹打6孔板壁，尽量使细胞完全裂解；
5)转移细胞裂解液至1.5ml DEPC处理过的EP管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步骤同组织中RNA提取过程。
3、逆转录
具体步骤同实施例2.
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2所示，与食管上皮细胞相比，KRT80基因在食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例4KRT80基因的沉默
1、细胞培养
人食管鳞癌细胞株KYSE 150，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、siRNA设计
针对KRT80基因的siRNA序列：
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：
正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.7)，
反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.8)；
siRNA1-KRT80：
正义链为5’-AUCUAAUGCAGUCUAGAAGAG-3’(SEQ ID NO.9)，
反义链为5’-CUUCUAGACUGCAUUAGAUUC-3’(SEQ ID NO.10)；
siRNA2-KRT80：
正义链为5’-UGACAUUUCGGUGAUUUUGAU-3’(SEQ ID NO.11)，
反义链为5’-CAAAAUCACCGAAAUGUCAGA-3’(SEQ ID NO.12)；
将细胞按5×105/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为对照组(KYSE 150)阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-KRT80、siRNA2-KRT80、)，其中阴性对照组siRNA与KRT80基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。
3、QPCR检测KRT80基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
具体步骤同实施例3。
3.2逆转录 步骤同实施例2。
3.3QPCR扩增 步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，干扰KRT80基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图3显示，相比KYSE 150、转染空载siRNA-NC、siRNA2-KRT80组，siRNA1-KRT80组能够显著降低KRT80基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例5KRT80基因对食管鳞癌细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测KRT80基因对细胞凋亡的影响。
1、细胞培养 步骤同实施例3。
2、细胞转染 步骤同实施例3。
3、步骤
细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×106个/ml，取200μl上述细胞悬液放置到Eppendorf管中，加入10μl Annexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果：
转染siRNA1-KRT80组的细胞凋亡率为(17.31±0.015)％，转染siRNA-NC空载体组的细胞凋亡率为(6.27±0.009)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，KRT80基因的过表达抑制食管鳞癌细胞的凋亡。
实施例6软琼脂克隆形成实验
1、用0.25％胰蛋白酶消化转染后处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。
2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×103个/ml。
3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。
4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO2温箱中备用。
5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×103个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。
6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。
7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。
8、结果
结果如图4所示，与其他组相比，siRNA1-KRT80组单细胞克隆集落形成数显著降低。
实施例7Transwell细胞体外侵袭实验
1、向Transwell小室的上孔中加入100μl的无血清培养液Matrigel浸泡30min。
2、用胰酶消化处于对数生长期的稳定感染后各组细胞，PBS清洗细胞3次，用含有10％血清的培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×105/ml。
3、向包被有Matrigel的Transwell小室的上室中加入细胞悬液200μl。
4、Transwell小室的下室中加入600μl含20％FBS的DMEM培养液。
5、37℃，5％CO2温箱内培养24h。
6、除去上室和下室中的培养液，用棉签刮除上室中的Matrigel和存留的细胞，用PBS清洗2次。
7、用1％结晶紫染色液染色45min，PBS清洗1次。
8、随机选取4个100倍视野，在显微镜下分别计数侵袭细胞数，每种不同类型的细胞设3个复孔，共重复3次。
9、数据处理
用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
10、结果
结果如图5所示，KYSE150、siRNA1-KRT80、siRNA-NC组细胞在transwell小室中培养24h后，siRNA1-KRT80组聚碳酸酯膜下室面的细胞数显著减少。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基因及其表达产物在制备诊断食管鳞癌的产品中的应用，其特征在于，所述基因为KRT80。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测KRT80基因及其表达产物的表达水平以诊断食管鳞癌的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异性扩增KRT80基因的引物，所述引物如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
4.一种诊断食管鳞癌的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测样本中KRT80基因的表达水平来诊断食管鳞癌。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。
6.KRT80基因及其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括KRT80基因和/或其表达产物的抑制剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制KRT80基因表达的物质、抑制KRT80基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制KRT80基因表达产物活性的物质。
9.一种治疗食管鳞癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求7或8所述的抑制剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
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