CN110151758A - 青蒿素在制备抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物的应用 - Google Patents

青蒿素在制备抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了青蒿素在制备抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物的应用，通过抑制人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞的增殖，和/或，调整人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞内的miRNA表达谱实现。所述青蒿素浓度≤100μM；所述药物的剂型为冲剂或胶囊。本发明还公开了一种含青蒿素的抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物冲剂、一种含青蒿素的抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物胶囊及其制备方法。在青蒿素药物作用下，抑制人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞的增殖，调控人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞中miRNA表达谱变化，发现潜在调控肝癌的miRNA，为青蒿素在肝癌治疗策略发展中奠定基础。

Description

青蒿素在制备抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物的应用
技术领域
本发明涉及青蒿素在制备抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物的应用，属于生物制药技术领域，该药物可抑制人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞增殖、调控人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞miRNA表达谱。
背景技术
肝癌细胞(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，占原发性肝癌的90％。尽管新型治疗法和诊断技术取得了巨大的成就，但早期发现HCC很困难，导致HCC患者5年生存率较低(0-14％)。因此，发现能够鉴定HCC的特异和敏感的生物标志至关重要。青蒿是一种重要的中草药植物。从青蒿草本植物中提取的青蒿素是抗疟疾药物的有效成分。近年来，已报道了青蒿素的其他功能，青蒿素可能成为抗乙型肝炎病毒的药物。最近青蒿素作为抗癌剂由其临床安全性和广泛的功效而受到广泛关注。
目前已发现超过2,500种人miRNA在各种生理和病理过程中发挥重要作用。例如胚胎发育、细胞增殖、分化、细胞周期进程、细胞凋亡、自噬、血管生成和代谢。最近，已经证明miRNA在人类癌症中表现出组织和疾病特异性模式，表明miRNA可能是用于HCC的早期诊断和预后预测的新型生物标志物。在肝细胞癌中，miRNA经常呈现异常的表达谱，这使得它们对于诊断或预后应用具有潜在的吸引力。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种青蒿素在制备抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物的应用。所述药物可抑制人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞增殖，影响人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞内miRNA表达谱的变化。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供青蒿素在制备抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物的应用，通过抑制人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞的增殖，和/或，调整人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞内的miRNA表达谱实现。
进一步地，所述青蒿素浓度≤100μM。
进一步地，所述抑制HepG2细胞增殖调控通过Rap1信号通路实现；所述抑制Huh7细胞增殖调控通过MAPK信号通路实现。
进一步地，所述调整HepG2细胞的miRNA包括上调基因：hsa-miR-199a-5p；hsa-miR-29b-3p；hsa-miR-30e-5p；hsa-miR-135b-5p；hsa-miR-32-5p；hsa-miR-378a-3p；hsa-miR-4426；hsa-miR-1307-3p；hsa-miR-30a-5p；hsa-miR-200a-3p；hsa-miR-181d-5p；hsa-miR-363-3p；hsa-miR-29a-3p；novel_1144；hsa-miR-455-5p；hsa-miR-663a；hsa-miR-345-5p；hsa-miR-1273g-3p；hsa-miR-20a-5p；hsa-miR-1248；novel_1213；hsa-miR-140-5p；hsa-miR-199a-3p；hsa-miR-126-3p；hsa-miR-7704；hsa-miR-7641；hsa-miR-194-5p；hsa-miR-622；hsa-miR-28-5p；hsa-miR-17-5p；novel_1005；novel_827；novel_1212hsa-miR-429；hsa-miR-3184-5p；hsa-miR-423-3p；hsa-miR-22-3p；hsa-miR-125b-5p；hsa-miR-301a-3p；hsa-miR-15a-5p；hsa-miR-3064-5p；hsa-miR-3143；hsa-miR-7161-3p。
下调基因：hsa-miR-1257；hsa-let-7e-5p；hsa-miR-28-3p；hsa-miR-192-5p；hsa-miR-3184-3p；hsa-miR-423-5p；hsa-miR-10b-5p；hsa-miR-30e-3p；hsa-let-7f-5p；hsa-miR-455-3p；hsa-miR-3529-3p；hsa-miR-101-3p；hsa-miR-7-5p；hsa-miR-335-3p；hsa-miR-199b-5p；hsa-miR-1-3p；hsa-miR-4521；hsa-miR-651-5p；hsa-miR-182-5p；hsa-miR-584-5p；hsa-miR-23b-3p；hsa-miR-532-5p；hsa-miR-140-3p；hsa-miR-361-3p；hsa-miR-23a-3p；hsa-miR-4664-5p；hsa-miR-664a-3p；hsa-miR-33a-3p；hsa-miR-195-3p；hsa-miR-1299；hsa-miR-500a-3p；hsa-miR-215-5p；hsa-miR-3679-5p；hsa-miR-624-5p；hsa-miR-4454；hsa-miR-574-5p；hsa-miR-122-5p；hsa-miR-1276；hsa-miR-148a-5p；hsa-miR-3591-3p；hsa-miR-99b-3p。
所述调整Huh7细胞的miRNA包括上调基因hsa-miR-32-5p；hsa-miR-185-5p；hsa-miR-22-3p；hsa-miR-328-3p；hsa-miR-451a；hsa-miR-3065-5p；hsa-miR-338-3p；hsa-miR-1307-3p；hsa-miR-33a-5p；hsa-miR-556-5p；hsa-miR-125a-5p；hsa-miR-182-3p；hsa-miR-30e-5p。
下调基因hsa-miR-30b-5p；hsa-miR-7641；hsa-miR-218-5p；hsa-miR-9-5p；hsa-miR-1247-3p；hsa-miR-10b-3p；hsa-miR-1269b；hsa-miR-4671-5p；hsa-miR-1246。
HepG2细胞系miRNA中，显著上调的基因有hsa-miR-199a-5p，novel_1144，novel_1213，hsa-miR-4426，hsa-miR-1273g-3p；显著下调的基因有hsa-miR-1257，hsa-let-7e-5p，hsa-miR-28-3p，hsa-miR-192-5p，hsa-miR-3184-3p。
Huh7细胞系miRNA中，显著上调的基因有hsa-miR-451a，hsa-miR-556-5p，hsa-miR-33a-5p，hsa-miR-182-3p，hsa-miR-328-3p；显著下调的基因有hsa-miR-10b-3p，hsa-miR-4671-5p，hsa-miR-1247-3p，hsa-miR-1269b，hsa-miR-1246。
所述HepG2细胞和Huh7细胞中共同上调的miRNA有has-miR-32-5p，has-miR-30e-5p，has-miR-22-3p和has-miR-1307-3p。
进一步地，所述药物的剂型为冲剂或胶囊。
本发明提供一种含青蒿素的抗人肝癌HepG2和Huh7细胞的药物冲剂，制备方法如下：
1)取5份青蒿素，加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量；
2)加乙醇使含醇量为60％，边加边搅拌，静置使沉淀，取上清液回收乙醇，80℃浓缩成清膏；
3)加入2份甘蔗粉与糊精的混合物(蔗糖：糊精＝3：1)及适量70％的乙醇，拌合成软才，挤压过筛制颗粒；
4)60℃干燥，整粒，按每袋相当于青蒿素10g分装于塑料袋中，密封，即得青蒿素冲剂。
进一步地，步骤1)中，所述加水煎煮两次，第一次2小时，第二次1小时；所述浓缩约至1g/mL。
进一步地，步骤2)中，所述清膏的相对密度为1.30-1.33；所述1份清膏含有4份药材的青蒿素含量。
进一步地，步骤3)中，所述过筛为12目-14目。
本发明提供一种含青蒿素的抗人肝癌HepG2和Huh7细胞的药物胶囊，制备方法如下：
1)取5份青蒿素粉碎成粗粉，用乙醇回流1小时，滤过；药渣再用乙醇回流1.5小时，滤过，合并滤液，回收乙醇；
2)药渣加水煎煮2小时，滤过，煎液与滤液合并，浓缩至糖浆状；
3)加入2份淀粉混匀，加入淀粉浆适量，拌和制成软才，压过筛制粒，于60-70℃干燥，整粒；
4)加入0.03份硬脂酸镁，混合均匀，装入胶囊，即得青蒿素胶囊。
进一步地，步骤1)中，第一次乙醇回流采用95％乙醇，第二次乙醇回流采用50％乙醇。
进一步地，步骤3)中，过筛为80-100目。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)发现青蒿素对人肝癌HepG2和Huh7细胞具有增殖抑制作用，并呈现良好的时间和浓度依赖性；
2)青蒿素可以调控人肝癌细胞HepG2和Huh7内miRNA表达谱的变化；
3)提供了含青蒿素药物冲剂及胶囊的制备方法。
本发明为研制新的抗肿瘤候选药物提供了科学依据，对开发中药新药具有重要意义。
附图说明
图1A、B为效果验证试验例2中细胞克隆形成实验检测青蒿素对人肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖抑制作用；
图2为效果验证试验例3中RNA-Seq数据分析青蒿素诱导人肝癌HepG2和Huh7细胞产生新miRNA预测；
图3A、B为效果验证试验例3中RNA-Seq数据分析青蒿素对HepG2和Huh7细胞内差异表达miRNA和靶基因的鉴定的火山图；
图4A、B、C、D为效果验证试验例3中RNA-Seq数据分析青蒿素对HepG2和Huh7细胞内差异表达miRNA和靶基因的鉴定；
图5为效果验证试验例3中RNA-Seq数据分析青蒿素对HepG2和Huh7细胞内差异表达miRNA和靶基因的鉴定；
图6A、B为效果验证试验例3中RNA-Seq数据分析青蒿素对HepG2和Huh7细胞质内差异miRNA靶基因富集分析。
具体实施方式
青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，分子式为C15H22O5，属倍半萜内酯，制备熔点为156-157℃，[a]D17＝+66.3°(C＝1.64氯仿)。
在本研究中我们通过RNA-Seq技术，分析在青蒿素药物作用下，肝癌细胞中miRNA表达谱变化，发现潜在调控肝癌的miRNA，为青蒿素在肝癌治疗策略发展中奠定基础。
本发明提供一种生物治疗肿瘤候选药物青蒿素在制备抗肿瘤药物中的应用。具体涉及一种青蒿素抑制肝癌细胞增殖，影响肝癌细胞内miRNA表达谱的变化；所述的体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(HepG2和Huh7)。
青蒿素的低宿主毒性，是开发青蒿素作为抗癌剂的主要动力。故本发明人发现青蒿素在人肝癌HepG2和Huh7细胞中具有抗肝癌作用，且能够调控肝癌细胞内miRNA表达谱的变化，故青蒿素具有作为抗肝癌候选药物开发的潜在价值。
本发明通过细胞活力测试、细胞克隆形成实验、肝癌细胞总RNA提取进行文库构建与测序等研究，证实了青蒿素能够抑制肝癌细胞HepG2和Huh7的增殖且能够对肝癌细胞内的miRNA表达谱具有调控作用。
以下实验所用的青蒿素是由传统中草药黄花蒿中提取有效成分制得，购买于美国sigma公司，产品型号为361593，青蒿素含量为98％。
体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(HepG2和Huh7)，来源于美国ATCC细胞库。
各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。下面结合具体实施列和图表详细说明本发明的技术方案，但本发明并不仅限于以下的实施例。
实施例1：
将青蒿素药物制成冲剂，其制备方法为：
1)取青蒿素50g，加水煎煮两次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量(约50mL)；
2)加乙醇使含醇量为60％，边加边搅，静置使沉淀，取上清液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.30-1.33(80℃)的清膏(约1：4，即1份清膏相当于4份药材)；
3)加入20g甘蔗粉与糊精的混合物(蔗糖：糊精＝3：1)及10ml 70％的乙醇，拌合成软才，挤压过筛(12目-14目)制颗粒；
4)60℃干燥，整粒，按每袋相当于青蒿素10g分装于塑料袋中，密封，即得青蒿素冲剂。
给药方法：成人常用量：口服给药，一次一袋，一日三袋。
注意事项：妊娠早期慎用。
实施例2：
将青蒿素药物制成胶囊，其制备方法为：
1)取青蒿素25g粉碎成粗粉，用95％乙醇回流1小时，滤过；药渣再用50％乙醇回流1.5小时，滤过，合并滤液，回收乙醇；
2)药渣加水煎煮2小时，滤过，煎液与滤液合并，浓缩至糖浆状；
3)加入淀粉10g混匀，加入淀粉浆适量，拌和制成软才，压过80-100目筛制粒，于60-70℃干燥，整粒；
4)加入硬脂酸镁0.15g，混合均匀，装入胶囊，即得青蒿素胶囊。
给药方法：口服，每日1至2次，每次1至2粒，适宜空腹食用。肠胃敏感者，请随餐食用。
注意事项：避免儿童接触，妊娠早期慎用。
效果验证试验例1青蒿素对人肝癌HepG2细胞、Huh7细胞的增殖抑制作用
1、Cell Viability Assay法测定细胞增殖
1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2和Huh7细胞，用DMEM(含有10％FBS和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到3*104个/ml，接种到96孔板，每孔100μL细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO2培养过夜。
2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、50μM、100μM、150μM、200μM，每种浓度设置6个重复。阴性对照组加等量的DMEM。放入培养箱分别培养24h、48h。
3)待药物作用到相应时间点后，从培养箱中取出96孔板，分别加入20μLLuminescent Cell Viability Assay，注意避光，放入培养箱孵育10分钟后，使用Bio-Rad细胞城乡检测仪测量Luminescent的吸光度。
4)细胞存活率(cell viability％)＝(加药组/阴性对照组)×100％。
实验重复三次，分别计算不同时间下青蒿素对人肝癌HepG2和Huh7细胞的抑制情况。
细胞活力结果显示：分别作用24h、48h后，青蒿素能剂量依赖和时间依赖性抑制HepG2和Huh7细胞的增殖。
由表1可见，在同一作用时间的药物浓度越高，与空白对照相比HepG2细胞增殖抑制率也随着增高；在同一药物浓度作用下，作用时间增长，与空白对照相比HepG2细胞增殖抑制率也随着增高。
表1青蒿素对人肝癌细胞HepG2增殖作用的抑制率
与空白对照组相比较：○P<0.05；与24h作用时间比较：▲P<0.05。
由表2可见，在同一作用时间的药物浓度越高，与空白对照相比Huh7细胞增殖抑制率也随着增高；在同一药物浓度作用下，作用时间增长，与空白对照相比Huh7细胞增殖抑制率也随着增高。
表2青蒿素对人肝癌细胞Huh7增殖作用的抑制率
与空白对照组相比较：○P<0.05；与24h作用时间比较：▲P<0.05。
效果验证试验例2细胞克隆形成实验
1)制备细胞悬液：弃旧培养基，PBS洗一遍后加1mL 0.25％的胰酶消化3min，显微镜下观察大部分细胞变圆时，弃胰酶，加2倍所加胰酶量的完全培养基终止消化，将瓶内细胞轻轻吹下，并转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min。
2)弃上清，加入新鲜培养基，1/3的细胞悬液留种，其余备用。
3)细胞计数和铺板：细胞悬液吹打混匀后，吸取10μL加入血球计数板在显微镜下计数。向12孔板的每孔加入2ml浓度调整过的细胞悬液，细胞数为2000个/孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，使其过夜贴壁。
4)加药：弃去旧培养基，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、100μM，每种浓度设置3个重复。
5)将平板在37℃，5％CO2下孵育7天以允许菌落生长。在长期孵育期间，每三天更换含有不同浓度的青蒿素(0μM、100μM)的新鲜完全培养基。用1X PBS洗涤细胞两次，0.01％结晶紫溶液染色。Gel Doc TM XR+Imager(Bio-Rad)捕获图像。为了量化集落形成的速率，将集落形式的染色细胞溶解在10％(v/v)乙酸中，在540nm处定量吸光度。
6)数据统计：细胞克隆形成率＝(加药组/阴性对照组)×100％。
细胞克隆形成实验结果显示：与空白对照组相比较，青蒿素对人肝癌HepG2和Huh7细胞增殖具有明显的抑制作用。如图1所示，青蒿素浓度为100μM时，肝癌细胞的集落形成抑制在50％以下。故后续实验我们选取青蒿素浓度为100μM。
效果验证试验例3青蒿素作用下，肝癌细胞HepG2和Huh7内miRNA表达谱的变化
3.1肝癌细胞总RNA提取、文库构建与测序
1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2和Huh7细胞，用DMEM(含有10％FBS和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5*106个/ml，接种到6孔板，每孔100μL细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO2培养过夜。
2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、100μM，每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的DMEM。放入培养箱培养24h。
3)将细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。
4)加入1mL的RNAiso Plus，室温静置5分钟，加入200μL氯仿并振荡混匀，室温静置5分钟，离心5分钟(12000g，4℃)。
5)将上清转移至新的离心管中且加入等体积的异丙醇，室温静置10分钟，离心10分钟(12000g，4℃)。
6)弃上清，加入1mL的75％乙醇清洗沉淀，离心5分钟(12000g，4℃)。
7)收集沉淀，并自然干燥，溶解于适量的DEPC处理水中。
8)用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，在得到的mRNA中合成cDNA，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq2500进行测序。
9)数据统计。
3.2青蒿素作用下，肝癌细胞内novel miRNA的预测
1)整合miREvo和mirdeep2这些miRNA预测软件来进行新miRNA的分析。
2)截取一定长度sRNA比对上的参考序列，通过探寻其二级结构及Dicer酶切位点信息、能量等特征进行分析。
3)预测样品中novel miRNA，并进行各样本中匹配上的sRNA的序列、长度、出现的次数等信息，以及不同长度miRNA的首位点碱基分布和所有miRNA的各位点碱基分布情况的统计。
3.3青蒿素作用下，肝癌细胞内差异表达miRNA和靶基因的鉴定
1)对各样本中已知和新miRNA进行表达量的统计，并用DEGseq软件进行差异表达分析。
2)获得差异表达的miRNA中挑选显著性高表达和地表达的miRNA，用miRanda、PITA和RNAhybrid三个软件的交集预测miRNA靶基因。
3)每个miRNA的鉴定到的靶基因较多，只挑选分值小于-1.2，且能量值小于7的。
4)用火山图可以推断差异miRNA的整体分布情况，从差异倍数(Fold change)和校正后的显著水平(padj/qvalue)两个水平进行评估，对差异miRNA进行筛选。
5)横坐标代表miRNA在不同实验组中/不同样品中表达倍数变化，纵坐标代表miRNA表达量变化的统计学显著程度，图中的散点代表各个miRNA，蓝色圆点表示无显著性差异的miRNA，红色圆点表示显著上调的差异miRNA，绿色圆点表示显著下调的差异miRNA。
3.4青蒿素作用下，肝癌细胞内差异miRNA靶基因富集分析
1)得到各组比较间的差异表达miRNA后，根据miRNA与其靶基因间的对应关系，对每组差异表达miRNA的靶基因的集合KEGG富集分析。
2)KEGG富集程度通过Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因个数来衡量。
3)Rich factor指差异表达的基因中位于该pathway条目的基因数目与所有有注释基因中位于该pathway条目的基因总数的比值。Rich factor越大，表示富集的程度越大。
4)Qvalue是做过多重假设检验校正之后的Pvalue，Qvalue的取值范围为(0,1)，越接近于零，表示富集越显著。
结果显示：
测序结果显示，与空白对照相比较，加入青蒿素后HepG2和Huh7细胞内，分析得到十种新的miRNA。在二级结构示意中，整个序列是miRNA前体，黑色突出部分为novel miRNA的成熟体序列。(图2)
与对照组相比较：
HepG2细胞系中，筛选出上调miRNA基因43条：hsa-miR-199a-5p；hsa-miR-29b-3p；hsa-miR-30e-5p；hsa-miR-135b-5p；hsa-miR-32-5p；hsa-miR-378a-3p；hsa-miR-4426；hsa-miR-1307-3p；hsa-miR-30a-5p；hsa-miR-200a-3p；hsa-miR-181d-5p；hsa-miR-363-3p；hsa-miR-29a-3p；novel_1144；hsa-miR-455-5p；hsa-miR-663a；hsa-miR-345-5p；hsa-miR-1273g-3p；hsa-miR-20a-5p；hsa-miR-1248；novel_1213；hsa-miR-140-5p；hsa-miR-199a-3p；hsa-miR-126-3p；hsa-miR-7704；hsa-miR-7641；hsa-miR-194-5p；hsa-miR-622；hsa-miR-28-5p；hsa-miR-17-5p；novel_1005；novel_827；novel_1212hsa-miR-429；hsa-miR-3184-5p；hsa-miR-423-3p；hsa-miR-22-3p；hsa-miR-125b-5p；hsa-miR-301a-3p；hsa-miR-15a-5p；hsa-miR-3064-5p；hsa-miR-3143；hsa-miR-7161-3p。下调基因41条：hsa-miR-1257；hsa-let-7e-5p；hsa-miR-28-3p；hsa-miR-192-5p；hsa-miR-3184-3p；hsa-miR-423-5p；hsa-miR-10b-5p；hsa-miR-30e-3p；hsa-let-7f-5p；hsa-miR-455-3p；hsa-miR-3529-3p；hsa-miR-101-3p；hsa-miR-7-5p；hsa-miR-335-3p；hsa-miR-199b-5p；hsa-miR-1-3p；hsa-miR-4521；hsa-miR-651-5p；hsa-miR-182-5p；hsa-miR-584-5p；hsa-miR-23b-3p；hsa-miR-532-5p；hsa-miR-140-3p；hsa-miR-361-3p；hsa-miR-23a-3p；hsa-miR-4664-5p；hsa-miR-664a-3p；hsa-miR-33a-3p；hsa-miR-195-3p；hsa-miR-1299；hsa-miR-500a-3p；hsa-miR-215-5p；hsa-miR-3679-5p；hsa-miR-624-5p；hsa-miR-4454；hsa-miR-574-5p。
Huh7细胞系中，筛选出上调miRNA基因13条：hsa-miR-32-5p；hsa-miR-185-5p；hsa-miR-22-3p；hsa-miR-328-3p；hsa-miR-451a；hsa-miR-3065-5p；hsa-miR-338-3p；hsa-miR-1307-3p；hsa-miR-33a-5p；hsa-miR-556-5p；hsa-miR-125a-5p；hsa-miR-182-3p；hsa-miR-30e-5p。下调基因9条：hsa-miR-30b-5p；hsa-miR-7641；hsa-miR-218-5p；hsa-miR-9-5p；hsa-miR-1247-3p；hsa-miR-10b-3p；hsa-miR-1269b；hsa-miR-4671-5p；hsa-miR-1246。
差异表达基因分析火山图见图3。
在上调和下调的miRNA中，我们筛选出显著上调和显著下调的miRNA，差异有统计学意义(P<0.05)。图4A、B为显著下调基因：HepG2细胞系中hsa-miR-1257，hsa-let-7e-5p，hsa-miR-28-3p，hsa-miR-192-5p，hsa-miR-3184-3p；Huh7细胞系中hsa-miR-10b-3p，hsa-miR-4671-5p，hsa-miR-1247-3p，hsa-miR-1269b，hsa-miR-1246。图4C、D为显著上调基因：HepG2细胞系中hsa-miR-199a-5p，novel_1144，novel_1213，hsa-miR-4426，hsa-miR-1273g-3p；Huh7细胞系中hsa-miR-451a，hsa-miR-556-5p，hsa-miR-33a-5p，hsa-miR-182-3p，hsa-miR-328-3p。
两种细胞系中，共同上调的miRNA有四个，分别是has-miR-32-5p，has-miR-30e-5p，has-miR-22-3p和has-miR-1307-3p(图5)。
在HepG2和Huh7细胞系中，我们挑选了富集前20位的pathway条目(图6A-HepG2和图6B-Huh7)。根据信号通路中包含的靶基因数量及可能的生物学意义，在这些通路中，Rap1信号通路与青蒿素抑制HepG2增殖调控有关，MAPK信号通路与青蒿素抑制Huh7增殖调控有关。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

Claims (10)

1.青蒿素在制备抗人肝癌HepG2和Huh7细胞药物的应用，其特征在于：通过抑制人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞的增殖，和/或，调整人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞内的miRNA表达谱实现；所述青蒿素浓度≤100μM。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制HepG2细胞增殖调控通过Rap1信号通路实现；所述抑制Huh7细胞增殖调控通过MAPK信号通路实现。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述调整HepG2细胞的miRNA包括上调基因：hsa-miR-199a-5p；hsa-miR-29b-3p；hsa-miR-30e-5p；hsa-miR-135b-5p；hsa-miR-32-5p；hsa-miR-378a-3p；hsa-miR-4426；hsa-miR-1307-3p；hsa-miR-30a-5p；hsa-miR-200a-3p；hsa-miR-181d-5p；hsa-miR-363-3p；hsa-miR-29a-3p；novel_1144；hsa-miR-455-5p；hsa-miR-663a；hsa-miR-345-5p；hsa-miR-1273g-3p；hsa-miR-20a-5p；hsa-miR-1248；novel_1213；hsa-miR-140-5p；hsa-miR-199a-3p；hsa-miR-126-3p；hsa-miR-7704；hsa-miR-7641；hsa-miR-194-5p；hsa-miR-622；hsa-miR-28-5p；hsa-miR-17-5p；novel_1005；novel_827；novel_1212hsa-miR-429；hsa-miR-3184-5p；hsa-miR-423-3p；hsa-miR-22-3p；hsa-miR-125b-5p；hsa-miR-301a-3p；hsa-miR-15a-5p；hsa-miR-3064-5p；hsa-miR-3143；hsa-miR-7161-3p；
下调基因：hsa-miR-1257；hsa-let-7e-5p；hsa-miR-28-3p；hsa-miR-192-5p；hsa-miR-3184-3p；hsa-miR-423-5p；hsa-miR-10b-5p；hsa-miR-30e-3p；hsa-let-7f-5p；hsa-miR-455-3p；hsa-miR-3529-3p；hsa-miR-101-3p；hsa-miR-7-5p；hsa-miR-335-3p；hsa-miR-199b-5p；hsa-miR-1-3p；hsa-miR-4521；hsa-miR-651-5p；hsa-miR-182-5p；hsa-miR-584-5p；hsa-miR-23b-3p；hsa-miR-532-5p；hsa-miR-140-3p；hsa-miR-361-3p；hsa-miR-23a-3p；hsa-miR-4664-5p；hsa-miR-664a-3p；hsa-miR-33a-3p；hsa-miR-195-3p；hsa-miR-1299；hsa-miR-500a-3p；hsa-miR-215-5p；hsa-miR-3679-5p；hsa-miR-624-5p；hsa-miR-4454；hsa-miR-574-5p；hsa-miR-122-5p；hsa-miR-1276；hsa-miR-148a-5p；hsa-miR-3591-3p；hsa-miR-99b-3p。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述调整Huh7细胞的miRNA包括上调基因：hsa-miR-32-5p；hsa-miR-185-5p；hsa-miR-22-3p；hsa-miR-328-3p；hsa-miR-451a；hsa-miR-3065-5p；hsa-miR-338-3p；hsa-miR-1307-3p；hsa-miR-33a-5p；hsa-miR-556-5p；hsa-miR-125a-5p；hsa-miR-182-3p；hsa-miR-30e-5p；
下调基因：hsa-miR-30b-5p；hsa-miR-7641；hsa-miR-218-5p；hsa-miR-9-5p；hsa-miR-1247-3p；hsa-miR-10b-3p；hsa-miR-1269b；hsa-miR-4671-5p；hsa-miR-1246。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述调整人肝癌HepG2细胞和Huh7细胞内的miRNA表达谱实现，在HepG2细胞系的miRNA中，显著上调的基因有hsa-miR-199a-5p，novel_1144，novel_1213，hsa-miR-4426，hsa-miR-1273g-3p；显著下调的基因有hsa-miR-1257，hsa-let-7e-5p，hsa-miR-28-3p，hsa-miR-192-5p，hsa-miR-3184-3p；
在Huh7细胞系的miRNA中，显著上调的基因有hsa-miR-451a，hsa-miR-556-5p，hsa-miR-33a-5p，hsa-miR-182-3p，hsa-miR-328-3p；显著下调的基因有hsa-miR-10b-3p，hsa-miR-4671-5p，hsa-miR-1247-3p，hsa-miR-1269b，hsa-miR-1246。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为冲剂或胶囊。
7.一种含青蒿素的抗人肝癌HepG2和Huh7细胞的药物冲剂，其特征在于，制备方法如下：
1)取5份青蒿素，加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量；
2)加乙醇使含醇量为60％，边加边搅拌，静置使沉淀，取上清液回收乙醇，80℃浓缩成清膏；
3)加入2份甘蔗粉与糊精的混合物(蔗糖：糊精＝3：1)及适量70％的乙醇，拌合成软才，挤压过筛制颗粒；
4)60℃干燥，整粒，按每袋相当于青蒿素10g分装于塑料袋中，密封，即得青蒿素冲剂。
8.根据权利要求7所述的一种含青蒿素的抗人肝癌HepG2和Huh7细胞的药物冲剂，其特征在于：步骤2)中，所述清膏的相对密度为1.30-1.33；所述1份清膏含有4份药材的青蒿素含量。
9.一种含青蒿素的抗人肝癌HepG2和Huh7细胞的药物胶囊，其特征在于，制备方法如下：
1)取5份青蒿素粉碎成粗粉，用乙醇回流1小时，滤过；药渣再用乙醇回流1.5小时，滤过，合并滤液，回收乙醇；
2)药渣加水煎煮2小时，滤过，煎液与滤液合并，浓缩至糖浆状；
3)加入2份淀粉混匀，加入淀粉浆适量，拌和制成软才，压过筛制粒，于60-70℃干燥，整粒；
4)加入0.03份硬脂酸镁，混合均匀，装入胶囊，即得青蒿素胶囊。
10.根据权利要求9所述的含青蒿素的抗人肝癌HepG2和Huh7细胞的药物胶囊，其特征在于：步骤1)中，第一次乙醇回流采用95％乙醇，第二次乙醇回流采用50％乙醇。
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