CN113876763B - 高车前素在制备抗胆管癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种天然化合物高车前素(Hispidulin)在制备抗胆管癌药物中的应用。所述胆管癌包括肝内胆管癌和肝外胆管癌。本发明的优点在于:本发明通过肝胆管癌细胞RBE和胆管癌细胞TFK1体外实验发现,高车前素对RBE和TFK1细胞具有明显的抑制作用,能够阻断细胞周期,抑制细胞增殖,且呈剂量依赖性。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取物技术领域,具体地说,涉及高车前素在制备抗胆管 癌药物中的应用。
背景技术
胆管癌是胆管上皮细胞衍生的恶性肿瘤,近年来发病率在世界范围内呈上 升趋势,发病率在亚洲人群中为2.8‰-3.3‰,在东亚人群中更为普遍,在我国 的发病率为7.8‰。因其发病隐匿,早期临床症状不典型,病人就诊时多属进 展期或晚期,预后极差,根治性手术切除是目前可能治愈胆管癌的唯一方式, 仅约20%的患者有手术机会,术后5年生存率仅约30%,术后复发率高达 60%-70%。临床治疗方法有限,临床缺少有效的治疗方案,因此中医药治疗胆 管癌备受关注,寻求新的治疗靶点,改善胆管癌患者术后生活质量及降低复发 率具有重要意义。
高车前素(Hispidulin,HPDL)也称粗毛豚草素,是一种黄酮类化合物, 具有良好的药理学活性,且无细胞毒性。高车前素不仅有神经保护作用,还对 胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌等肿瘤细胞有抑制作用,同时在心血管系统与 治疗糖尿病并发症等方面有良好的表现。但是关于高车前素在抑制肝内胆管癌 细胞增殖方面的应用,目前还未见报道。
中国专利文献CN112156091A公开了高车前素在制备治疗和/或预防心血 管疾病的药物中的应用。文献(刘凯莉.高车前素通过JAK2/STAT3信号通路下 调PIM1靶点抑制结肠癌细胞的生长和转移[D].青岛大学,2019.)公开了高车前 素在结肠癌(CRC)中的抗癌作用及作用机理。但是关于本发明高车前素在制 备抗胆管癌药物中的应用目前还未见报道。高车前素的结构式如下:
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供高车前素在制备抗胆管癌药 物中的应用。
第一方面,提供高车前素在制备抗胆管癌药物中的应用。
优选地,所述的胆管癌为肝内胆管癌或肝外胆管癌。
在本发明的另一方面,提供高车前素在制备抑制胆管癌细胞药物中的应 用。
优选地,所述胆管癌细胞为TFK1或RBE。
在本发明的另一方面,提供一种治疗胆管癌的药物组合物,所述的药物组 合物以高车前素为活性成分,并进一步包含药学上可接受的载体。
优选地,所述药物组合物剂型为外用剂型或内用剂型。
更优选地,所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜 剂、巴布剂、片剂、口服液、注射剂、胶囊剂或颗粒剂。
在本发明的另一方面,提供高车前素作为靶点在筛选制备抗胆管癌药物中 的应用。
本发明优点在于:
1、本发明通过肝胆管癌细胞RBE和胆管癌细胞TFK1体外实验发现,高 车前素对RBE和TFK1细胞具有明显的抑制作用,能够阻断细胞周期,抑制 细胞增殖,且呈剂量依赖性。
2、本发明使用中药提取物治疗癌症,不仅原料丰富易得,价格便宜,易 于制备,并且与化疗相比,副作用较小,患者接受度高,适合临床推广使用。
附图说明
图1.CCK8实验发现高车前素(Hispidulin)对TFK1和RBE人胆管癌细 胞活性具有明显的抑制作用,且这种抑制作用呈浓度梯度依赖性。
图2.细胞存活能力检测(集落形成实验)发现高车前素对TFK1和RBE 人胆管癌细胞具有抑制细胞增殖的作用,且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。
图3.细胞增殖检测发现高车前素对TFK1和RBE人胆管癌细胞具有抑制 细胞增殖的作用,且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。
图4-10.高车前素对TFK1和RBE人胆管癌细胞具有阻滞细胞周期的作 用。
具体实施方式
实施例1高车前素对植瘤裸鼠的治疗效果评价
1实验材料
1.1药物和细胞株
高车前素(纯度99.33%,购自MCE公司,HY-N1950),以100mmol的初 始浓度溶于二甲基亚砜中,贮存在-20℃冰箱;胆管癌细胞系TFK1和RBE是 从中国科学院(中国,上海)的细胞库购买的。
1.2主要试剂和材料
胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS),RPMI-1640培养基(Roswell ParkMemorial Institute-1640)(Gibco,C11875500CP),DMEM培养基,离心管, 96孔板,6孔板,10cm培养皿;
Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo,CK04),BeyoClickTM EdU-488细 胞增殖检测试剂盒(BeyoClickTM EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 488) (碧云天,C0071S),二甲基亚砜(DMSO)(sigma)。
1.3主要仪器及设备
超净工作台(江苏安泰空气技术有限公司,型号SW-CJ-2FD);二氧化碳 培养箱(美国Thermo Sci,型号371);Eppendorf 5424R离心机;SpectraMax iD5- 多功能酶标仪;BDFACSCanto TM II流式细胞仪;荧光倒置显微镜(日本尼 康,型号:TS100-F)。
2实验方法
2.1TFK1和RBE两种人胆管癌细胞的培养
胆管癌细胞TFK1和RBE在含有10%胎牛血清,1%青霉素和链霉素的 RPMI-1640培养基和DMEM培养基中培养,并置于37℃,5%CO2的培养箱中, 细胞融合度达到90%以上时进行传代,从10cm皿中吸出旧的培养基并丢弃, 向10cm皿中加入1ml预热的含0.25%EDTA的胰酶后,将培养瓶放入培养箱 消化1-3min可使细胞解离程度达90%以上,往皿中加入3ml新鲜培养基终止 消化,轻柔吹打细胞层表面数次后将细胞转移到15ml离心管,离心机中 1000rpm离心5min后,用1ml完全培养基重悬细胞,并等分到装有4ml完全 培养基的新的10cm皿中,在该比例下细胞平均每隔2d传代。
2.2采用CCK8法检测肿瘤细胞活性抑制作用
收集对数生长期细胞,调整细胞悬液浓度为5×103个/ml种入96孔板,每 孔加入100μl培养基。培养24h使细胞贴壁。更换培养液后浓度梯度组分别加 入0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM浓度的高车前素分别处理细胞12h、 24h、48h,同时设立对照组,每组设置6个复孔。处理结束后,取出96孔板, 每孔加入10μlCCK-8试剂,继续培养2h。取出后用酶标仪在450nm处测量各 孔的吸光度值(OD值)。以0h的OD值为1,分别计算其余时间节点的相对 活力,根据细胞相对活力评价细胞增殖能力。
细胞活力计算公式:细胞活力改变倍数=第n天OD值/第0天OD值。该 实验重复三次。
2.3集落形成实验检测肿瘤增殖情况
经过消化和计数,1000个TFK1和RBE细胞分别种在含有2mL完全培养 基的6孔板中,细胞贴壁后吸取旧的培养基,换成含有25μM、50μM浓度的 高车前素,同时设立对照组,每个浓度设置3个副孔。培养14d后形成细胞集 落,丢弃旧培养基,用PBS洗3遍后,用4%多聚甲醛固定30min,然后用0.5% 结晶紫染色15min。用PBS洗去结晶紫试剂后晾干。显微镜下计数大于50个 细胞集落的个数。
细胞存活率计算公式:细胞存活率(%)=(实验组集落数/对照组集落数) ×100%。
2.4细胞增殖实验(EdU实验)检测肿瘤增殖情况
EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到 新合成的DNA中,因此新合成的DNA可在荧光显微镜下发出荧光,代表细 胞增殖水平。分别将TFK1和RBE细胞以1×105的密度接种于6孔板中,放置 培养性使其贴壁过夜,次日观察板内细胞密度达到60-70%时弃旧培养基,用 25μM、50μM浓度的高车前素干预24h和48h,同时设立对照组,每个浓度设 置3个副孔。将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM),等体积加入6孔板中,使6孔板中的EdU终浓度变为1X。继续孵育细胞2h。EdU标记细胞完成 后,去除培养液,并加入1ml固定液,室温固定15min。去除固定液,每孔用 1ml洗涤液洗涤细胞3次,每次3-5min。去除洗涤液,每孔用1ml通透液,室 温孵育10-15min。去除通透液,每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次,每次3-5min。 去除洗涤液,每孔加入0.5ml Click反应液,室温避光孵育30min。吸除Click 反应液,用洗涤液洗涤3次,每次3-5min。吸除洗涤液后,每孔加1XHoechst 33342溶液1ml,室温避光孵育10min。随后进行荧光检测。
2.5流式细胞术检测肿瘤细胞周期情况
使用胰酶-EDTA将TFK1和RBE消化成单细胞,将细胞6×104/mL加入 到6孔板中,每孔2mL。待细胞贴壁后,实验组分别加入不同浓度的高车前素 (25μM、50μM),对照组添加DMSO。继续培养24h后,消化收集细胞,用 无PBS洗涤2次,振荡,使细胞分散。使用4℃预冷的75%的乙醇固定24h。 流式上机检测细胞周期前,离心,1000rpm,5min,去乙醇,用PBS冲洗1次, 加入10μg/mL RNase 37℃作用20min,加入PI 50μg/mL室温避光染色10min 以上,用流式细胞仪(BD,USA)测定,应用软件分析细胞周期的分布。
3实验结果
3.1高车前素对胆管癌细胞活力的影响
结果如图1所示,高车前素对TFK1和RBE人胆管癌细胞活性具有明显 的抑制作用,且这种抑制作用呈浓度梯度依赖性。
3.2高车前素对胆管癌细胞集落形成的影响
结果如图2所示,高车前素可以抑制TFK1和RBE胆管癌细胞的增殖, 且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。
3.3高车前素对胆管癌细胞增殖的影响
结果如图3所示,高车前素对TFK1和RBE人胆管癌细胞具有抑制细胞 增殖的作用,且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。
3.4高车前素对胆管癌细胞周期的影响
结果如图4-10所示,高车前素可以诱导TFK1和RBE胆管癌细胞的G0/G1 细胞周期阻滞。
综上所述,高车前素能够在体外抑制胆管癌细胞生长,可用于制备治疗胆 管癌的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通 技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.高车前素在制备抗胆管癌药物中的应用。
2.高车前素在制备抑制胆管癌细胞药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的胆管癌细胞为TFK1或RBE。
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