CN113876763B - 高车前素在制备抗胆管癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种天然化合物高车前素(Hispidulin)在制备抗胆管癌药物中的应用。所述胆管癌包括肝内胆管癌和肝外胆管癌。本发明的优点在于：本发明通过肝胆管癌细胞RBE和胆管癌细胞TFK1体外实验发现，高车前素对RBE和TFK1细胞具有明显的抑制作用，能够阻断细胞周期，抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性。

Description

高车前素在制备抗胆管癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及中药提取物技术领域，具体地说，涉及高车前素在制备抗胆管 癌药物中的应用。
背景技术
胆管癌是胆管上皮细胞衍生的恶性肿瘤，近年来发病率在世界范围内呈上 升趋势，发病率在亚洲人群中为2.8‰-3.3‰，在东亚人群中更为普遍，在我国 的发病率为7.8‰。因其发病隐匿，早期临床症状不典型，病人就诊时多属进 展期或晚期，预后极差，根治性手术切除是目前可能治愈胆管癌的唯一方式， 仅约20％的患者有手术机会，术后5年生存率仅约30％，术后复发率高达 60％-70％。临床治疗方法有限，临床缺少有效的治疗方案，因此中医药治疗胆 管癌备受关注，寻求新的治疗靶点，改善胆管癌患者术后生活质量及降低复发 率具有重要意义。
高车前素(Hispidulin，HPDL)也称粗毛豚草素，是一种黄酮类化合物， 具有良好的药理学活性，且无细胞毒性。高车前素不仅有神经保护作用，还对 胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌等肿瘤细胞有抑制作用，同时在心血管系统与 治疗糖尿病并发症等方面有良好的表现。但是关于高车前素在抑制肝内胆管癌 细胞增殖方面的应用，目前还未见报道。
中国专利文献CN112156091A公开了高车前素在制备治疗和/或预防心血 管疾病的药物中的应用。文献(刘凯莉.高车前素通过JAK2/STAT3信号通路下 调PIM1靶点抑制结肠癌细胞的生长和转移[D].青岛大学,2019.)公开了高车前 素在结肠癌(CRC)中的抗癌作用及作用机理。但是关于本发明高车前素在制 备抗胆管癌药物中的应用目前还未见报道。高车前素的结构式如下：
Figure BDA0003216350190000011
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供高车前素在制备抗胆管癌药 物中的应用。
第一方面，提供高车前素在制备抗胆管癌药物中的应用。
优选地，所述的胆管癌为肝内胆管癌或肝外胆管癌。
在本发明的另一方面，提供高车前素在制备抑制胆管癌细胞药物中的应 用。
优选地，所述胆管癌细胞为TFK1或RBE。
在本发明的另一方面，提供一种治疗胆管癌的药物组合物，所述的药物组 合物以高车前素为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。
优选地，所述药物组合物剂型为外用剂型或内用剂型。
更优选地，所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜 剂、巴布剂、片剂、口服液、注射剂、胶囊剂或颗粒剂。
在本发明的另一方面，提供高车前素作为靶点在筛选制备抗胆管癌药物中 的应用。
本发明优点在于：
1、本发明通过肝胆管癌细胞RBE和胆管癌细胞TFK1体外实验发现，高 车前素对RBE和TFK1细胞具有明显的抑制作用，能够阻断细胞周期，抑制 细胞增殖，且呈剂量依赖性。
2、本发明使用中药提取物治疗癌症，不仅原料丰富易得，价格便宜，易 于制备，并且与化疗相比，副作用较小，患者接受度高，适合临床推广使用。
附图说明
图1.CCK8实验发现高车前素(Hispidulin)对TFK1和RBE人胆管癌细 胞活性具有明显的抑制作用，且这种抑制作用呈浓度梯度依赖性。
图2.细胞存活能力检测(集落形成实验)发现高车前素对TFK1和RBE 人胆管癌细胞具有抑制细胞增殖的作用，且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。
图3.细胞增殖检测发现高车前素对TFK1和RBE人胆管癌细胞具有抑制 细胞增殖的作用，且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。
图4-10.高车前素对TFK1和RBE人胆管癌细胞具有阻滞细胞周期的作 用。
具体实施方式
实施例1高车前素对植瘤裸鼠的治疗效果评价
1实验材料
1.1药物和细胞株
高车前素(纯度99.33％，购自MCE公司，HY-N1950)，以100mmol的初 始浓度溶于二甲基亚砜中，贮存在-20℃冰箱；胆管癌细胞系TFK1和RBE是 从中国科学院(中国，上海)的细胞库购买的。
1.2主要试剂和材料
胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，RPMI-1640培养基(Roswell ParkMemorial Institute-1640)(Gibco，C11875500CP)，DMEM培养基，离心管， 96孔板，6孔板，10cm培养皿；
Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo，CK04)，BeyoClickTM EdU-488细 胞增殖检测试剂盒(BeyoClickTM EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 488) (碧云天，C0071S)，二甲基亚砜(DMSO)(sigma)。
1.3主要仪器及设备
超净工作台(江苏安泰空气技术有限公司，型号SW-CJ-2FD)；二氧化碳 培养箱(美国Thermo Sci，型号371)；Eppendorf 5424R离心机；SpectraMax iD5- 多功能酶标仪；BDFACSCanto TM II流式细胞仪；荧光倒置显微镜(日本尼 康，型号：TS100-F)。
2实验方法
2.1TFK1和RBE两种人胆管癌细胞的培养
胆管癌细胞TFK1和RBE在含有10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素的 RPMI-1640培养基和DMEM培养基中培养，并置于37℃，5％CO2的培养箱中， 细胞融合度达到90％以上时进行传代，从10cm皿中吸出旧的培养基并丢弃， 向10cm皿中加入1ml预热的含0.25％EDTA的胰酶后，将培养瓶放入培养箱 消化1-3min可使细胞解离程度达90％以上，往皿中加入3ml新鲜培养基终止 消化，轻柔吹打细胞层表面数次后将细胞转移到15ml离心管，离心机中 1000rpm离心5min后，用1ml完全培养基重悬细胞，并等分到装有4ml完全 培养基的新的10cm皿中，在该比例下细胞平均每隔2d传代。
2.2采用CCK8法检测肿瘤细胞活性抑制作用
收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为5×103个/ml种入96孔板，每 孔加入100μl培养基。培养24h使细胞贴壁。更换培养液后浓度梯度组分别加 入0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM浓度的高车前素分别处理细胞12h、 24h、48h，同时设立对照组，每组设置6个复孔。处理结束后，取出96孔板， 每孔加入10μlCCK-8试剂，继续培养2h。取出后用酶标仪在450nm处测量各 孔的吸光度值(OD值)。以0h的OD值为1，分别计算其余时间节点的相对 活力，根据细胞相对活力评价细胞增殖能力。
细胞活力计算公式：细胞活力改变倍数＝第n天OD值/第0天OD值。该 实验重复三次。
2.3集落形成实验检测肿瘤增殖情况
经过消化和计数，1000个TFK1和RBE细胞分别种在含有2mL完全培养 基的6孔板中，细胞贴壁后吸取旧的培养基，换成含有25μM、50μM浓度的 高车前素，同时设立对照组，每个浓度设置3个副孔。培养14d后形成细胞集 落，丢弃旧培养基，用PBS洗3遍后，用4％多聚甲醛固定30min，然后用0.5％ 结晶紫染色15min。用PBS洗去结晶紫试剂后晾干。显微镜下计数大于50个 细胞集落的个数。
细胞存活率计算公式：细胞存活率(％)＝(实验组集落数/对照组集落数) ×100％。
2.4细胞增殖实验(EdU实验)检测肿瘤增殖情况
EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到 新合成的DNA中，因此新合成的DNA可在荧光显微镜下发出荧光，代表细 胞增殖水平。分别将TFK1和RBE细胞以1×105的密度接种于6孔板中，放置 培养性使其贴壁过夜，次日观察板内细胞密度达到60-70％时弃旧培养基，用 25μM、50μM浓度的高车前素干预24h和48h，同时设立对照组，每个浓度设 置3个副孔。将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。继续孵育细胞2h。EdU标记细胞完成 后，去除培养液，并加入1ml固定液，室温固定15min。去除固定液，每孔用 1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5min。去除洗涤液，每孔用1ml通透液，室 温孵育10-15min。去除通透液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5min。 去除洗涤液，每孔加入0.5ml Click反应液，室温避光孵育30min。吸除Click 反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min。吸除洗涤液后，每孔加1XHoechst 33342溶液1ml，室温避光孵育10min。随后进行荧光检测。
2.5流式细胞术检测肿瘤细胞周期情况
使用胰酶-EDTA将TFK1和RBE消化成单细胞，将细胞6×104/mL加入 到6孔板中，每孔2mL。待细胞贴壁后，实验组分别加入不同浓度的高车前素 (25μM、50μM)，对照组添加DMSO。继续培养24h后，消化收集细胞，用 无PBS洗涤2次，振荡，使细胞分散。使用4℃预冷的75％的乙醇固定24h。 流式上机检测细胞周期前，离心，1000rpm，5min，去乙醇，用PBS冲洗1次， 加入10μg/mL RNase 37℃作用20min，加入PI 50μg/mL室温避光染色10min 以上，用流式细胞仪(BD，USA)测定，应用软件分析细胞周期的分布。
3实验结果
3.1高车前素对胆管癌细胞活力的影响
结果如图1所示，高车前素对TFK1和RBE人胆管癌细胞活性具有明显 的抑制作用，且这种抑制作用呈浓度梯度依赖性。
3.2高车前素对胆管癌细胞集落形成的影响
结果如图2所示，高车前素可以抑制TFK1和RBE胆管癌细胞的增殖， 且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。
3.3高车前素对胆管癌细胞增殖的影响
结果如图3所示，高车前素对TFK1和RBE人胆管癌细胞具有抑制细胞 增殖的作用，且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。
3.4高车前素对胆管癌细胞周期的影响
结果如图4-10所示，高车前素可以诱导TFK1和RBE胆管癌细胞的G0/G1 细胞周期阻滞。
综上所述，高车前素能够在体外抑制胆管癌细胞生长，可用于制备治疗胆 管癌的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.高车前素在制备抗胆管癌药物中的应用。
2.高车前素在制备抑制胆管癌细胞药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的胆管癌细胞为TFK1或RBE。
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