CN113908148B

CN113908148B - 川陈皮素在制备抗胆管癌药物中的应用

Info

Publication number: CN113908148B
Application number: CN202110926607.2A
Authority: CN
Inventors: 孙学华; 孔晓妮; 高月求; 林佳成; 游丽萍
Original assignee: Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Current assignee: Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2041-08-12
Also published as: CN113908148A

Abstract

本发明涉及川陈皮素在制备抗胆管癌药物中的应用。所述胆管癌包括肝内胆管癌和肝外胆管癌。本发明的优点在于：本发明通过肝胆管癌细胞RBE和胆管癌细胞TFK1体外实验发现，川陈皮素对RBE和TFK1细胞具有明显的抑制作用，阻断细胞周期，抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性；本发明通过裸鼠皮下接种胆管癌细胞TFK1发现，川陈皮素可显著抑制肿瘤生长。本发明使用天然化合物治疗癌症，不仅原料丰富易得，价格便宜，易于制备，并且与化疗相比，副作用较小，患者接受度高，适合临床推广使用。

Description

川陈皮素在制备抗胆管癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药提取物技术领域，具体地说，涉及川陈皮素在制备抗胆管癌药物中的应用。

背景技术

癌症是对人类生命健康危害最大的疾病之一，胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，近年来，其发病率在全球范围内呈上升趋势。目前胆管癌的主要治疗手段是早期发现，进行手术切除。然而由于其恶性程度高，发病隐匿，大多数患者在确诊时已处于晚期，不适合手术切除。同时该胆管癌对目前现有的放、化疗方法均不敏感，且预后极差，未手术患者的中位生存期不到1年。因此，迫切需要找到对胆管癌更为有效的药物。

川陈皮素(Nobiletin)是从芸香科柑桔属橘子Citrus reticulaia Blanco果皮中提取的一种黄酮类天然化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等作用。黄酮化合物具有抗氧化、消除自由基的能力。柑桔属药材中含有丰富的黄酮物质，具有多种生物活性，特别是抗氧化活性。近年来研究发现，桔皮中所特有的多甲氧基类黄酮成分还有明显的抑制肿瘤的作用。

中国专利文献CN113018292A公开了川陈皮素作为BH3拟似药对小细胞肺癌的抑制作用及与组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同作用。中国专利文献 CN110327465A公开了一种复方抗前列腺癌药物。所述的药物由多甲氧基黄酮类药物川陈皮素和雄激素受体抑制剂药物比卡鲁胺组成，质量比为1：1。但是关于本发明使用川陈皮素制备抗胆管癌药物的应用目前还未见报道。川陈皮素的结构式如下：

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供川陈皮素在制备抗胆管癌药物中的应用。

第一方面，提供川陈皮素在制备抗胆管癌药物中的应用。

优选地，所述的胆管癌为肝内胆管癌或肝外胆管癌。

在本发明的另一方面，提供川陈皮素在制备抑制胆管癌细胞药物中的应用。

优选地，所述胆管癌细胞为TFK1或RBE。

在本发明的另一方面，提供一种治疗胆管癌的药物组合物，所述的药物组合物以川陈皮素为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

优选地，所述药物组合物剂型为外用剂型或内用剂型。

更优选地，所述药物组合物的剂型为贴剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、涂膜剂、巴布剂、片剂、口服液、注射剂、胶囊剂或颗粒剂。

在本发明的另一方面，提供川陈皮素作为靶点在筛选制备抗胆管癌药物中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明通过肝胆管癌细胞RBE和胆管癌细胞TFK1体外实验发现，川陈皮素对RBE和TFK1细胞具有明显的抑制作用，阻断细胞周期，抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性；本发明通过裸鼠皮下接种胆管癌细胞TFK1发现，川陈皮素可显著抑制肿瘤生长。

2、本发明使用天然化合物治疗癌症，不仅原料丰富易得，价格便宜，易于制备，并且与化疗相比，副作用较小，患者接受度高，适合临床推广使用。

附图说明

图1.CCK8实验发现川陈皮素(Nob)对TFK1和RBE人胆管癌细胞活性具有明显的抑制作用，且这种抑制作用呈浓度梯度依赖性。

图2.细胞存活能力检测(集落形成实验)发现川陈皮素对TFK1和RBE 人胆管癌细胞具有抑制细胞增殖的作用，且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。

图3.细胞增殖检测发现川陈皮素对TFK1和RBE人胆管癌细胞具有抑制细胞增殖的作用，且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。

图4.川陈皮素对TFK1和RBE人胆管癌细胞具有阻滞细胞周期的作用。

图5.川陈皮素对胆管癌移植瘤具有明显的生长抑制作用。

具体实施方式

实施例1川陈皮素对植瘤裸鼠的治疗效果评价

1实验材料

1.1药物和细胞株

川陈皮素(纯度≥98％，从MCE公司采购，HY-N0155)，以100mmol的初始浓度溶于二甲基亚砜中，贮存在-80℃。胆管癌细胞系TFK1和RBE从中国科学院(中国，上海)的细胞库购入。

1.2主要试剂和材料

胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS，Gibco)，RPMI-1640培养基(Gibco)， DMEM培养基(Gibco)；

Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Dojindo，CK04)，BeyoClick^TM EdU-488细胞增殖检测试剂盒(碧云天，C0071S)，二甲基亚砜(DMSO，sigma)。

1.3主要仪器及设备

超净工作台(江苏安泰空气技术有限公司，型号SW-CJ-2FD)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Sci，型号371)；Eppendorf 5424R离心机；SpectraMax iD5- 多功能酶标仪；BDFACSCanto TM II流式细胞仪；荧光倒置显微镜(日本尼康，型号：TS100-F)。

2实验方法

2.1TFK1和RBE两种人胆管癌细胞的培养

胆管癌细胞TFK1和RBE在含有10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素的 RPMI-1640培养基和DMEM培养基中培养，并置于37℃，5％CO₂的培养箱中，细胞融合度达到90％以上时进行传代，从10cm皿中吸出旧的培养基并丢弃，向10cm皿中加入1mL预热的含0.25％EDTA的胰酶后，将培养瓶放入培养箱消化1-3min可使细胞解离程度达90％以上，往皿中加入3mL新鲜培养基终止消化，轻柔吹打细胞层表面数次后将细胞转移到15mL离心管，离心机中 1000rpm离心5min后，用1mL完全培养基重悬细胞，并等分到装有4mL完全培养基的新的10cm皿中，在该比例下细胞平均每隔2d传代。

2.2采用CCK8法检测肿瘤细胞活性抑制作用

收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为5×10³个/mL种入96孔板，每孔加入100μL培养基。培养24h使细胞贴壁。更换培养液后浓度梯度组分别加入1μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM浓度的川陈皮素分别处理细胞12h、24h、48h，同时设立对照组，每组设置6个复孔。处理结束后，取出96孔板，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续培养2h。取出后用酶标仪在450nm 处测量各孔的吸光度值(OD值)。以0h的OD值为1，分别计算其余时间节点的相对活力，根据细胞相对活力评价细胞增殖能力。

细胞活力计算公式：细胞活力改变倍数＝第n天OD值/第0天OD值。

细胞存活率(100％)＝(给药组OD值-完全空白对照组OD值)/(对照组OD值-完全空白孔OD值)×100％。

该实验重复三次。

2.3集落形成实验检测肿瘤增殖情况

经过消化和计数，1000个TFK1和RBE细胞分别种在含有2mL完全培养基的6孔板中，细胞贴壁后吸取旧的培养基，换成含有12.5μM、25μM、50μM、 100μM浓度的川陈皮素，同时设立对照组，每个浓度设置3个副孔。培养14d 后形成细胞集落，丢弃旧培养基，用PBS洗3遍后，用4％多聚甲醛固定30min，然后用0.5％结晶紫染色15min。用PBS洗去结晶紫试剂后晾干。显微镜下计数大于50个细胞集落的个数。

细胞存活率计算公式：细胞存活率(％)＝(实验组集落数/对照组集落数) ×100％。

2.4细胞增殖实验(EdU实验)检测肿瘤增殖情况

EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中，因此新合成的DNA可在荧光显微镜下发出荧光，代表细胞增殖水平。分别将TFK1和RBE细胞以1×10⁵的密度接种于6孔板中，放置培养箱使其贴壁过夜，次日观察板内细胞密度达到60-70％时弃旧培养基，用 50μM、100μM浓度的川陈皮素干预24h和48h，同时设立对照组，每个浓度设置3个副孔。将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。继续孵育细胞2h。EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1mL固定液，室温固定15min。去除固定液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5min。去除洗涤液，每孔用1mL通透液，室温孵育10-15min。去除通透液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞1-2次，每次 3-5min。去除洗涤液，每孔加入0.5mLClick反应液，室温避光孵育30min。吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min。吸除洗涤液后，每孔加1XHoechst 33342溶液1mL，室温避光孵育10min。随后进行荧光检测。

2.5流式细胞术检测肿瘤细胞周期情况

使用胰酶-EDTA将TFK1和RBE消化成单细胞，将细胞6×10⁴/mL加入到6孔板中，每孔2mL。待细胞贴壁后，实验组分别加入不同浓度的川陈皮素 (50μM、100μM)，对照组添加DMSO。继续培养24h后，消化收集细胞，用无PBS洗涤2次，振荡，使细胞分散。使用4℃预冷的75％的乙醇固定24h。流式上机检测细胞周期前，离心，1000rpm，5min，去乙醇，用PBS冲洗1次，加入10μg/mL RNase 37℃作用20min，加入PI 50μg/mL室温避光染色10min 以上，用流式细胞仪(BD，USA)测定，应用软件分析细胞周期的分布。

2.6裸鼠肿瘤移植实验

4-5周雄性裸鼠采购自上海杰思杰实验动物有限公司，将3×10⁶个对数生长期的TFK1细胞置于50μL磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中，与50μL基质凝胶(BD，biosciences，MA，USA)混合，皮下注射于裸鼠右腋下。4d后开始腹腔注射川陈皮素(50mg/kg/d，溶于10％DMSO，40％PEG300，5％Tween-80， 45％生理盐水)，对照组给与等量溶剂。每3d测量一次肿瘤体积，体积＝0.5× 长×宽²。治疗3周后，小鼠因颈椎脱位而死亡。体外观察肿瘤体积大小。

3实验结果

3.1川陈皮素对胆管癌细胞活力的影响

结果如图1所示，川陈皮素对TFK1和RBE人胆管癌细胞活性具有明显的抑制作用，且这种抑制作用呈浓度梯度依赖性。

3.2川陈皮素对胆管癌细胞集落形成的影响

结果如图2所示，川陈皮素可以抑制TFK1和RBE胆管癌细胞的增殖，且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。

3.3川陈皮素对胆管癌细胞增殖的影响

结果如图3所示，川陈皮素对TFK1和RBE人胆管癌细胞具有抑制细胞增殖的作用，且这种抑制作用成浓度梯度依赖性。

3.4川陈皮素对胆管癌细胞周期的影响

结果如图4所示，川陈皮素可以诱导TFK1和RBE胆管癌细胞的G0/G1 细胞周期阻滞。

3.5川陈皮素对胆管癌裸鼠移植瘤的影响

结果如图5所示，川陈皮素处理组肿瘤体积明显小于对照组(*p＜0.05)。再将对照组和RAE处理组肿瘤分别进行称重，取质量平均值，结果显示处理组肿瘤质量显著低于对照组(*p＜0.05)。

综上所述，川陈皮素能够在体内和体外抑制胆管癌细胞生长，并且治疗效果随浓度的增加而提升，证明川陈皮素可用于制备治疗胆管癌的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.川陈皮素作为唯一活性成分在制备抗胆管癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的胆管癌为肝内胆管癌或肝外胆管癌。

3.川陈皮素作为唯一活性成分在制备抑制胆管癌细胞药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的胆管癌细胞为TFK1或RBE。