CN114432310B - 异莲心碱在制备治疗白血病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了异莲心碱在制备治疗白血病药物中的应用，异莲心碱的结构如式(1)所示，所述白血病包括急性髓系白血病、慢性粒细胞白血病、T细胞恶性肿瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤。

Description

异莲心碱在制备治疗白血病药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种化合物的应用，公开了异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗白血病药物中的应用。
背景技术
莲子心为睡莲科植物莲(Nelumbo nuciferia Gaertn)的成熟种子中间的绿色胚芽，是临床习用中药，也是重要药食两用作物品种之一，功能清热解毒，用于热病。异莲心碱(英文名：isoliensinine；缩写：IsoL)是莲生物总碱的主要组成之一，目前已被证明具有降压、抗心律失常等多种功效，刘志沛在《异莲心碱和人参皂苷Rb1的抗心率失常机制》中研究发现异莲心碱通过抑制锋钠电流、L型钙电和晚钠电流，消除早期后除极和晚期后除极的发生来发挥抗心律失常的作用。刘贝贝等在《异莲心碱对小鼠离体气管平滑肌的舒张作用》发现异莲心碱可阻断小鼠离体气管平滑肌细胞LVDCC电流，LVDCC介导的Ca2+内流停止，[Ca2+]i降低，导致ASM舒张，提示异莲心碱可能是潜在的气管舒张剂。异莲心碱对宫颈癌细胞的增殖及迁移能力的抑制作用[高利臣.异莲心碱在制备靶向抑制AKT激活的药物中的应用：CN201910321884.3]。但尚无研究表明异莲心碱是否对血液恶性肿瘤具有抗肿瘤效应。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供异莲心碱及其类似物或药物学上可接受的盐在制备治疗白血病药物中的用途。
技术方案：本发明所述的如式(1)所示的异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗白血病药物中的应用。
Figure BDA0003482233730000011
所述的应用，所述白血病包括急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)、T细胞恶性肿瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)。
所述的应用，所述药物是由异莲心碱及其药学上可接受的盐添加药学上可接受的辅料所制成的药物。
所述的应用，所述异莲心碱来源于从莲子心或其他植物中提取或者化学合成。
异莲心碱对人AML细胞、人CML细胞、人T细胞恶性肿瘤细胞和人DLBCL细胞具有活力抑制和凋亡诱导作用。
异莲心碱对人AML细胞、人CML细胞、人T细胞恶性肿瘤细胞和人DLBCL细胞活力抑制作用表现在异莲心碱降低了上述细胞与MTT反应生成的甲臜总量。
异莲心碱对人T细胞恶性肿瘤细胞凋亡诱导作用表现在异莲心碱促进了AnnexinV-FITC阳性标记细胞数量。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：本研究通过MTT细胞活力检测实验和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测实验，发现异莲心碱具有抑制人AML细胞、人CML细胞、人T细胞恶性肿瘤细胞和人DLBCL细胞的细胞活力及诱导其凋亡的能力，验证了异莲心碱具有抗人白血病的作用，表明了异莲心碱在制备治疗白血病的药物中的应用前景。
附图说明
图1是0～64μM异莲心碱在24h和72h下对AML细胞系MV411细胞的活力水平影响；
图2是0～64μM异莲心碱在72h下对AML细胞系ME1细胞的活力水平影响；
图3是0～64μM异莲心碱在24h和72h下对AML细胞系THP1细胞的活力水平影响；
图4是0～64μM异莲心碱在24h下对CML细胞系K562细胞的活力水平影响；
图5是0～64μM异莲心碱在24h和72h下对T细胞恶性肿瘤细胞系Jurkat细胞的活力水平影响；
图6是0～64μM异莲心碱在24h和72h下对T细胞恶性肿瘤细胞系Molt4细胞的活力水平影响；
图7是0～64μM异莲心碱在24h和72h下对T细胞恶性肿瘤细胞系Hut102细胞的活力水平影响；
图8是0～64μM异莲心碱在24h和72h下对DLBCL细胞系Sudhl4细胞的活力水平影响；
图9是0～64μM异莲心碱在24h和72h下对DLBCL细胞系Sudhl8细胞的活力水平影响；
图10是0～16μM异莲心碱在12h下对T细胞恶性肿瘤细胞系Jurkat细胞的凋亡诱导能力的检测。
具体实施方式
实施例1
异莲心碱对白血病细胞系细胞活力的影响
1.1、实验材料
1.1.1试剂与材料
①化合物
异莲心碱(C37H42N2O6，分子量：610.74)由南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所提供，淡黄色粉末，纯度＞95％。使用前用二甲基亚砜将化合物粉末配置成浓度为0.05M储备液，置于-80℃保存。使用时采用细胞培养相应培养基稀释到所需浓度。
②细胞系
人AML细胞系包括THP1、ME1和MV411细胞，人CML细胞系包括K562细胞，人T细胞恶性肿瘤细胞包括Jurkat、Hut102和Molt4细胞，人DLBCL细胞包括Sudhl4和Sudhl8细胞，均购自上海中国科学院细胞所。
③细胞培养试剂
RPMI-1640培养基(GIBCO，Carlsbad，CA，USA)：取5.2g RPMI-1640粉末和1.0gNaHCO3共同溶于0.5L ddH2O中。用无菌圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃保存。使用前加入100U/mL青霉素(辰欣药业股份有限公司，济宁，中国)和100mg/L链霉素(辰欣药业股份有限公司)。
胎牛血清(GIBCO)保存于-20℃，使用前于56℃水浴灭活35min后分装保存于4℃，一周内使用。使用时将胎牛血清与培养基按1∶10混合。
④相关指标检测试剂盒
MTT溶液：避光操作，0.05g MTT(翌圣生物科技，上海，中国)粉末溶于10mL PBS缓冲液中，超声20min，配制成浓度为5mg/mL溶液。采用0.22μm无菌滤头过滤，分装，置于-80℃保存。使用时提前于室温溶解。
1.1.2实验仪器
YJ-875型医用净化工作台(净化设备厂，苏州，中国)；3111型水套式CO2培养箱(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)；702型超低温冰箱(ThermoFisherScientific)；电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司，北京，中国)；QIUJING血细胞计数板(求精生化试剂仪器有限公司，上海，中国)；LD4-2普通离心机(医用离心机厂，上海，中国)；5417R型台式冷冻高速离心机(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)；Research型单道可调移液器(Eppendorf AG)；THZ-312型台式恒温振荡器(精宏试验设备有限公司，上海，中国)；Varioskan全波长酶标仪(ThermoFisher Scientific)。
1.2、实验方法
①细胞活力检测
原理：MTT可以被细胞内线粒体脱氢酶还原生成蓝紫色结晶甲臜(Formazan)，在570nm波长处检测光密度(optical density，OD)值并比较，可以反映细胞活力相对水平。操作流程：100μL细胞(5000个/孔)均匀培养在96孔板内，加入100μL一定浓度的异莲心碱，细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养；药物作用结束后，每孔加入15μL MTT溶液。培养箱中孵育3h后，使用酶标仪测定570nM下OD值。抑制率％＝(1-给药组细胞平均吸光值/对照组细胞平均吸光值)×100％；Graphpad Prism 8.0软件计算半数抑制浓度(50％inhibitingconcentration，IC50)。
1.3、实验结果
通过MTT法检测从中药莲子心中提取出的天然化合物异莲心碱在不同浓度下对不同血液恶性肿瘤细胞的活力抑制作用。结果显示，0～64μM异莲心碱作用血液恶性肿瘤细胞24h或72h后，对细胞均有显著的活力抑制作用，呈时间和浓度依赖性。异莲心碱在24h和72h对MV411的IC50分别为12.66μM和2.23μM(图1)；异莲心碱在72h对ME1的IC50为2.76μM(图2)；异莲心碱在24h和72h对THP1的IC50分别为14.33μM和9.66μM(图3)；异莲心碱在24h对K562的IC50为18.23μM(图4)；异莲心碱在24h和72h对Jurkat的IC50分别为17.23μM和6.85μM(图5)；异莲心碱在24h和72h对Molt4的IC50分别为25.23μM和4.22μM(图6)；异莲心碱在24h和72h对Hut102的IC50分别为27.47μM和6.80μM(图7)；异莲心碱在24h和72h对Sudhl4的IC50分别为12.42μM和5.55μM(图8)；异莲心碱在24h和72h对Sudhl8的IC50分别为19.94μM和5.09μM(图9)。该结果表明异莲心碱对人AML细胞、人CML细胞、人T细胞恶性肿瘤细胞和人DLBCL细胞具有显著的活力抑制作用。
实施例2
异莲心碱对白血病细胞系凋亡诱导的作用
2.1、实验材料
2.1.1试剂与材料
①化合物
同1.1.1。
②细胞系
人T细胞恶性肿瘤细胞Jurkat购自上海中国科学院细胞所。
③细胞培养试剂
同1.1.1。
④相关指标检测试剂盒
Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(诺唯赞生物科技，南京，中国)用于检测细胞凋亡。
2.1.2实验仪器
YJ-875型医用净化工作台(净化设备厂，苏州，中国)；3111型水套式CO2培养箱(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)；702型超低温冰箱(ThermoFisherScientific)；电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司，北京，中国)；QIUJING血细胞计数板(求精生化试剂仪器有限公司，上海，中国)；LD4-2普通离心机(医用离心机厂，上海，中国)；5417R型台式冷冻高速离心机(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)；Research型单道可调移液器(Eppendorf AG)；流式细胞仪(Becton-Dickinson and Company，NJ，USA)。
2.2、实验方法
①细胞凋亡检测
原理：依据Annexin V与细胞磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)的结合作为凋亡考查标准。细胞凋亡通常伴随着细胞膜的破坏。早期凋亡(early apoptois)发生时，PS由细胞膜脂质双分子层内侧外翻，从而结合Annexin V-FITC染料，通过流式细胞仪可检测到FL-1增强信号；进入细胞晚期凋亡(late apoptosis)后，由于细胞膜通透性增强，碘化丙啶(propidium Iodide，PI)-PerCP染料与细胞核酸结合，从而可检测FL-3增强信号。因此，利用Annexin V/PI双染实验，统计凋亡细胞占比，能区分早凋/晚凋细胞。操作流程：将异莲心碱处理后的细胞收集并离心，磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)洗涤2次后，用40μL binding Buffer重悬细胞；加入1.7μL Annexin V和1.7μL PI染料室温避光下孵育10分钟(minutes，min)，补加250μL binding Buffer重悬，即可用流式细胞仪进行检测。凋亡细胞为Annexin V-FITC阳性细胞。
2.3、实验结果
通过Annexin V/PI细胞凋亡检测法检测异莲心碱对人白血病细胞的凋亡诱导作用。结果显示，人T细胞恶性肿瘤细胞系Jurkat在0～16μM异莲心碱作用12h后，16μM下能显著诱导Jurkat细胞凋亡，凋亡率53.8％(图10)。该结果说明异莲心碱具有对人T细胞恶性肿瘤细胞的凋亡诱导作用，初步验证了异莲心碱抗血液恶性肿瘤的作用。

Claims (4)

1.如式(1)所示的异莲心碱及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗急性髓系白血病、T细胞恶性肿瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤药物中的应用：
Figure FDA0004223571180000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是由异莲心碱及其药学上可接受的盐添加药学上可接受的辅料所制成的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述异莲心碱来源于从莲子心或其他植物中提取或者化学合成。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
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