CN102218047B - 治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

一种治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药中的应用，含有治疗有效量的如下结构式(I)的巴西苏木素或包含巴西苏木素结构的植物提取物和药学上可接受的载体；其在制备抗耐药菌(含非耐药菌)药物中的应用，以及作为抗生素中增敏活性成分和抗生素的增敏剂中的应用，所述的巴西苏木素经药理试验，结果证实除了对临床上常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有显著的直接抑制作用外，还能增强现有抗生素的抗耐药菌作用。

Description

治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体地，涉及治疗耐药菌感染的药物及其在活性成分在制药中的应用。

背景技术

随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌对常用抗生素产生耐药性，且耐药程度日益加重。自从1961年英国首先报道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcusaureus)以来，至今世界各地相继发现，且MRSA感染呈上升趋势，甚至引起医院内爆发流行。目前MRSA与爱滋病、肝炎、癌症并列为当今世界上的四大顽症。MRSA对多种抗生素耐药，致病力强且治疗效果差，为引起医院感染的主要病原菌之一。由于其多重耐药性，即除了对万古霉素等少数几种抗生素有效外，几乎对现有各类抗生素如β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类等抗生素都耐药，而且感染多发生于免疫缺陷者、老弱患者及烧伤、手术患者，故治疗难度大、病死率高，引起医务工作者的高度重视。建国以来，我国虽然对中草药抗金葡菌等感染的作用进行过筛选研究，但这些研究多限于药材提取物，对耐药菌的作用也只是在近年来才得到关注，国内迄今罕见针对MRSA感染的单体化合物的研究报道。

迄今，现有技术中未见巴西苏木素在治疗耐药菌MRSA感染的作用时，具有对氨基糖苷类抗生素的增敏作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供治疗耐药菌感染的药物，其中含有治疗有效量的巴西苏木素(Brazilin)或包含巴西苏木素结构的植物提取物和药学上可接受的载体；本发明的另一方面目的是提供巴西苏木素(Brazilin)或包含巴西苏木素结构的植物提取物在制备抗耐药菌(含非耐药菌)药物中的应用时，作为抗生素中增敏活性成分和抗生素的增敏剂中的应用。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种治疗耐药菌感染的药物，其中含有治疗有效量的如下结构式(I)所示的巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物和药学上可接受的载体，

结构式(I)所示的巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物在制备抗耐药菌药物增敏剂中的应用，

结构式(I)所示的巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物在制备抗非耐药菌药物增敏剂中的应用。

所说耐药菌是指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

所说非耐药菌是指金黄色葡萄球菌。

本发明还提供了结构式(I)的巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物作为抗生素中增敏活性成分的应用。

以及，结构式(I)的巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物用于制备抗生素的增敏剂。

上面提到的抗生素为氨基糖苷类抗生素，具体为庆大霉素或链霉素或阿米卡星或依替米星。

本发明上述技术方案的提出是基于当前临床耐药菌感染的实际，结合植物药抗菌药敏筛选和有效成分分离纯化方法，从豆科云实属植物如苏木(Caesalpinia sappan L.)中提取分离巴西苏木素(Brazilin)并证实其抗耐药菌活性。本发明对传统中药苏木进行提取分离纯化得到巴西苏木素，并首次发现其与氨基糖苷类抗生素联合作用时，对抗生素具有增敏作用，能够增强甚至逆转氨基糖苷类抗生素的抗MRSA作用。所述的巴西苏木素经药理试验，结果证实除了对临床上常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有显著的直接抑制作用外，还能增强现有抗生素的抗耐药菌作用。

本发明的化合物巴西苏木素及包含巴西苏木素结构的植物提取物可经口或不经过口给药，给药量因药物不同而各有不同，对成人来说，每天1-1000mg比较合适。

经口服给药时，首先使化合物或提取物与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式给药；非经口给药时可以注射液、输液剂或栓剂等外用形式给药。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术。

附图说明

图1为巴西苏木素与庆大霉素联合抗MRSA144#时间-杀菌曲线。

图2为巴西苏木素与阿米卡星联合抗MRSA144#时间-杀菌曲线。

图3为巴西苏木素与链霉素联合抗MRSA144#时间-杀菌曲线。

图4为巴西苏木素与依替米星联合抗MRSA144#时间-杀菌曲线。

具体实施方式

下面结合附图，通过本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

从苏木干燥心材中提取分离单体巴西苏木素(Brazilin)：

取苏木心材5kg，干燥、粉碎，得粗粉，用80％乙醇冷浸提取得浸膏685g，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯部位经200-300目硅胶柱色谱，石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱(1.5∶1～1∶1.5)，以TLC检测合并，再经过反复硅胶、Sephadex LH-20柱色谱分离得到单体巴西苏木素858mg。

巴西苏木素(Brazilin)的波谱数据：

浅黄色针晶(MeOH)，ESI-MS m/z：287[M+1]⁺。¹H-NMR(CH₃OH，400MHz)δ：7.18(1H，d，J＝6.7Hz，H-1)，6.46(1H，dd，J＝4.7，2.0Hz，H-2)，6.28(1H，d，J＝1.9，H-4)，3.92(1H，d，J＝8.3Hz，H-6)，3.68(1H，d，J＝8.3Hz，H-6′)，2.76(1H，d，J＝12.5Hz，H-7)，3.0(1H，d，J＝12.5Hz，H-7′)，6.69(1H，s，H-8)，6.58(1H，s，H-11)，3.95(1H，s，H-12)；¹³C-NMR(CH₃OH，100MHz)δ：132.2(C-1)，115.5(C-1a)，109.9(C-2)，155.7(C-3)，104.2(C-4)，157.9(C-4a)，70.8(C-6)，78.1(C-6a)，42.8(C-7)，131.3(C-7a)，112.8(C-8)，145.6(C-9)，145.3(C-10)，112.8(C-11)，137.4(C-11a)，51.0(C-12)。

实施例2：

按照实施例1的操作步骤，得到含巴西苏木素的浸膏685g。将浸膏用蒸馏水制成悬浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分配萃取。得到乙酸乙酯部分为富含巴西苏木素的植物提取物400g。

实施例3：

用作药敏试验的临床耐药菌株MRSA即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)的筛选：

1.试验材料

抗菌素药敏纸片(中国药品生物制品检定所)，MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)。

2.标本来源

从本申请人临床标本中分离筛选细菌MRSA菌株，编号为MRSA8^#、82^#、92^#、98^#、111^#、135^#、144^#、189^#、321^#、328^#，冰箱-20℃下保存备用。

3.细菌鉴别

依据《全国临床检验操作规程》及本领域技术人员公知的细菌鉴别方法对上述标本细菌进行分离、培养，经鉴定为金黄色葡萄球菌(SA)，并按公知的抗菌素药敏常规测试方法(K-B纸片法)，参照美国临床试验室标准委员会(NCCLS)2004年标准进行耐药菌鉴定，头孢西丁对所有菌株的抑菌圈均≤19mm，故视为耐药SA菌株(MRSA)。质控菌株为标准SA，即ATCC25923。

4.药敏试验

进一步用K-B纸片法，按照我国卫生部于2000年5月1日颁布实施的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》(SAST)常规操作，用MH琼脂培养基于35℃培养24小时，测定10株MRSA对常用抗菌素的敏感性，结果见表1。

表1 MRSA菌株对抗生素的药敏试验结果

实施例4：

巴西苏木素对耐药菌株MRSA的抗生素增敏作用测定：

1.试验材料

培养基：MH肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)；受试药：巴西苏木素(由苏木心材中提取分离得到)，硫酸庆大霉素注射液(2mL：8万单位，广州白云山天心制药股份有限公司，批号100305)；注射用硫酸阿米卡星(20万单位，江苏吴中医药集团有限公司苏州第六制药厂，批号400509)，溶剂：DMSO(分析纯)，蒸馏水；MRSA8^#、82^#、92^#、98^#、111^#、135^#、144^#、189^#、321^#、328^#。

2.药液制备

无菌DMSO将巴西苏木素、庆大霉素及阿米卡星配成配成4096μg/mL溶液作为原药溶液。

3.菌液的制备

用接种环把菌株接种在MH琼脂平板上，置于35℃恒温箱中培养24h，再用接种环把菌株转移至试管中，用无菌生理盐水配成浓度为1.0×10⁶CFU/mL控制菌悬液。

4.测定药物抑制MRSA的最小抑菌浓度(MIC)

采用公知的二倍稀释法，取无菌96孔板，于每横排1号孔加200μL MH肉汤培养基作空白对照，12号孔加MH肉汤培养基和菌液各100μL作阳性对照。每横排2-11号孔先各加入50μL MH肉汤培养基，取原药液50μL与2号孔混匀，继而吸取50μL加入3号孔中，依次类推稀释至第11号孔，弃去50μL，2-11号孔各都加100μL稀释为1.0×10⁶CFU/mL菌液摇匀，置培养箱中于35℃培养24小时，按本领域技术人员公知方法进行受试药物活性评价。

5.巴西苏木素(Brazilin)与抗生素联合抑菌实验：

5.1棋盘式微量稀释法(checkerboard microdilution assay)

棋盘法能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。合用的两种药物于96孔板上以二维棋盘的纵(A至H)横(2-11)两方向分别进行二倍的倍比稀释，测定联合用药的MIC。FICI是评价药物体外联合用药的两药相互作用方式的主要参数。部分抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration，FIC)为每一种药物联合抑菌时所需最低抑菌浓度(MIC_c)与单独时MIC_a的比值，而FICI则等于两种药物FIC之和。计算的公式为：FICI＝FIC₁+FIC₂＝MIC_1a/MIC_1c+MIC_2a/MIC_2c。当FICI≤0.5时，为协同作用；当1≥FICI＞0.5时，为相加作用；当2≥FICI＞1时，药物体外的相互作用方式为无关；当FIC指数＞2时，为拮抗作用。结果见表2～3。

表2 Brazilin与注射用硫酸庆大霉素棋盘法联合抗MRSA的抑菌效果

表3 Brazilin与注射用硫酸阿米卡星棋盘法联合抗MRSA的抑菌效果

表4 Brazilin与注射用硫酸链霉素棋盘法联合抗MRSA的抑菌效果

表5 Brazilin与硫酸依替米星注射用棋盘法联合抗MRSA的抑菌效果

5.2时间杀菌曲线测定(Time-kill curve)：

在含有定量抗菌药物的试管和无药试管内接种同种定量菌悬液，放入35℃恒温箱中培养，分别于0、4.、8、12、24h进行菌落计数，以菌落对数值log10CFU/mL对时间作曲线。各管药液终浓度分别为1/4MIC、1/2MIC和MIC。时间杀菌曲线结果判定：联合用药组菌落计数较最有效的单药组减少≥2log10cfu/ml时为协同，2log10cfu/ml＞减少＞1log10cfu/ml时为相加作用，减少或增加＝1log10cfu/ml时为无关作用，联合后增加＞1log10cfu/ml时定义为拮抗作用(Chin，J.N.et al.J.Antimicrob.Chemoth.2008，61，365-370)。巴西苏木素与硫酸庆大霉素联合选用MRSA8^#菌株，与硫酸阿米卡星联合选用MRSA144^#菌株。结果见图1、图2，在MIC浓度24h联用时，巴西苏木素与庆大霉素联合活菌菌落计数下降最大为2.15log10CFU/mL，巴西苏木素与阿米卡星联合活菌菌落计数下降最大为2.62log10CFU/mL，均表现出较好协同作用。

实施例5：

按实施例1和2的方法先制得巴西苏木素(Brazilin)，以及包含巴西苏木素结构的植物提取物，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例6：

按实施例1和2的方法先制得巴西苏木素(Brazilin)，以及包含巴西苏木素结构的植物提取物，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例7：

按实施例1和2的方法先制得巴西苏木素(Brazilin)，以及包含巴西苏木素结构的植物提取物，与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例8：

按实施例1和2的方法先制得巴西苏木素(Brazilin)，以及包含巴西苏木素结构的植物提取物，按其与赋形剂重量比为1∶5-1∶10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例9：

按实施例1和2的方法先制得巴西苏木素(Brazilin)，以及包含巴西苏木素结构的植物提取物，按常规口服液制法制成口服液。

实施例10：

按实施例1和2的方法先制得巴西苏木素(Brazilin)，以及包含巴西苏木素结构的植物提取物，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例11：

按实施例1和2的方法先制得巴西苏木素(Brazilin)，以及包含巴西苏木素结构的植物提取物，按其与赋形剂重量比为3∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

Claims (2)

1.巴西苏木素作为活性成分或包含巴西苏木素结构的植物提取物在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用，其中含有治疗有效量的如下结构式（I）化合物所示的巴西苏木素和药学上可接受的载体，

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物为单独的药物，或为与庆大霉素或链霉素或依替米星抗生素联合使用的药物，或为与庆大霉素或链霉素或依替米星抗生素抗生素混合制备而成的药物。

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