CN112516176B - 一种杨树型蜂胶乙醇提取物在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杨树型蜂胶乙醇提取物在制备抗菌药物中的应用，所述杨树型蜂胶乙醇提取物的制备方法包括如下步骤：粉碎后的杨树型蜂胶用乙醇浸泡，超声处理后过滤，滤渣多次用新鲜的乙醇提取，收集合并提取液；将提取液低温处理以析出蜂蜡，过滤除去蜂蜡后，滤液浓缩并干燥得到杨树型蜂胶乙醇提取物。本发明所述的杨树型蜂胶乙醇提取物在体内外对淋球菌均具有极强的杀菌活性，表明本发明所述杨树型蜂胶乙醇提取物在制备治疗淋球菌引起的感染性疾病药物中具有广阔的应用前景。

Description

一种杨树型蜂胶乙醇提取物在制备抗菌药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗菌药物领域，具体涉及一种杨树型蜂胶乙醇提取物在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

人类是奈瑟氏淋球菌(淋球菌)的唯一宿主，淋球菌通常感染人的尿道、咽喉、直肠以及眼部，引起性传播疾病。

目前，淋球菌已经对市面上大多经验使用的抗生素如盘尼西林、四环素、磺胺类药、甲氧苄氨嘧啶、(氟代)喹诺酮类和大环内酯类等产生了耐药性。基于此，我国现行的淋病治疗指南推荐头孢曲松钠作为首选的治疗药物，然而根据我国7个淋球菌耐药监测点于2013至2015年的监测数据可知头孢曲松低敏率已经高达10.8％，加之对头孢曲松具有高水平耐药力的两种克隆(ST7363和ST1901)在全球范围内的传播，淋球菌突破现行一线药物头孢曲松的壁垒只是时间的问题。

由于淋球菌多重耐药菌株的频出导致淋球菌感染的经验治疗方式不断被舍弃，加之全球淋病病例居高不下，据统计每年新增约1.06亿例，世界卫生组织(WHO)将其列为优先解决事项，迫切需要新的抗菌药物、新的治疗手段、以及有效的疫苗来改变未来无药可医的局面。

淋球菌由于其高频的突变性极易对各类抗生素形成耐药性，加之用药不规范、抗生素滥用等问题，使得淋球菌加速步入超级细菌的行列，因此研发新的可用于治疗淋病的替代抗菌药物是非常必要的。

中药材提取物是一个发掘新型抗菌药物的重要宝库，由于中药的特殊性和其成分的复杂性，细菌较少会对中药产生耐药。

已有研究表明部分中药材提取物对淋球菌具有抗菌抑菌作用，其中传统方法制备得到的中药材提取物黄连的MIC值为6mg/mL，大黄为20mg/mL(6种抗菌中药对淋球菌的抑菌作用研究[J].陕西中医,2011,32(010):1424-1425)，由此可见中药材提取物对淋球菌具有一定的抑菌能力，然而上述中药材提取物的MIC值远超现行的一线抗生素。

不过，类似的具有抗菌抑菌能力的中药还有很多，可以预见，针对日益严峻的淋球菌耐药现状，中药仍具有巨大的潜力发展成为高效的、安全的、廉价的新型抗菌剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种中药材提取物在预防和治疗淋球菌引起的感染性疾病中的应用。该中药材提取物对淋球菌具有极高的抗菌活性，应用前景广阔。

本发明解决上述技术问题所提供的技术方案为：

一种中药材提取物在制备治疗淋球菌引起感染的药物中的应用，所述中药材提取物为杨树型蜂胶乙醇提取物，制备方法包括如下步骤：

粉碎后的杨树型蜂胶用乙醇浸泡，超声处理后过滤，滤渣多次用新鲜乙醇提取，收集合并提取液；将提取液低温处理以析出蜂蜡，过滤除去蜂蜡后，滤液浓缩并干燥得到杨树型蜂胶乙醇提取物。

本发明制备得到的杨树型蜂胶乙醇提取物对淋球菌具有极优的抗菌活性，其最小抑菌浓度为32μg/mL；通过时间-杀菌实验，发现杨树型蜂胶乙醇提取物可有效杀死淋球菌，在32μg/mL的浓度下，可完全杀死淋球菌。

所述粉碎后的杨树型蜂胶与乙醇的体积比为每1g杨树型蜂胶加入8～12mL乙醇。

所述的乙醇为70％-95％乙醇的水溶液。

所述的超声处理为40-60℃下超声处理40～50min，所述的多次为2～4次。

所述的淋球菌为对头孢曲松钠、头孢克肟、阿奇霉素、盘尼西林、环丙沙星或四环素耐药的淋球菌。

所述的感染为泌尿生殖道、直肠、咽喉或眼部感染。

一种药物组合物，包括本发明所述的杨树型蜂胶乙醇提取物以及药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂，所述的药物制剂为醇-水溶液、片剂、胶囊、悬浮液、乳膏和凝胶。

所述的杨树型蜂胶提取物以醇-水溶液、凝胶、乳剂、胶囊、栓剂、片剂、溶剂、混悬液的形式经口、直肠和生殖道给药途径作用于人。

本发明还提供所述的药物组合物在制备治疗淋病药物中的应用，所述淋病为由淋球菌引起的感染性疾病。

所述的淋球菌为对头孢曲松钠、头孢克肟、阿奇霉素、盘尼西林、环丙沙星或四环素耐药的淋球菌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明杨树型蜂胶乙醇提取物作为抗菌的中药材提取物，与已有抗生素及其衍生物相比较，本发明对耐药菌敏感。

(2)本发明杨树型蜂胶乙醇提取物作为抗菌的中药材提取物，本发明杨树型蜂胶乙醇提取物不易形成耐药。

(3)本发明杨树型蜂胶乙醇提取物作为抗菌的中药材提取物，本发明杨树型蜂胶乙醇提取物经济实惠。

附图说明

图1为不同浓度杨树型蜂胶乙醇提取物以及对照组盘尼西林对淋球菌的时间-杀菌活性，其中，A为杨树型蜂胶乙醇提取物对淋球菌的时间-杀菌活性，B为对照组盘尼西林对淋球菌的时间-杀菌活性。

图2为不同浓度杨树型蜂胶乙醇提取物对临床分离淋球菌菌株(n＝100)的最小抑菌浓度分布。

图3为杨树型蜂胶乙醇提取物凝胶以及空白对照对小鼠生殖道淋球菌的清除作用，其中，a为杨树型蜂胶乙醇提取物以及空白对照淋球菌感染小鼠的百分比与时间的关系图，b为杨树型蜂胶乙醇提取物以及空白对照CFU与时间的关系图。

具体实施方式

在下面的实施例中对本发明的具体实施方案进行详细叙述。这些是对本发明进行说明，而不是对本发明的范围进行限制。除非另有说明，所有的试剂均为从市场上购得。

实施例1

取100g的杨树型蜂胶以粉碎机将其粉碎。用1L 95％的乙醇浸泡粉碎后的原料，并将其在40-60℃下超声处理45min，将处理后的样品经滤膜(Whatman No.4)抽滤，收集滤液，将残渣以同样浓度的乙醇重复处理两遍，收集并合并三次所得的滤液。

将滤液放置于-20℃冰箱中过夜以析出蜂蜡，再将其以抽滤的方式除去蜂蜡，收集再次所得的滤液。将所有滤液经旋转蒸发仪除去乙醇，加以浓缩，将浓缩后的溶液收集后在烘箱里进一步烘干至恒重(50℃)得到杨树型蜂胶乙醇提取物，收集并存放于-20℃冰箱。

称取一定量的杨树型蜂胶乙醇提取物并溶于95％乙醇中，配制为100mg/mL的储备液，用于后续实验。

对照例

选取贯众、青蒿、银杏叶、五味子、苦楝皮、花生红衣、扁豆衣、穿心莲、艾草、葡萄皮，共计10种中药材，取100g的上述原料用粉碎机将其粉碎。分别用1L(70％-95％)乙醇浸泡粉碎后的原料，具体浓度请见表1，并将其在40-60℃下超声处理45min，将处理后的样品经滤膜(Whatman No.4)抽滤，收集滤液，将残渣以同样浓度的乙醇重复处理两遍，收集并合并三次所得的滤液，浓缩除去乙醇。

表1

测试例1

本发明实施例1和对照例制得的提取物在体外的活性可根据欧盟药敏实验测试标准(EUCAST；www.eucast.org)进行评定。

根据欧盟药敏实验测试标准，用琼脂板稀释法检测淋球菌对中药材提取物的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)。从超低温冰箱复苏细菌，接种到含有添加1％Vitox GC琼脂平板上，37℃，5％CO₂，倒置培养14～18h，刮取细菌制备细菌悬液(OD＝0.01)，用微量加样器吸取5μl菌液点样在含有各个浓度中药材提取物的平板上，自然风干，在37℃，5％CO₂条件下培养24～48h，观察并记录MIC值。

本发明中药材提取物的中、英文名以及对不同病原细菌的MIC值如表2和表3所示。结果表明，杨树型蜂胶乙醇提取物(EEPP)能极好地抑制淋球菌的生长，其次为虎杖乙醇提取物(EEPC)，其余中药材提取物表现出一定的抗菌活性。

表2中药材乙醇提取物缩写表

测试例2

过夜培养的淋球菌(ATCC 49226)用GC液体培养基中制成OD₆₀₀＝1的菌悬液，取一定量的菌悬液加入12mL含有1％vitox的GC液体培养基中(10⁷CFU/mL)。将其在37℃，200rpm/min的摇床中培养1h后加入杨树型蜂胶乙醇提取物，使得浓度为16μg/mL，32μg/mL，64μg/mL；盘尼西林作为阳性对照，使得浓度为2μg/mL，0.5μg/mL。

在不同时间点，取样后稀释到合适浓度，吸取稀释后的100μL菌液涂在GC琼脂糖平板上，将平板在37℃、5％CO₂的培养箱中培养24-48h，观察并记录克隆数(CFU)。

结果如图1所示，结果表示为三次生物学重复实验结果的平均值±SD，虚线表示为检测下限。与盘尼西林对比，在2×MIC(64μg/mL)和1×MIC

(32μg/mL)浓度下，杨树型蜂胶乙醇提取物均能有效的快速杀死淋球菌，而在1/2×MIC(16μg/mL)时，亦能抑制淋球菌的生长，表明杨树型蜂胶乙醇提取物对淋球菌具有良好的杀菌活性。

测试例3

杨树型蜂胶乙醇提取物在体外的活性可根据欧盟药敏实验测试标准(EUCAST；www.eucast.org)进行评定。

根据欧盟药敏实验测试标准，用琼脂板稀释法检淋球菌临床分离株(n＝100)对本发明所示杨树型蜂胶乙醇提取物的MIC值，该100株临床分离淋球菌菌株包含对头孢曲松钠(CRO)、头孢克肟(CFM)、阿奇霉素、盘尼西林、环丙沙星和四环素耐药的淋球菌。从超低温冰箱复苏细菌，接种到含有添加1％Vitox GC琼脂平板上，37℃，5％CO₂，倒置培养14～18h，刮取细菌制备细菌悬液(OD＝0.01)，用微量加样器吸取5μl菌液点样在含有32μg/mL或64μg/mL杨树型蜂胶乙醇提取物的平板上，自然风干，在37℃，5％CO₂条件下培养24～48h，观察并记录MIC值。

由图2可知，临床分离的抗生素敏感型淋球菌和抗生素耐药型淋球菌菌株均对所述的杨树型蜂胶乙醇提取物敏感，表明所述的杨树型蜂胶乙醇提取物与抗生素耐药型淋球菌不存在交叉耐药，有利于所述的杨树型蜂胶乙醇提取物对淋球菌引起的感染性疾病的治疗。

测试例4

采用4-6周的BABL/c雌性小鼠，饲喂一周后检测小鼠的发情周期，在小鼠发情间期，称取10mg雌激素溶解于10mL芝麻油，给予每只小鼠在-2,0,2天皮下注射雌激素(0.1mg/只)，自-2天起，每天给予小鼠腹腔注射链霉素和万古霉素(100μL，链霉素1.2mg/只，万古霉素0.6mg/只)，并在饲喂的水中添加甲氧苄啶(0.04g/100mL)。

在第0天，给予小鼠阴道注射20μL的淋球菌(OD₆₀₀＝1，配置淋球菌菌悬液的溶剂为含有0.5mM CaCl₂、1mM MgCl₂和1％明胶的PBS缓冲液)。

第一天用浸泡于生理盐水的棉签在小鼠生殖道取样，将棉签置于GC液体培养基中，振荡，将其稀释一定浓度后取100μL涂于GC琼脂糖平板上，置于培养箱中培养24～48h。

取样后，给予小鼠生殖道用移液枪注入20-40μL含有所述杨树型蜂胶乙醇提取物的生理盐水溶液(3.2mg/mL)，对照为含有等量乙醇的生理盐水溶液，每天处理2次，每天以棉签刮取小鼠生殖道一次，将棉签置于GC液体培养基，振荡，将液体培养基涂于含有1％Vitox的GC琼脂糖平板，将平板在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24～48h，观察并记录克隆数，以监测小鼠生殖道的淋球菌。

由图3可知，与对照组相比，杨树型蜂胶乙醇提取物生理盐水溶液处理1天后，小鼠生殖道感染的淋球菌被极显著的清除了，表明所述杨树型蜂胶乙醇提取物生理盐水溶液在小鼠体内具有很好的杀死淋球菌活性。

Claims (4)

1.一种中药材提取物在制备治疗淋球菌引起感染的药物中的窄谱抗菌应用，其特征在于，所述中药材提取物为杨树型蜂胶95%乙醇提取物，其制备方法如下：

用95%的乙醇浸泡粉碎后的杨树型蜂胶，40~60℃下超声处理45min，处理后的样品经Whatman No. 4滤膜抽滤，收集滤液，残渣用95%的乙醇重复处理两遍，收集并合并三次获得的滤液；合并的滤液经低温处理析出蜂蜡，过滤除去蜂蜡后，滤液浓缩并干燥得到杨树型蜂胶95%乙醇提取物；所述粉碎后的杨树型蜂胶与95%乙醇的体积比为每1g杨树型蜂胶加入8~12mL95%乙醇。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的淋球菌为对头孢曲松钠、头孢克肟、阿奇霉素、盘尼西林、环丙沙星或四环素耐药的淋球菌；所述的感染为泌尿生殖道、直肠、咽喉或眼部感染。

3.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的杨树型蜂胶95%乙醇提取物以及药学上可接受的辅料制备成药学上常用的药物制剂，所述的药物制剂为醇-水溶液、片剂、胶囊、悬浮液、乳膏和凝胶。

4.根据权利要求3所述的药物组合物在制备治疗淋病药物中的应用，其特征在于，所述淋病为由淋球菌引起的感染性疾病；所述的淋球菌为对头孢曲松钠、头孢克肟、阿奇霉素、盘尼西林、环丙沙星或四环素耐药的淋球菌。

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