CN113694096B

CN113694096B - 一种甘草提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113694096B
Application number: CN202110901300.7A
Authority: CN
Inventors: 刘希望; 杨亚军; 秦哲; 李世宏; 白莉霞; 李剑勇
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2041-08-06
Also published as: CN113694096A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体为一种甘草提取物及其制备方法和应用，所述甘草提取物由下述方法制备得到：用水和极性有机溶剂作为提取剂，从甘草中药材切片中提取得到浸膏，通过碱溶酸沉对浸膏进行处理，得到甘草提取液；将得到的提取液浓缩至一定体积，用非极性有机溶剂除去脂溶性成分，继续浓缩得到浸膏；将得到的浸膏用碱水溶液搅拌悬浮，除去不溶物，再用酸水调节pH值至析出沉淀，过滤、干燥后得甘草提取物；本发明通过实验证明，甘草提取物在体外具有显著的抑制艰难梭菌作用，其最小抑菌浓度为8μg/ml，最小杀菌浓度为16μg/ml。因此本发明所提供的甘草提取物，在制备抗艰难梭菌感染药物具有重要意义。

Description

一种甘草提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体为一种甘草提取物及其制备方法和应用。

背景技术

艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)是指由艰难梭菌感染人和动物而导致的一类疾病的统称，其临床症状以不同程度的腹泻为主。艰难梭菌(Clostridium difficile)属于革兰氏阳性芽孢杆菌，专性厌氧，部分菌株可以分泌毒素。该菌广泛存在于人和动物的肠道中，其主要定植场所为结肠，是一种人畜共患的条件致病菌。在过去，艰难梭菌被认为是一种与人类共生的细菌，最早于1935年从新生儿肠道中被分离发现。随着认识的不断深入，艰难梭菌被认为与长期使用抗生素引起的肠道疾病相关，对人类的公共卫生安全产生巨大威胁。据美国疾病预防控制中心估计，2011年全美国约有45.3万人感染艰难梭菌，其中有2.9万人死于与艰难梭菌感染相关的疾病，是报道最为频繁的医院致病菌之一。同时，研究发现在这些CDI患者中，大约有1/4为医院内感染，从而使病人的住院费用增加约4倍，在全美范围内增加了大约15亿美元的医疗支出。在兽医领域，从猪、牛、羊、鸡等主要食品动物以及犬、猫等伴侣动物的体内或粪便样本中均分离到了艰难梭菌，与新生幼畜的腹泻、肠炎等疾病存在紧密的联系。

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎。春、秋二季采挖，除去须根，晒干。甘草性甘，味平，归心、肺、脾、胃经。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。甘草做为临床常用中药材，在众多处方中均有收录。根据中医药“君臣佐使”理论，甘草常作为使药，用于调和诸药。化学成分研究显示，甘草中主要含有三萜类、黄酮类、多糖类、香豆素类、挥发油类以及氨基酸等成分，其中三萜类和黄酮类是主要成分。其中，黄酮类主要成分为甘草黄酮、甘草黄酮B、甘草黄酮C、芹菜素、甘草黄酮醇、甘草素、柚皮素、甘草查尔酮、异甘草素等。现代药理学研究表明，甘草具有广泛的抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、神经保护、肝脏保护等药理作用。

甘草不同成分的提取物具有不同的药理活性，其中，黄酮类提取物是其发挥抗菌活性的主要成分。研究报道了不同产地(甘肃、新疆、内蒙古)甘草总黄酮的提取工艺研究。提取方法包括常规浸提法、超声提取法、回流提取法等。

尽管文献报道对甘草提取物的抗氧化、抗癌、降血脂等生物活性进行了广泛研究，但未见甘草提取物抗艰难梭菌活性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘草提取物及其制备方法和应用。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种甘草提取物，其特征在于，所述甘草提取物由下述方法制备得到：

步骤(1)：用水和极性有机溶剂作为提取剂，从甘草中药材切片中提取得到浸膏，通过碱溶酸沉对浸膏进行处理，得到甘草提取液；

步骤(2)：将步骤(1)得到的提取液浓缩至一定体积，用非极性有机溶剂除去脂溶性成分，继续浓缩得到浸膏；

步骤(3)：将步骤(2)得到的浸膏用碱水溶液搅拌悬浮，除去不溶物，再用酸水调节pH值至析出沉淀，过滤、干燥后得甘草提取物。

优选的，在步骤(1)中，所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇。

优选的，在步骤(1)中，所述的提取剂为体积百分含量为50％～100％的极性有机溶剂水溶液。

优选的，在步骤(1)中，所述的提取为回流提取、常规浸提和超声提取。

优选的，在步骤(2)中，所述的非极性有机溶剂为石油醚和正己烷。

优选的，在步骤(3)中，所述的碱为碳酸钠、碳酸钾和氢氧化钠。

优选的，在步骤(3)中，所述的酸为盐酸、硫酸、硝酸、甲酸和乙酸。

优选的，在步骤(3)中，所述的pH值为3～4。

本发明还提供了所述甘草提取物在制备抗艰难梭菌药物中的应用。

本发明所述的抗艰难梭菌药物是指对艰难梭菌(Clostridium difficile)具有显著抑制活性药物或药物组合物。

本发明所述的抗艰难梭菌药物治疗的疾病为由艰难梭菌感染引起的腹泻或结肠炎，包括人和动物。

本发明具有以下有益效果：本发明通过实验证明，甘草提取物在体外具有显著的抑制艰难梭菌作用，其最小抑菌浓度为8μg/ml，最小杀菌浓度为16μg/ml。在小鼠感染艰难梭菌实验动物模型上，甘草提取物可显著减轻艰难梭菌感染引起的腹泻症状，减轻体重降低，提高小鼠的存活率。因此本发明所提供的甘草提取物，在制备抗艰难梭菌感染药物具有重要意义。

附图说明

为了更加清晰的理解本发明，通过结合说明书附图与示意性实施例，进一步介绍本公开，附图与实施例是用来解释说明，并不构成对公开的限定。

图1为本发明中甘草提取物对艰难梭菌的杀菌曲线；

图2为本发明中甘草提取物治疗感染艰难梭菌小鼠的存活率；

图3为本发明中甘草提取物对感染艰难梭菌小鼠体重的影响。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：甘草提取物的制备

1、试验材料和设备

药材与试剂：中药饮片甘草购自甘肃兰州黄河中药材市场；无水乙醇、碳酸钠、盐酸，国药集团化学试剂有限公司。

粉碎机：1000克摇摆式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司；磁力搅拌器：德国海道夫公司；其它烧杯、量筒等为实验室常规设备。

2、试验方法与结果

甘草饮片烘干后用粉碎机粉碎，称取粉末200g，将其以1:5(甘草粉末：95％乙醇)的重量份数比与95％乙醇(乙醇：水＝95:55，体积比)混匀，室温(25±2℃)超声提取(100W)提取2次，每次提取2h。合并2次提取液，减压浓缩至约200～300ml，加入等体积的石油醚，萃取2次，除去脂溶性成分。提取液继续浓缩至约100ml，得甘草提取浸膏。

向甘草提取浸膏中加入10％碳酸钠溶液(10g碳酸钠：100ml水)200ml，室温搅拌(500r/min)悬浮2h。用布氏漏斗抽滤除去不溶物，得黄色滤液。在搅拌(300r/min)条件下将滤液用稀盐酸(1mol/L)调节至pH值为3～4，有土褐色沉淀析出，继续搅拌(300r/min)1h至沉淀完全。过滤沉淀物，烘干得土褐色甘草提取物2.95g。

实施例2：甘草提取物的体外抑菌活性试验

1、试验材料和设备

菌株：艰难梭菌(ATCC43255、BAA1803)，购自美国ATCC公司；艰难梭菌(CICC22951)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

试剂：厌氧液体培养基，北京陆桥技术股份有限公司；血平板、琼脂购自广东环凯生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、甲硝唑、万古霉素、硝唑尼特购自sigma公司；

试验仪器：超净工作台，高压灭菌锅，厌氧培养箱，电子分析天平，细胞密度计，移液器，Direct-Q3超纯水系统。

2、试验方法

2.1药液配制：将甘草提取物、甲硝唑、万古霉素、硝唑尼特用DMSO配成浓度为1mg/mL的药液，待用。

2.2菌液制备：将复苏后的艰难梭菌划线接种至血平板厌氧培养48h，用接种环挑取艰难梭菌单菌落，接种到含有约5mL厌氧液体培养基的灭菌试管中，厌氧培养箱中37℃培养18～24h。用细菌密度仪测试菌液浓度，使OD600吸收值＞1.0。用厌氧液体培养基将菌液稀释100倍，使菌液的浓度大约为1×10⁶CFU/mL，作为菌悬液以备用。

2.3最小抑菌浓度(MIC)测定：在96孔板中，第1列加入液体培养基174.4μL，第2～11列加入液体培养基100μL。随后，向第1列加入浓度为1mg/mL的药液25.6μL，吹打混匀后吸出100μL至第2孔中，依次类推。稀释完毕后，在每孔中加入上述浓度为1×10⁶CFU/mL菌悬液100μL，使每孔中药物浓度依次为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。同时设空白对照组、DMSO对照组、阳性药物对照组(甲硝唑、万古霉素、硝唑尼特)，每组2个平行。

将96孔板放入厌氧培养箱中，37℃厌氧培养24h后观察结果，在黑暗背景下肉眼观察，96孔板每孔中混合物清亮，孔底无菌落形成的最低浓度即为化合物的MIC值。上述试验重复2次。

2.4最小杀菌浓度(MBC)测定：用移液器从2.2.3项下已观察MIC结果的微孔板上吸取培养液100μL，接种于血平板上，涂匀，37℃厌氧培养48h，观察结果，以无细菌生长的最低浓度为细菌的MBC值。

3、试验结果

甘草提取物具有显著的体外抑制艰难梭菌活性，对艰难梭菌ATCC43255、BAA1803、CICC22951的MIC值均为8μg/mL、对照药物甲硝唑、万古霉素和硝唑尼特具有显著的体外抑制艰难梭菌活性，具体结果见表1。

表1甘草提取物对艰难梭菌的最小抑菌浓度测定结果

甘草提取物对艰难梭菌具有显著的体外杀菌活性，对艰难梭菌ATCC43255、BAA1803、CICC22951的MBC值均为16μg/mL、对照药物甲硝唑、万古霉素和硝唑尼特对三种艰难梭菌具有不同程度的杀菌活性，但最小杀菌浓度与最小抑菌浓度相比，均有不同程度的升高，具体结果见表2。

表2甘草提取物对艰难梭菌的最小杀菌浓度测定结果

实施例3：甘草提取物对艰难梭菌的杀菌曲线测定

1、试验材料

菌株：艰难梭菌(ATCC43255)，购自美国ATCC公司。

试剂：厌氧液体培养基，北京陆桥技术股份有限公司；琼脂购自广东环凯生物科技有限公司；试验仪器：超净工作台，高压灭菌锅，厌氧培养箱，电子分析天平，细胞密度计，移液器，Direct-Q3超纯水系统。

2、试验方法

2.1药液配制：将甘草提取物用DMSO配成浓度为5mg/mL的药液，待用。

2.2菌液制备：用接种环挑取艰难梭菌单菌落，接种到含有约5mL厌氧液体培养基的灭菌试管中，厌氧培养箱中37℃培养18～24h。用细菌密度仪测试菌液浓度，使OD₆₀₀吸收值＞1.0,作为菌悬液以备用。

2.3杀菌曲线测定：取灭菌试管，吸取5ml上述菌悬液，用移液器加入相应体积的甘草提取物药液，使浓度为32μg/mL。混匀后放入厌氧培养箱，37℃厌氧培养。分别于0h、1h、2h、4h、6h、8h从各试管中吸取200μL菌液，用厌氧液体培养基连续稀释至10⁶倍。然后吸取不同稀释倍数的菌液100uL，涂布至厌氧琼脂板上，37℃厌氧培养48h后进行菌落计数。同时设空白对照组。

3、试验结果

当菌液中加入32μg/mL浓度的甘草提取物时，对细菌产生显著的杀灭作用。与空白对照组相比，在1h、2h、4h时，菌落数显著低于对照组，6h和8h时，菌落数已降至检测线以下，具体结果见图1。

实施例4：细胞毒性试验

1、试验材料

Ccaco-2细胞，中国科学院上海细胞库；CCK-8细胞活力检测试剂盒，西格玛试剂公司；二氧化碳培养箱，德国memmert；酶标仪，美国赛默飞世尔；96孔板、MEM培养基、胎牛血清、非必须氨基酸，均购自美国赛默飞世尔。

2、试验方法

取对数生长期Caco-2细胞，调整细胞密度至1×10⁵细胞/mL的密度接种在无菌96孔板中，每个孔中加入100μL细胞悬液，并在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24小时，弃掉原来的培养基，然后加入100μL不同浓度的甘草提取物溶液(1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50μg/mL)，并为每个浓度设置6个平行的重复孔。将细胞培养12h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，放入细胞培养箱中继续培养1-2h后，用酶标仪测量450nm处的OD值。根据OD值带入计算公式，计算半数抑制浓度(IC₅₀)值。

3、试验结果

根据测定结果，计算得甘草提取物对Caco-2细胞的IC₅₀为202.7μg/mL。该结果提示，甘草提取物对Caco-2细胞无显著的细胞毒性，未来临床使用时具有较高的安全性。

实施例5：甘草提取物对艰难梭菌感染小鼠的体内抑菌活性试验

1、试验材料

试验动物：6周龄BALB/c小鼠，体重(20±2)g，雄性，购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

试剂：卡那霉素、庆大霉素、粘菌素、万古霉素、甲硝唑、林可霉素，购自sigma公司；羧甲基纤维素钠，国药集团化学试剂有限公司。

2、试验方法

将万古霉素、甘草提取物按剂量分别悬浮至1％的羧甲基纤维素钠溶液中，涡旋混匀，制成药物混悬液，4℃保存，备用。

将32只BALB/c小鼠依体重随机分为4组，每组8只，分别为正常组、感染组、甘草提取物组(50mg/kg)和万古霉素组(50mg/kg)。适应饲养一周后，饮用水中添加卡那霉素0.4mg/mL、庆大霉素0.035mg/mL、粘菌素850U/mL、甲硝唑0.215mg/mL、万古霉素0.045mg/mL，自由饮水饲养5天。然后饮水换为灭菌水饲喂3天。感染前1天，一次性腹腔注射10mg/kg的克林霉素。

将艰难梭菌ATCC43255接种至液体培养基厌氧培养18h，3500g离心5min，弃去上清液，沉淀用生理盐水悬浮，制成浓度约为1×10⁹CFU/ml的菌液，备用。除正常组外，其余各组每只小鼠灌胃0.2mL上述菌液，建立艰难梭菌感染小鼠试验模型。感染后16h第1次给药，药物组灌服给予剂量50mg/kg的甘草提取物和50mg/kg万古霉素药物混悬液0.2mL，正常组和感染组灌服等体积的1％羧甲基纤维素钠溶液，每天1次，连续5天。感染后继续饲养7天，期间观察小鼠腹泻、被毛、姿态、粪便形态和及死亡状况，给药前称重，7天后小鼠全部脱臼处死。

3、试验结果

感染对照组小鼠感染艰难梭菌16h后，出现不同程度湿尾、竖毛、弓背、粪便不成型症状，体重显著下降。至感染后第2天，症状严重的小鼠出现死亡。至感染后第4天，小鼠症状逐渐缓解，体重逐渐恢复。但给药组和感染组在体重和死亡率指标上有显著差异。结果见图2和图3。

从图2可以看出，感染对照组小鼠在感染后第2天即出现死亡，存活率为62.5％，第3天时存活率50.0％，第4天至第7天无小鼠死亡。甘草提取物组在感染后7天内，未出现小鼠死亡，存活率为100％。万古霉素对照组在感染后第4天死亡小鼠，存活率87.5％，至第7天，未出现小鼠死亡。正常组小鼠全部存活。

经数据分析比较，在存活率指标方面，甘草提取物组与感染组差异极显著(P＜0.01)；万古霉素对照组与感染组差异显著(P＜0.05)；甘草提取物组与万古霉素组之间无显著差异(P＞0.05)。

从图3可以看出，艰难梭菌感染小鼠后，体重显著下降，与正常组相比，差异极显著(P＜0.01)。在没有药物干预和治疗的情况下，感染小鼠的体重至第3天，下降至最低。从各给药组和感染组相比来看：

感染后第1天，正常组体重明显高于感染组、甘草提取物组和万古霉素组，差异极显著(P＜0.01)，甘草提取物组体重显著高于万古霉素组(P＜0.05)；感染后第2天，正常组体重明显高于感染组和甘草提取物组(P＜0.05)，显著高于万古霉素组(P＜0.01)，其它各组之间无显著差异；感染后第3天，正常组体重显著高于感染组、甘草提取物组和万古霉素组，差异极显著(P＜0.01)，万古霉素组显著低于感染组，差异显著(P＜0.05)；感染后第4天，正常组体重显著高于感染组和甘草提取物组，差异显著(P＜0.05)，显著高于万古霉素组(P＜0.01)；感染后第5和第6天天，正常组体重显著高于万古霉素和甘草提取物组，差异显著(P＜0.05)，其它各组之间无显著差异；感染后第7天，各给药组和感染组小鼠的体重逐渐恢复，尽管正常组体重高于其它各组，但差异不显著(P＞0.05)。另外，由于感染组有3只小鼠和1只小鼠分别在感染后第2天和第3天死亡，存活小鼠体况较好，致使感染组小鼠体重反而高于甘草提取物组和万古霉素组。

综合分析实验小鼠死亡率和体重变化可以得出如下结论：小鼠感染艰难梭菌后，体重迅速下降，不采取药物治疗，死亡率高达50％；甘草提取物可显著降低艰难梭菌感染后小鼠的死亡率，缓解症状，减轻体重下降，在相同剂量50mg/kg时，治疗效果优于万古霉素。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.甘草提取物在制备抗艰难梭菌药物中的应用，其特征在于，所述甘草提取物由下述方法制备得到：

步骤（1）：甘草饮片烘干后用粉碎机粉碎，称取粉末200g，将甘草粉末与95%乙醇以1:5的重量份数比混匀，室温超声提取2次，每次提取2h，合并2次提取液，减压浓缩至200～300ml，加入等体积的石油醚，萃取2次，除去脂溶性成分；提取液继续浓缩至100ml，得到甘草提取浸膏；室温温度为25±2℃，超声功率为100W；

步骤（2）：向甘草提取浸膏中加入10%碳酸钠溶液200ml，室温搅拌悬浮2h,所述10%碳酸钠溶液由10g碳酸钠和100ml水组成，所述搅拌速度为500r/min；用布氏漏斗抽滤除去不溶物，得黄色滤液；在搅拌条件下将滤液用稀盐酸调节至pH值为3～4，有土褐色沉淀析出，继续搅拌1h至沉淀完全，所述搅拌速度为300r/min，所述稀盐酸的浓度为1mol/L；过滤沉淀物，烘干得到土褐色甘草提取物2.95g。

2.根据权利要求1所述的甘草提取物在制备抗艰难梭菌药物中的应用，其特征在于：所述甘草提取物在制备治疗由艰难梭菌感染引起的腹泻或结肠炎药物中的应用。