CN106138054A - 白屈菜红碱在治疗禽耐药性大肠杆菌病上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及白屈菜红碱在治疗禽耐药性大肠杆菌病上的应用，具体为将白屈菜红碱及其他臣药和佐药制备成用于治疗禽耐药性大肠杆菌病的药物。本发明涉及药物可以根据市场需求及生产条件制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、粉剂、溶液剂、注射剂等适宜的中药剂型。具有药物成本低廉、生产工艺简单、质量可控等特点。对禽耐药性大肠杆菌病的有效率达93.5％，可以减少死淘率、提高鸡群整齐度、增加饲料报酬，同时环保无污染。

Description

白屈菜红碱在治疗禽耐药性大肠杆菌病上的应用

技术领域

本发明涉及白屈菜红碱在治疗禽耐药性大肠杆菌病上的应用，具体涉及一种治疗禽耐药性大肠杆菌病的药物。

背景技术

禽大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌引起的局部或全身性感染的传染病，其特征是引起鸡的心包炎、气囊炎、肝周炎、腹膜炎、滑膜炎、肉芽肿、肠炎、脑炎、皮下水肿、败血症等多种临诊病型，并且还常常与病毒和其它细菌性疾病并发，造成鸡群死亡率高，给养禽业造成了严重的经济损失。由于大肠杆菌的抗原结构复杂，血清型多，传播途径多，加之我国饲养环境普遍较差，病原污染严重，使得近年来该病的发病率越来越高，已成为危害养鸡业健康发展的最严重的疾病之一。

随着抗生素在禽大肠杆菌病预防和治疗方面的广泛、持续及不当使用，大肠杆菌耐药谱不断扩大，耐药水平不断提高，大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重，耐药菌株增高、耐药基因在细菌之间的传播、耐药菌株通过食物链和人与动物的直接接触传染人、引起人和动物疾病治疗的失败，这些危害对我国畜牧业的持续发展和人类健康都是十分严重的。

白屈菜红碱(chelerythrine，CHE)别名白屈菜赤碱、白屈菜季铵碱，是从飞龙掌血、白屈菜、博落回、血水草等植物中分离的异喹啉的苯并菲啶型类生物碱。可溶于氯仿、甲醇，易溶于乙醇等。国内外对白屈菜红碱的药理活性研究表明，其具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、杀虫、抗纤维化等多种药理活性。大量试验结果表明，白屈菜红碱具有广泛的抗细菌和抗真菌作用，对大肠杆菌具有良好的抑菌活性。白屈菜红碱在人用药物临床上已有使用，但在兽用禽药领域，尚未见相关报道。

综上所述，白屈菜红碱在兽药技术领域的应用拓宽了兽医在临床治疗上的选择，具有广阔的应用前景。

发明的内容

本发明的目的在于将白屈菜红碱应用于治疗禽耐药性大肠杆菌病，并将白屈菜红碱作为活性成分用于制备禽耐药性大肠杆菌病的治疗的药物。药物为以白屈菜红碱为主要活性成分的药物制剂，其含量为0.1-99％。白屈菜红碱在药物中存在形式为药物原型或其药学上可接受的盐，包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐等。

本发明公开了一种治疗耐药性禽大肠杆菌病的药物，所述的药物以白屈菜红碱为主要活性成分，还可以包括臣药和佐药，如黄连、白头翁、黄柏、白芍、郁金、黄苓等药材的提取物或其中的代表成分，其余为药物可接受的载体。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

血水草中白屈菜红碱的提取：①浸提：称取适量的样品，加入PH值为1的盐酸水溶液，放入水浴槽中，在100℃条件下，提取30min，提取出血根碱和白屈菜红碱。②分离：利用大孔吸附树脂吸附分离血水草中的血根碱和白屈菜红碱，用100％乙醇洗脱分离。

白屈菜中白屈菜红碱的提取：取白屈菜粉末2g，加入料液比为1∶20的70％乙醇溶液，在700w超声波功率条件下提取30min，利用大孔吸附树脂吸附分离。

本发明所公开的药物是由白屈菜红碱与相应的药用辅料制成的所需剂型。涉及的中药制剂可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、粉剂、溶液剂、注射剂等。

其中颗粒剂的制备方法为：取提取得到的白屈菜红碱1份，糖粉3份，糊精1份，过80目筛，混合均匀，用80％酒精制成适宜的软材，将软材过14目筛制粒，于60℃下干燥，干燥后的颗粒用12目筛整粒，包装即得。

注射剂的制备方法为：取风干或晒干全草20克粗粉，加PH4的硫酸水溶液，煎煮2次，每次30分钟。纱布过滤，合并滤液，浓缩至稠糖浆状。缓缓滴加氢氧化钠溶液至PH9-10，放置，滤取溶液中析出的棕黑色沉淀，加乙醇使其溶解，用3号垂熔漏斗过滤，滤液加收乙醇后加PH4-5磷酸水溶液使总体积为100毫升，加苯甲酸1毫升，过滤，用2毫升安瓿灌封制为20％注射液，用100℃蒸气灭菌30分钟。

本发明公开的用于治疗禽耐药性大肠杆菌的药物可用于耐药性禽大肠杆菌的治疗，大量体外抑菌试验和临床治疗试验表明，本发明公开的药物对耐药性禽大肠杆菌有明显的抑制作用。不仅可以治疗耐药性禽大肠杆菌病，同时也对非耐药性大肠杆菌病也有很好的疗效。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

具体实施例1 白屈菜红碱的提取方法

血水草中白屈菜红碱的提取方法。浸提：称取适量的样品，加入PH值为1的盐酸水溶液，放入水浴槽中，在100℃条件下，提取30min，提取出血根碱和白屈菜红碱。分离：利用大孔吸附树脂吸附分离血水草中的血根碱和白屈菜红碱，用100％乙醇洗脱分离。该方法污染少、经济、重复性好，产品收率高、纯度高，可适用于工业化生产。

白屈菜中自屈菜红碱的提取方法：取白屈菜粉末2g，加入料液比为1∶20的70％乙醇溶液，在700w超声波功率条件下提取30min，利用大孔吸附树脂吸附分离。白屈菜红碱提取率较大。

具体实施例2 白屈菜红碱的含量测定方法

按照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(25∶75)为流动相；检测波长为282nm；流速1.0ml/min；理论塔板数按白屈菜红碱峰计算不得低于3000。

对照品溶液的制备：取白屈菜红碱对照品10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液的制备：取本品10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定方法：分别精密吸取对照品和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

以下通过试验数据进一步说明本发明的有益效果。

具体实施例3 制剂制备方法

1.颗粒剂的制备：

取提取得到的白届菜红碱1份，糖粉3份，糊精1份，过80目筛，混合均匀，用80％酒精制成适宜的软材，将软材过14目筛制粒，于60℃一下干燥，干燥后的颗粒用12目筛整粒，包装即得。

2.注射剂的制备：

注射剂：取风干或晒干全草20克粗粉，加PH4的硫酸水溶液，煎煮2次，每次30分钟。纱布过滤，合并滤液，浓缩至稠糖浆状。缓缓滴加氢氧化钠溶液至PH9-10，放置，滤取溶液中析出的棕黑色沉淀，加乙醇使其溶解，用3号垂熔漏斗过滤，滤液加收乙醇后加PH4-5磷酸水溶液使总体积为100毫升，加苯甲酸1毫升，过滤，用2毫升安瓿灌封制为20％注射液，用100℃蒸气灭菌30分钟。

根据治疗方法的需要，本发明的中药制剂可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、粉剂、溶液剂、注射剂等。

具体实施例4 对禽耐药性大肠杆菌的体外抑菌试验

1材料

1.1试验药品

白屈菜红碱供试液(本实验室自行提取)，本试验中白屈菜红碱的起始浓度为5000μg/ml。1.2耐药性禽大肠杆菌

由辽宁农业职业技术学院健康养殖与评价中心分离鉴定，并经耐药性检测，对盐酸环丙沙星、阿莫西林、头孢噻肟、氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶钠均有不同程度的耐药

1.3培养基

肉汤培养基，称取30g，加入1000ml蒸馏水，加热煮沸，溶解分装，成分：牛肉粉15g，蛋白胨10g，氯化钠5g。PH值：7.0-7.4。购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

肉汤琼脂培养基，称取45g，加入1000ml蒸馏水，加热煮沸，溶解分装成分(g/L)：牛肉粉10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，磷酸氢二钾2g。PH值：7.0-7.4。购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

两种培养基均经121℃压力蒸汽灭菌20min后放置4℃冰箱中保存待用。

1.4试验器材

有棉塞的无菌试管，1ml微量加样器，酒精灯，恒温培养箱，超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，电子分析天平，平皿，三角锥瓶，移液管，烧杯，细菌涂布器，电炉等。

2方法

2.1供试菌液的制备：将活化的耐药大肠杆菌菌种(共三株)分别接种于营养琼脂培养基，置37℃恒温培养箱培养，次日挑选单个菌落1-2个接种于2ml营养肉汤培养基中，置于37℃恒温箱16-18h培养后取出，用移液管吸取0.5ml，用生理盐水作10-1的梯度稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9四个滴度的菌液各0.1ml在营养琼脂平板上摊开，再培养18-24h，用平板计数法计算菌液浓度，将供试菌液用培养液稀释至10⁴cfu/ml。

2.2抑茵试验：

2.2.1试管倍比稀释法抑菌试验：

排列具棉塞的无菌试管，每列10管，各管均加入1.0ml培养基，用吸管吸取白屈菜红碱供试药液放入第1管，并反复吹匀；接着从第1管吸出1ml放入第2管同样吹匀后吸出1ml放入第3管，依次逐管进行稀释到第8管，第10管不加白屈菜红碱药液，作为细菌对照组，第9管只加药液，不加菌液，作为药物对照组。第1-8及第10管各加入耐药性禽大肠杆菌菌液0.5ml。37℃培养16-18h后观察结果。如果试管澄清透明，摇匀后仍透明，认为该管无菌生长，若试管呈现浑浊状态，表明有菌生长。以无菌生长的最低浓度为MIC。试验重复2次，取其平均值。

3结果

37℃培养16-18h后观察结果显示，大肠杆菌菌液的试管全部清亮，所以另取3组试管重新测定，每组15支。37℃培养16-18h后观察结果显示，前13管大肠杆菌菌液的试管全部清亮，发现第14管以后试管出现浑浊，所以其MIC值为0.00625μg/ml。证明禽大肠杆菌对白屈菜红碱敏感。

4结论

本试验结果显示，白屈菜红碱对耐药性禽大肠杆菌有明显的抑制作用。

具体实施例5 白屈菜红碱的临床治疗试验

2014年3月份，我市周边某养殖场饲养的6000只蛋鸡(7月龄)，突然发病，病初有的鸡没有明显症状就突然死亡，第2天，每天死亡少则十几只，多则几十只，7天死亡了237只，死亡率约为4％。发病鸡体温升高，精神沉郁，采食量饮水量下降。病鸡不愿走动，远离鸡群。明显下痢，粪便呈黄白色、黄绿色稀粪，有的混有多量粘液或混有血液。产蛋率下降。通过观察病鸡临床症状、剖检，初步判断为大肠杆菌感染。用氟哌酸拌料给药未见明显疗效。后经化验室取病料分离鉴定，确诊病原菌为大肠杆菌，且根据纸片扩散法进行该大肠杆菌的耐药性试验，结果如下：

发现分离出的大肠杆菌对氟哌酸、庆大霉素、多西环素、盐酸环丙沙星、左氧氟沙星、阿莫西林、头孢曲松钠、盐酸林可霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、克林霉素、红霉素、克拉霉素、替米考星、阿奇霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠耐药。取本发明所制的颗粒剂给鸡饮水服用，使用方法为混饮，100克兑水200-400公斤，供集中饮用。连用7天后病情得到有效控制，10天后鸡群趋于正常，2周后不见有鸡死亡。共治疗5300只鸡，成活4953只，有效率达93.5％。

Claims (8)

1.白屈菜红碱在治疗禽耐药性大肠杆菌病上的应用，其特征在于，将白屈菜红碱作为活性成分用于制备禽耐药性大肠杆菌病的治疗的药物。

2.根据权利要求1所述的白屈菜红碱在治疗禽耐药性大肠杆菌病上的应用，其特征在于，所述白屈菜红碱存在形式为药物原型或其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求1所述的白屈菜红碱在治疗禽耐药性大肠杆菌病上的应用，其特征在于，所述药物可以含有黄连、白头翁、黄柏、白芍、郁金、黄苓等药材的提取物或其中的代表成分。

4.根据权利要求1所述的白屈菜红碱在治疗禽耐药性大肠杆菌病上的应用，其特征在于，所述药物是白屈菜红碱与相应的药用辅料制成的所需剂型。

5.根据权利要求4所述的白屈菜红碱在治疗禽耐药性大肠杆菌病上的应用，其特征在于，所述的剂型为：片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、粉剂、溶液剂、注射剂。

6.一种提取白屈菜红碱的方法，其特征在于，该方法可从血水草、白屈菜中提取白屈菜红碱。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述从血水草中提取白屈菜红碱的步骤包括：①浸提：称取适量的样品，加入PH值为1的盐酸水溶液，放入水浴槽中，在100℃条件下，提取30min，提取出血根碱和白屈菜红碱。②分离：利用大孔吸附树脂吸附分离血水草中的血根碱和白屈菜红碱，用100％乙醇洗脱分离。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述从白屈菜中提取白屈菜红碱的步骤包括：取白屈菜粉末2g，加入料液比为1∶20的70％乙醇溶液，在700w超声波功率条件下提取30min，利用大孔吸附树脂吸附分离。