CN104013668A - 甘草黄酮类提取物用于制备治疗溃疡性结肠炎药物中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘草黄酮类提取物在治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。通过利用甘草黄酮类提取物在用于治疗溃疡性结肠炎药物方面的新应用，甘草黄酮类提取物相比阳性对照药物柳氮磺吡啶对乙酸致小鼠溃疡性结肠炎表现出更好的治疗作用，以期在制备治疗溃疡性结肠炎药物中具有现实的价值，甘草黄酮类提取物中甘草脂溶性黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎疾病药物得到良好的应用效果，甘草类黄酮提取物中的查耳酮类物质对于治疗溃疡性结肠炎疗效明显显著。该甘草黄酮类提取物既可以从甘草中提取获得，也可从提取过甘草酸残留的渣中提取获得，不仅能更充分的利用甘草资源，而且还有利于将甘草废渣资源开发利用起来，变废为宝，具有广泛的应用价值。

Description

甘草黄酮类提取物用于制备治疗溃疡性结肠炎药物中应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体的说，本发明具体涉及甘草黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用技术领域，更进一步讲，本发明具体涉及利用常见甘草黄酮类化合物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用技术领域。

背景技术

黄酮类化合物是一类在自然界广泛分布的多酚类物质。现已发现数百种不同类型的黄酮类化合物具有广泛的生物活性和药理活性。大量研究表明，黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能。随着工业的发展与消费观念的改变，天然活性成分的保健食品成为现代人追逐的目标，其中黄酮类化合物以纯天然、高活性、见效快、作用广泛等特点日益受到人们的关注。

黄酮类化合物为一类低分子量的广泛分布于植物界的天然植物成分，为植物多酚类的代谢物，大多有颜色。黄酮类化合物又名生物类黄酮化合物，是色原酮或色原烷的衍生物，黄酮类化合物是自然界中以C6-C3-C6 的方式构成的三环天然有机物，其化学结构中C3 部分可以是脂链，或与C6 部分形成六元或五元环，黄酮类化合物泛指这种两个苯环通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物。一般黄酮类化合物可根据母核基本结构的不同进行分类，主要有黄酮醇、黄酮、黄烷酮、黄烷醇、花色素、异黄酮、二氢黄酮醇以及查尔酮等8类。另外，还有一些其他类型的类黄酮，如香豆素等。类黄酮可以是配基和糖苷型，也可以是甲脂衍生物。黄酮醇以及黄酮化合物是最为常见的类黄酮，而黄烷酮、黄烷醇类、二氢黄酮以及二氢查尔酮类化合物被认为是一类微量类黄酮，因为后者在自然界分布相对有限。

甘草(Glycyrrhizae radix,GR)又名甜草根、粉草、灵通、国老等，为豆科甘草属多年生草本植物。甘草株高40~80cm，根茎粗壮，具有地下匐枝，主根圆柱形，长达1~2m，外皮红褐色至暗褐色，横断面茎内部淡黄色或黄色，有甜味，茎直立，密被白色短毛及刺毛状腺体，羽状复叶，具小叶7~17片，卵形、圆形，长1 - 3cm，宽1- 2.5cm，总状花序腋生，花密集:花冠蝶形，淡蓝紫或紫红色，长14-25mm。荚果条状长圆形、镰刀形或弯曲成环状，褐色，外面密被刺状腺体及短毛，种子为2-8粒，扁圆形或肾形，黑色，花期6-7月，果期7-9月。我国药典记载药用甘草为乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草的干燥根及根茎。甘草归心、肺、脾、胃经，从古至今，广为药用。

人类应用甘草有近2400年的历史，我国医籍文献记载甘草最早见于《神农百草经》，列为上品，称有强坚筋骨、长肌肉、倍力气和解毒之功，能治五脏腹寒、热邪气及金疮肿，东汉医圣张仲景(公元2世纪)在其《伤寒论》中使用处方74%有甘草。梁朝名医陶弘景(公元5世纪)编著的《名医别录》中称其为“美草、蜜甘、国老”，并冠以“众药之王”的称号。明朝李时珍在其《本草纲目》中把甘草放于1074种中药的第一味，收录于12卷之首。清朝吴其俊在他的《植物名实图考》中，对甘草亦有较详细的考证。《本草正》中写道“甘草得中和之性，有调补之功，故毒药得之解其毒，刚药得之和其性，表药得之助其外，下药得之缓其速。随气药入气，随血药入血，无往不可，故称“国老”。种植甘草中的甘草酸及黄酮提取纯化工艺研究甘草经我国传统医学长期临床实践验证，确认其有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效，可用于治疗脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽多痰、腹腔和四肢疼痛、痈肿疮毒等症，并用之缓解其它药的毒性。甘草还具有抗寒、耐热、耐旱、抗盐碱、喜光等优良特性，适生性强、生命力旺盛，为干早地区的植物资源之一。50年代以后，各国学者对甘草进行了较为深入的研究，随着研究的深入和新技术的不断应用，人们对甘草的认识和应用也愈来愈广泛。

甘草作为常用大宗药材，药食兼用品种，年需要量约6万吨左右，位列诸药前列，被医药界誉为“国老、药王、软黄金”，有“十方九草”之美誉，被大量用于临床药物配方，甘草提取物还被应用于日用化工领域，并有大量的出口。传统中医药理论认为，甘草具有补脾益气，清热解毒，润肺止咳等功效，并具有调和诸药的作用。用于脾胃虚寒，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，四肢痉挛疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性等。现代药理研究表明，甘草所含的三萜类、黄酮类和多糖类为甘草中的主要活性成分，这三类成分具有多种药用价值，其中三萜类成分具有解毒、止咳平喘、抗炎及抗过敏、抗多种病毒、抗心律失常、抗肿瘤、抗肝损伤及降低胆固醇等作用，其中的甘草酸在甘草中含量最高，应用最广，主要用于制药、化工和功能性甜味剂等；甘草黄酮具有抑菌、抗肿瘤、抗氧化、抗心律失常等作用，主要用于制药，化妆品等；甘草多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等作用，主要用于制药和食品等领域。

在甘草中己发现和确定化学结构的化合物类型有三萜皂苷、黄酮、香豆素、甾醇、生物碱、挥发油、有机酸、糖类、氨基酸等，其中三萜皂苷类和黄酮类是其主要成分。黄酮类的代表化合物有甘草素(Liquihtigenin，LG)、异甘草素(Isoliquiritigenin,ILG)、甘草苷(Liquiritin，LN)、异甘草苷(Isoliquiritin，ILN);甘草酸(又名草甜素，Glycyrrhizic acid，GA)和甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GTA)则是萜类的代表化合物。

当前甘草黄酮类化合物的药理学大量研究显示，黄酮类化物具有抗菌、抗病毒、抗发炎、抗过敏以及抗血管舒张等作用;另外，它还能抑制脂质过氧化、血小板凝聚、毛细管渗透性以及脆性;黄酮类化合物的此类效果都与它的抗氧化性相关。甘草属植物中的黄酮类成分具有抑菌、抗真菌、抗肿瘤、抗诱变、抗病毒等广泛的药理作用。

一是抗肿瘤作用。药理学研究表明，甘草中异黄酮类物质具有植物雌激素活性，可以抑制乳腺癌细胞、前列腺癌细胞的增殖，而其他的黄酮类物质如甘草黄酮则不具有这类雌激素活性。甘草查尔酮也可抑制癌细胞的生长。也有研究显示，二甲苯并蒽（DMB）类甘草黄酮可以消除致癌物质，从而达到预防癌症的功效。我国学者马靖等报道了甘草提取物通过P53非依赖途径诱导胃癌MGC一803细胞凋亡;其作用机制是钙池排空操纵的外钙内流在甘草诱导MGC一803细胞凋亡之中发挥了决定性的作用。马靖等还报道甘草提取物除可诱导胃癌MGC一803细胞凋亡之外，还可选择性诱导肝癌HepG2、肺癌NSCLC与宫颈癌Hela等几种人肿瘤细胞凋亡。

二是抗HIV病毒。日本人奥田拓男教授与宫本宽治助教报道，甘草中有3种黄酮成分对艾滋病病毒的增殖抑制能力为甘草甜素的25倍。现代药理研究表明，甘草素与异甘草素的抗HIV病毒的能力更高，引起国内外广泛注意。甘草吡喃香豆素等多种甘草黄酮类成分可抑制HIV诱导的巨细胞形成，未见细胞毒性；甘草查尔酮A在浓度为20mg·L^-1时，能抑制HIV诱导的巨细胞形成。

三是抗病原微生物作用。甘草黄酮类化合物中抗菌成分较多，作用较强。甘草根中最常见的单体成分甘草苷、甘草素、异甘草苷和异甘草素对新城艾滋病毒有抑制作用。另外，甘草黄酮还有抗心率失常作用;最近，我国学者胡小鹰等研究结果表明，甘草总黄酮具有抗心率失常作用。

四是抗氧化作用。甘草中黄酮类成分普遍具有抗氧化活性，可以作为自由基清除剂。甘草黄酮类物质可以防止低密度脂蛋白(LDL)发生脂质过氧化反应，降低病人血浆中的低密度脂蛋白被氧化的易感系数，提高血浆中低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝集、抗滞留的能力，可以用来治疗各种由于血脂高、脂质氧化所引起的疾病。甘草查尔酮B、D强烈地抑制过氧化阴离子，并显示了对DPPH自由基的清除活性。甘草黄酮类化合物中的查尔酮和二氢黄酮，均为含有酚羟基的化合物，其对脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）的生成具有明显抑制作用，对超氧阴离子自由基和羟自由基有明显的清除作用。甘草总黄酮对Fenton反应生成的羟自由基具有较强的直接清除作用，效果明显优于甘露醇，其清除羟自由基的IC50是甘露醇的1/255，其抑制羟自由基生成的IC50是甘露醇的1/139。

五是保肝作用。甘草黄酮可缓解CCl4引起的小鼠血清中血清谷丙转氨酶(GPT)及乳酸脱氢酶(LDH)活性的增高。CCl4经肝微粒体酶细胞色素P450激活后生成·CCl3；CCl3可攻击肝细胞膜上磷脂分子，引起脂质过氧化或与肝微粒体脂质和蛋白质发生共价结合，损伤肝细胞膜结构与功能的完整性，从而使胞浆内可溶性酶渗入血液中。甘草黄酮可能由于保护了CCl4所致的肝细胞损伤，减少了GPT及LDH渗入血液，从而降低CCl4中毒小鼠血清GPT及LDH活性。研究表明甘草黄酮可以明显抑制小鼠肝脏MDA增高和还原性谷胱甘肽的耗竭，其作用呈一定的量效关系，电镜检验表明甘草黄酮可保护乙醇所致的肝细胞超微结构的损伤；并且能抑制肝组织脂质过氧化、提高小鼠肝脏SOD活性，减少肝组织脂褐素形成，这一作用与甘草黄酮清除由酒精激活产生的氧自由基有关。

目前，甘草有效成分提取纯化技术已见成熟。黄酮类化合物种类很多，多数以甙元的形式存在，少数以游离形式存在。一般情况下，游离的黄酮类化合物难溶于水，而黄酮甙易溶于热水，两者都能溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。易溶水的要由带糖苷键的黄酮苷类及花色苷组成，而溶于乙醇的要在黄酮苷元类化合物。甘草中黄酮类物质主要以甙类的形式存在，其中主要是糖甙形式。游离甙元含量较低，故甘草黄酮即可用热水提取，亦可用醇提取。目前用于甘草黄酮的提取方法主要有溶剂浸提法、碱提酸析法、酶辅助提取法、超声波辅助法、微波提取法、超临界流体萃取法等，以及多种方法的复合提取法。

有关于单一提取甘草中的甘草酸或甘草黄酮、甘草多糖成分的方法专利较多，如专利CN1450081A、1210865A、1070197A、1524870A、85104970A、101759757A等用于制备甘草酸或其盐的方法；专利CN102050851A、01518542A、101289480A、102010313A、1827613A等用于制备黄酮类成分的一种或总黄酮的方法；专利CN1343729A、101492510A、101525391A 等用于制备甘草多糖的方法。有关甘草黄酮类提取方面已在国内外进行了深入的研究，如新疆维吾尔自治区中药民族药研究所前期已有获得授权专利CN102204950B，提供从甘草废渣中提取黄酮类物质的方法，CN101073595B专利提供了甘草黄酮和总皂苷提取物及其制备方法，可见甘草黄酮类提取物、化合物及相应的提取制备方法国内外已有大量报道。

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC) 发生于结肠部位，是一种原因不明的慢性非特异性自身免疫性疾病，与遗传、免疫、感染、环境等多种因素有关，其主要症状为腹泻、粘液脓血便、腹痛和里急后重等，主要病理特点为结肠粘膜慢性炎症及溃疡形成。其病理改变为弥漫的组织反应，包括溃疡形成、隐窝脓肿、小血管炎症、杯状细胞减少以及各种类型炎细胞浸润等非特异性表现。病程迁延不愈长达十几年，甚至几十年并有癌变的可能。溃疡性结肠炎在欧美国家的发病率很高，在我国的发病率也呈逐年增高的趋势。溃疡性结肠炎的病因及发病机理至今尚不清楚。近年来在感染因子的作用、遗传易感性的影响和免疫调节异常等方面的研究均有一定进展。肠道感染可能作为始动因子破坏粘膜屏障，使固有膜内粘膜相关淋巴组织暴露。肠腔内抗原物质可能作为恒定的刺激引起免疫反应性炎症。近年来随着生活水平的提高、饮食结构及生活方式的改变，UC 在我国的发病率有逐年上升的趋势。由于UC 病程长，病变范围广，严重影响患者生活质量，且长期患者中有5 - 10％发生癌变，临床上至今尚无有效的治疗措施，被世界卫生组织列为现代难治病之一。

目前对溃疡性结肠炎传统内科治疗常规药物有三类：氨基水杨酸类、类固醇糖皮质激素及免疫抑制剂，这些药物效果都不够理想，且副作用较大。柳氮磺胺吡啶是目前临床最常用的药物，适用于轻、中度及慢性UC 患者，一般用法为口服，4g/d，服后大部分在小肠不吸收，而被大肠菌群代谢成磺胺吡啶(SP) 与5-氨基水杨酸(5-ASA)，后者可通过干扰炎症递质- 前列腺素的合成而发挥对UC的治疗作用。柳氮磺胺吡啶治疗UC的有效率较低，服药4g/d以内，有效率不及50％，但副作用可达37.5％，且复发率为33％。该药疗效及副作用与用量成正比，约有10-15％患者因皮疹、胃肠不适等副作用而停药；免疫抑制剂主要有氨甲蝶呤、硫唑嘌呤等，该类药物因毒性较大而限制了其应用。治疗最新的进展包括新合成的化合物、药物的结肠靶向制剂和生物学疗法。生物学疗法如应用肿瘤坏死因子TNF-α 抗体、干扰素、细胞粘附分子抑制剂等，然其或长期应用副作用大，或效果不肯定，或价格昂贵而限制其临床应用。因此，研制新的安全、有效的治疗药物有着重要意义。我国传统的中药历经数千年临床，为寻找有效药物提供了丰富的药源，因此从传统中草药中筛选治疗溃疡性结肠炎的药物是可行的，通过应用甘草黄酮类提取物应用制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用具有重要的意义。

现有技术中，利用甘草在制备治疗各类疾病药物中的应用基本上都利用甘草与其他中草药配伍组分，以期达到解决治疗各类疾病的用途，未见利用甘草黄酮类化合物、提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用的报道，本发明以治疗溃疡性结肠炎活性为指导进行了甘草黄酮类提取物的应用研究，经检索尚未有文献报道该方面的研究。本发明所述甘草黄酮类提取物既可以从甘草中提取，又可以从甘草渣中提取得到，可以用于治疗溃疡性结肠炎药物的开发和应用。

发明内容

针对目前国内外有关未见利用甘草黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用的报道，本发明以治疗溃疡性结肠炎活性为指导进行了甘草黄酮类提取物的应用研究，旨在提供甘草黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中应用的技术方案，用于治疗溃疡性结肠炎药物的开发和应用具有广泛的应用价值。

本发明采用的技术方案：

鉴于甘草富含黄酮类成分，特别是甘草药材水提甘草酸后剩余残渣富含大量的脂溶性黄酮类提取物现实情况，为了更深入、全面的开发利用甘草资源以及富含黄酮的甘草废渣资源，本发明通过利用甘草黄酮类提取物在用于治疗溃疡性结肠炎药物方面的新应用，获得良好的应用前景和显著的技术效果，甘草黄酮类提取物相比阳性对照药物柳氮磺吡啶对乙酸致小鼠溃疡性结肠炎表现出更好的治疗作用，以期在制备治疗溃疡性结肠炎药物中具有现实的价值，有利于资源高效利用，变废为宝，创造新的价值。

本发明提供了一种甘草黄酮类提取物在治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。从甘草或甘草渣中提取得到黄酮类提取物，主要是甘草脂溶性黄酮类提取物，通过动物实验验证了其药理作用，在制备治疗溃疡性结肠炎疾病药物得到良好的应用效果。

本发明建立了乙酸致小鼠溃疡性结肠炎模型，通过动物实验验证了甘草黄酮类提取物具有治疗溃疡性结肠炎的显著治疗作用。通过试验研究表明，甘草黄酮高剂量组脾脏重量系数极显著升高（P<0.001），中剂量组显著升高（P<0.05），表明甘草黄酮可增加脾脏免疫器官重量，提示甘草黄酮可促进乙酸所致溃疡性结肠炎小鼠免疫功能的增强；甘草黄酮三个剂量组小鼠结肠重量系数均有极显著降低（P<0.001），表明甘草黄酮对乙酸所致结肠炎症性水肿具有良好的对抗作用，阳性药柳氮磺吡啶也能极显著降低结肠湿重系数；甘草黄酮中、高剂量均能极其显著地缓解结肠溃疡情况（P<0.001），且高剂量组效果最好，阳性药SASP也能显著缓解结肠溃疡情况；甘草黄酮高剂量能极显著减少结肠溃疡面积（P<0.001），中剂量能显著减少结肠溃疡面积（P<0.05），阳性药无统计学意义。总体而言，甘草黄酮类提取物具有治疗溃疡性结肠炎的显著治疗作用。

本发明甘草黄酮类提取物采用的工艺采用将甘草或甘草渣经粉碎、浸提、大孔树脂柱吸附洗脱、抽滤、合并滤液、减压蒸馏、真空干燥，获得总黄酮类化合物或黄酮类提取物；大孔树脂纯化部分也可根据实际采用原料或者提取情况采用水洗或酸沉等方式得到目标产物。

本发明还提出了所述甘草黄酮类提取物的制备工艺，可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备：(1) 溶剂提取法；(2) 溶剂萃取法；(3) 大孔吸附树脂法；(4) 铅盐沉淀法；(5) 超临界流体萃取法；(6) 柱色谱法；(7) 液-液逆流分配色谱法；（8）酸沉淀法；（9）水洗除杂。其中优选的方法为大孔吸附树脂法与聚酰胺柱色谱法联用的方法。

在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤：

(1) 提取：所用溶剂可以醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂与水按一定比例组合成的溶液，或由这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或由这些溶剂与水、酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂；提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、高压提取等。

优选的提取工艺为：甘草药材加50%-95％乙醇，回流提取2-3 次，每次提取1-3 小时，溶剂用量为5-20 倍量(L/kg)。

(2) 过滤：包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任意一种澄清剂或其组合：水、酸，醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101 果汁澄清剂、ZTC+1 天然澄清剂等。

(3) 浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等。

(4) 干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

本发明中，采用的醇提后采用树脂纯化或者直接酸沉，酸沉时不使用碳酸钠溶液溶解除杂。

本发明中，在采用溶剂萃取法进行制备时，一般先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂如石油醚、乙醚、己烷、汽油等萃取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得甘草黄酮类提取物。

本发明采用以柚皮苷为对照，利用黄酮类物质在碱性条件下的转化和在波长415nm处有较大稳定吸收，测定其吸光度值，对照柚皮苷标准曲线，测得总黄酮的含量。

本发明采用急性溃疡性结肠炎的小鼠乙酸性结肠炎模型进行了动物实验，证实了本发明甘草黄酮提取物可使溃疡性结肠炎小鼠体重恢复；增加脾脏免疫器官重量，促进乙酸所致溃疡性结肠炎小鼠免疫功能增强；降低小鼠结肠重量系数，对乙酸所致结肠炎症性水肿具有良好的对抗作用；极其显著地缓解结肠溃疡情况；极显著减少结肠溃疡面积。高剂量组甘草黄酮类提取物相比阳性对照药物柳氮磺吡啶对乙酸致小鼠溃疡性结肠炎表现出更好的治疗作用。由此说明甘草黄酮提取物具有确切的治疗溃疡性结肠炎的作用，因此可以用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。

现有技术中，尽管有文献报道甘草中具有抗溃疡作用的黄酮单体主要为甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素等。本发明所述甘草黄酮类提取物是脂溶性黄酮类成分，现有技术文献尚未有见到甘草中该类成分抗溃疡活性的报道。并且，本发明通过HPLC成分分析表明，采用本发明提供的技术方案中所述甘草黄酮类提取物中已经检测不到甘草苷、异甘草素、甘草素等甘草中常见且含量较高的黄酮类化合物，而且甘草苷、异甘草苷、异甘草素都是可溶于水的，这与本发明所述脂溶性黄酮类不同。因此，本发明所述甘草黄酮类提取物是不同于已有现有技术文献报道的黄酮类化合物在溃疡性结肠炎药物中的应用。

现有技术中，有记载李仁等人从提取甘草膏剩下的药渣中得到富黄酮组分，制备的药物为安胃疡胶囊，主治胃及十二指肠球部溃疡。本领域熟知，胃肠道疾病种类众多，复杂的内外因共同导致多种类的胃肠道疾病的发生，且溃疡性结肠炎发病原因及机理等各方面都不同于胃溃疡及十二指肠球部溃疡：胃酸-胃蛋白酶的侵袭作用增强和或胃粘膜防护机制的削弱是胃溃疡及十二指肠球部溃疡的根本环节，而溃疡性结肠炎发病主要与免疫调节紊乱、遗传易感性、感染、环境及精神因素等有关，所以本发明提供的技术方案中所述甘草黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，现有技术未能也不可能带来启发和启示，进而不需要经过创造性劳动即可获得本发明提供的技术方案。

现有技术普通技术人员熟知，来源于甘草叶的富黄酮组分是较为完全的提取出了甘草中的黄酮，若不包括去除极性大的成分的步骤，则其应包含比较完整的甘草中黄酮类物质，主要包含甘草苷、甘草素、异甘草苷等可溶解于水的黄酮成分。而本发明提供的技术方案中所述甘草黄酮类提取物来源于甘草则需经过除杂和精制去除极性偏大的黄酮类成分，最终提取物是以脂溶性黄酮为主，而甘草苷、异甘草苷、异甘草素等可溶解于水的黄酮成分则在除杂、精制过程中已经去除，这也是本发明所述优先选择从甘草废渣中得到甘草黄酮类提取物的原因。

同时，本发明提供的技术方案中所述甘草黄酮类提取物也可以甘草废渣为原料进行制备，甘草废渣是水提取甘草酸或浸膏等残留的残渣，这一过程同时也会提取出水溶性黄酮，那么残留在渣中的黄酮类成分则是极性较低的脂溶性黄酮，这一点本发明也通过具体成分分析实验证明了，本发明提供的技术方案中所述黄酮从原料上就不含有现有技术报道的甘草苷、异甘草素等已知抗溃疡活性成分。可见，本发明提供的技术方案中所述甘草黄酮类提取物不同于该富黄酮组分。而且，该富黄酮组分所具备的抑制胃酸分泌过多作用也与本发明所述溃疡性结肠炎发病无直接相关，现有技术中报道的采用FM₁₀₀是除去甘草甜素的富黄酮类成分，文献也指出FM₁₀₀抗溃疡作用的主要成分有甘草苷、甘草素、异甘草苷等，与本发明所述甘草提取物为脂溶性黄酮完全不同。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

（1）本发明首次发现了甘草中黄酮类物质可以应用于治疗溃疡性结肠炎药物，丰富了甘草黄酮类物质的应用领域。甘草黄酮类提取物相比阳性对照药物柳氮磺吡啶对乙酸致小鼠溃疡性结肠炎表现出更好的治疗作用，以期在制备治疗溃疡性结肠炎药物中具有现实的价值，该甘草黄酮类提取物既可以从甘草中提取获得，也可以从提取过甘草酸残留的渣中提取获得，不仅能够更充分的利用甘草资源，而且还有利于将甘草废渣资源开发利用起来，变废为宝，有利于资源高效利用，变废为宝，创造新的价值。

（2）本发明通过甘草黄酮类提取物相比阳性对照药物柳氮磺吡啶（SASP）对乙酸致小鼠溃疡性结肠炎表现出更好的治疗作用：中、高剂量组小鼠体重恢复明显优于SASP，且SASP在刚开始给药的时候对小鼠具有一定的副作用，体重较其它组较低。高剂量组脾脏重量系数极显著升高（3.62±0.335 mg/g ，P<0.001），中剂量组显著升高（3.11±0.586 mg/g ，P<0.05），而SASP对脾脏重量系数的影响没有统计学意义（2.78±0.396 mg/g）；同SASP一样，甘草黄酮三个剂量组小鼠结肠重量系数均有极显著降低（P<0.001）；中、高剂量均能极其显著地缓解结肠溃疡情况（分别为2.21±0.878、1.88±1.094，P<0.001），均优于SASP；甘草黄酮高剂量能极显著减少结肠溃疡面积（25.14±4.11%，P<0.001），中剂量能显著减少结肠溃疡面积（38.46±11.32%，P<0.05）。甘草黄酮类提取物相比阳性对照药物SASP对乙酸致小鼠溃疡性结肠炎表现出更好的治疗作用，甘草黄酮类提取物中甘草脂溶性黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎疾病药物得到良好的应用效果，甘草类黄酮提取物中的查耳酮类物质对于治疗溃疡性结肠炎疗效明显显著。可见，甘草黄酮类提取物对治疗溃疡性结肠炎具有显著治疗作用。

附图说明

图1显示为柚皮苷标准曲线图。

图2显示为实验期间小鼠每日体重变化图。

图3显示为甘草黄酮对脾脏重量系数的影响图。图中，#P<0.05，##P<0.01 and ###P<0.001 vs. normal control; *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001 vs. acetic acid colitis control。

图4显示为甘草黄酮对结肠湿重的影响图。图中，#P<0.05，##P<0.01 and ###P<0.001 vs. normal control; *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001 vs. acetic acid colitis control。

图5 显示为甘草黄酮对结肠大体形态的影响图。图中，#P<0.05，##P<0.01 and ###P<0.001 vs. normal control; *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001 vs. acetic acid colitis control。

图6显示为各组结肠溃疡情况对比图。图中，A:对照；B:结肠炎模型；C:阳性药SASP(600mg/kg)；D:甘草黄酮低剂量组(100mg/kg)；E:甘草黄酮中剂量组(200mg/kg)；F:甘草黄酮高剂量组(400mg/kg)。

图7显示为甘草黄酮对溃疡面积的影响图。图中，#P<0.05，##P<0.01 and ###P<0.001 vs. normal control; *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001 vs. acetic acid colitis control。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指质量百分比。

主要仪器：回流提取器、旋转蒸发仪、大孔树脂柱、真空干燥箱、冷冻干燥仪、动物天平等。

主要原辅材料：本发明所述原料甘草，来源于豆科植物乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fish.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）、或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根茎。作为提取甘草黄酮的原材料，可以是市售甘草饮片，也可以是这些植物的茎、叶、花穗、果实、地下根茎及根等任一部位或全部植株，其中优选的药材部位为干燥根及根茎。上述所述的甘草包括未经任何炮制处理的原药材及饮片，还包括各种炮制品，如“蜜炙甘草”等各类甘草生产加工的原辅料成品半成品、废渣废料都行。本发明所述甘草废渣为提取过甘草酸、甘草膏等的残留的废渣。这种甘草废渣富含脂溶性黄酮类化合物。

本发明中选用的所有试剂、仪器及原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：甘草黄酮类提取物的制备

（1）甘草渣8kg加15倍量80%乙醇溶液80℃提取3次，每次1.5h，合并3次提取液，80℃减压浓缩回收乙醇，60℃干燥后粉碎，得到提取物。

（2）总黄酮含量34%。

实施例二：甘草黄酮类提取物的制备

（1）甘草渣8kg加15倍量90%乙醇溶液，浸泡30min，85℃提取2次，每次1.5h，合并提取液，静置取澄清液，85℃减压回收乙醇，得到水悬液。

（2）水悬液加盐酸溶液调整pH至3，静置沉淀2h，取沉淀物干燥。

（3）总黄酮含量44%。

实施例三：甘草黄酮类提取物的制备

（1）甘草粉碎，取8kg加60%乙醇溶液（15、10、10倍量）提取85℃3次，每次2h，85℃减压回收乙醇至无醇，水溶液10-20℃静置沉淀，取沉淀物，冷水洗，干燥不溶物。

（2）总黄酮含量28%。

实施例四：甘草黄酮类提取物的制备

（1）甘草粉碎成小块，取10kg加20倍量70%乙醇溶液85℃提取2次，每次2h，85℃减压回收乙醇，得到醇浓度35%的提取液。

（2）提取液过大孔树脂柱，上样流速流速1-2Bv/h，50%乙醇溶液洗脱除杂，5Bv80%乙醇溶液洗脱，洗脱流速1-3Bv/h，收集洗脱液，85℃减压回收乙醇，甘草乙醇提取物。

（3）总黄酮含量55%。

实施例五：甘草黄酮类提取物的制备

（1）甘草渣10kg80%乙醇溶液85℃提取2次（20、15倍量），每次2h，加水至醇浓度35%，得上样液。

（2）过大孔树脂柱，上样流速流速1-2Bv/h，80%乙醇溶液洗脱，洗脱流速1-3Bv/h，收集洗脱液，85℃减压回收乙醇，85℃干燥得到提取物。

（3）总黄酮含量80%。

实施例六：甘草黄酮类提取物的测定

1.1 对照品配制：称取柚皮苷10mg，10ml甲醇溶解，制成1mg/ml的溶液。

1.2 UV法测定总黄酮含量：分别取对照品溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3ml于50ml容量瓶中，分别加入5ml甲醇，再加2.5ml10%KOH溶液显色5min，甲醇定容。空白：分别取对照品溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3ml，于50ml容量瓶中用甲醇定容。在415nm处测定吸光度，以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线。

标准方程为：Y=0.0234X+0.0015，R=0.9996，X：溶液吸光度，Y：溶液浓度。见表1。

表1：柚皮苷标准吸光度测定

柚皮苷标准液浓度(mg/mL)	吸光度值
		0.004	0.1123
0.006	0.1916
		0.008	0.2732
0.01	0.3649
		0.012	0.4522

1.3样品含量测定：取甘草黄酮类提取物适量，加甲醇溶解并定容至50ml，过滤，取续滤液UV测定总黄酮含量。吸取样品0.25ml按照标准品测定方法，测定吸光度，依回归方程计算含量。参见附图1。

实施例七：甘草黄酮类提取物对溃疡性结肠炎治疗作用

将小鼠适应性喂养3d后，按下表2随机分为6组：

表2：小鼠适应性喂养对照给药方案

组别	动物数（只）	给药方案
			空白组	12	灌胃纯净水，0.2ml/10g
模型组	12	灌胃纯净水，0.2ml/10g
			阳性对照组（柳氮磺吡啶，SASP）	12	灌胃3% SASP，0.2ml/10g（600mg/kg）
实验低剂量组	12	灌胃0.5%甘草黄酮，0.2ml/10g（100mg/kg）
			实验中剂量组	12	灌胃1%甘草黄酮，0.2ml/10g（200mg/kg）
实验高剂量组	12	灌胃2%甘草黄酮，0.2ml/10g（400mg/kg）

连续给药10d。在开始给药后的第8d禁食不禁水36h，禁食期间动物饮水为5%葡萄糖溶液，第10d乙酸造模，第11d解剖取材。 

造模方法：小鼠禁食36h后开始造模。经肛门插入直径1mm灌胃针，插入深度4cm。注入2.5%的乙酸（生理盐水配制）0.25ml（空白组注入等体积生理盐水），20s后再注入1ml生理盐水冲洗。

检测指标：

1.1体重：实验开始即每日称取动物体重。

1.2脾脏重量系数：实验结束，处死小鼠，迅速剖取各组小鼠脾脏，称重，以脾脏重量（mg）/体重（g）作为脾脏重量系数。

1.3结肠湿重：实验结束，处死小鼠迅速剖取结肠，沿肠系膜纵向剪开肠腔，用生理盐水冲洗干净，称重，以结肠重量（mg）/结肠长度（cm）定义为结肠湿重系数。

1.4结肠大体形态损伤指数：结肠大体形态损伤评分标准如下：

结肠大体形态损伤参照Millar et al的评分标准进行评价，并作适当修改，评分标准如下：

计分 病理改变

0 无损伤。

1 结肠粘膜出现红斑。

2 轻度粘膜水肿，出血或出现小处溃疡。

3 中度粘膜水肿，出血性溃疡或糜烂。

4 严重的溃疡、糜烂和水肿，但是没有组织坏死，与周围脏器没有粘连。

5严重的溃疡、糜烂和水肿，并且组织坏死，与周围脏器粘连严重。

1.5溃疡面积计算：以2cm结肠溃疡面积所占2cm结肠面积的比率为溃疡面积比（%）。选取2cm结肠，用方格纸描绘出结肠溃疡位置以及2cm结肠的轮廓，通过方格的计数计算得到溃疡面积比。

1.6 统计学处理  实验结果以                                                ±s 表示，采用GraphPad Prism 5. 0 软件处理。

实验结果：具体参见附图2至附图7。

小鼠体重： 第9d体重下降明显是因为禁食36h。造模后给予饲料，小鼠体重有所恢复。阳性药组在刚开始给药的时候对小鼠具有一定的副作用，体重较其它组较低，但随着给药时间增加与其他组无明显差别。造模后空白组小鼠体重恢复情况最好，其次是高剂量组。

1.7脾脏重量系数

结果如表3、附图2：

表3 ：甘草类黄酮提取物对脾脏重量系数的影响

组别	动物数（只）	剂量（mg/kg）	脾脏重量系数(mg/g)
				空白组	12	—	3.61±0.261
模型组	12	—	2.39±0.443###
				SASP组	12	600	2.78±0.396
低剂量组	12	100	2.92±0.545
				中剂量组	12	200	3.11±0.586*
高剂量组	12	400	3.62±0.335***

由表3和附图2，与正常对照组比较，模型对照组小鼠脾脏重量系数极其显著降低（P<0.001），表明乙酸所致溃疡性结肠炎病理状态下小鼠脾脏重量下降；与模型对照组比较，甘草黄酮高剂量组脾脏重量系数极显著升高（P<0.001），中剂量组显著升高（P<0.05），表明甘草黄酮可增加脾脏免疫器官重量，提示甘草黄酮可促进乙酸所致溃疡性结肠炎小鼠免疫功能的增强。

1.8结肠湿重：结果如表4、附图3：

表4： 甘草类黄酮提取物对结肠湿重的影响

组别	动物数（只）	剂量（mg/kg）	结肠湿重(mg/cm)
				空白组	12	—	28.03±1.598
模型组	12	—	43.14±3.280###
				SASP组	12	600	33.79±2.729***
低剂量组	12	100	34.64±3.282***
				中剂量组	12	200	34.76±2.732***
高剂量组	12	400	33.15±3.129***

结肠炎会使小鼠的结肠发生萎缩，长度缩短，但由于炎症导致结肠重量增加。由表4和附图3可知，与正常组比较，模型对照组小鼠结肠重量系数极显著增大（P<0.001）表明乙酸可引起结肠组织严重水肿和炎症；与模型对照组比较，甘草黄酮三个剂量组小鼠结肠重量系数均有极显著降低（P<0.001），表明甘草黄酮对乙酸所致结肠炎症性水肿具有良好的对抗作用。阳性药柳氮磺吡啶也能极显著降低结肠湿重系数。

1.9结肠大体形态损伤指数

依据评分标准对各组结肠溃疡情况进行评分，评分结果如表5、附图5，各组结肠溃疡情况对比如附图5。

表5 ：甘草类黄酮提取物对结肠大体形态的影响

组别	动物数（只）	剂量（mg/kg）	结肠大体形态评分
				空白组	12	—	0±0
模型组	12	—	4.09±0.496###
				SASP组	12	600	3.07±1.006*
低剂量组	12	100	3.58±0.889
				中剂量组	12	200	2.21±0.878***
高剂量组	12	400	1.88±1.094***

结肠大体形态评分越高，表明结肠溃疡情况越严重。由表5和附图5知，与模型对照组相比，甘草类黄酮提取物中、高剂量均能极其显著地缓解结肠溃疡情况（P<0.001），且高剂量组效果最好，阳性药SASP也能显著缓解结肠溃疡情况。各组的结肠溃疡情况对比如附图6：

从附图6可以看出，模型对照组管壁增厚明显，部分肠管壁浆膜与周围肠管及脏器有粘连，溃疡表面有炎性渗出物及坏死组织，溃疡旁粘膜明显充血、水肿、溃疡等病理改变。空白对照组小鼠结肠粘膜表面光滑，粘膜皱襞清晰完整、厚薄适中。结肠组织无充血、水肿、溃疡等比例改变。甘草类黄酮提取物高剂量组能明显缓解结肠溃疡情况。

1.10溃疡面积计算

   结果如表6 、附图7：

表6： 甘草类黄酮提取物对溃疡面积的影响

组别	动物数（只）	剂量（mg/kg）	溃疡面积(%)
				空白组	12	—	0±0
模型组	12	—	48.85±8.149###
				SASP组	12	600	43.00±12.23
低剂量组	12	100	48.16±10.45
				中剂量组	12	200	38.46±11.32*
高剂量组	12	400	25.14±4.11***

由表6和附图7知，与模型对照组相比，甘草类黄酮提取物高剂量能极显著减少结肠溃疡面积（P<0.001），中剂量能显著减少结肠溃疡面积（P<0.05）。阳性药无统计学意义，此说明甘草黄酮类提取物作用优于阳性药。

实施例八：甘草黄酮类提取物对溃疡性结肠炎治疗作用

    2，4,6-三硝基苯磺酸造模3d给药，以1%甘草黄酮，0.2ml/10g（200mg/kg）剂量灌胃小鼠7d，观察不同类型的甘草黄酮对髓过氧化物酶（MPO）活力和结肠粘膜病理损害的影响。

表7 ：甘草黄酮对小鼠MPO活力和结肠粘膜病理损害的影响

组别	动物数（只）	MPO活性测试（U/g）	镜检评分平均偏差
				空白组	10	0.2270±0.0776	0.51533±0.21744
模型组	10	1.0170±0.3606	0.60000±0.43718
				甘草总黄酮组	10	0.6662±0.5289**	0.21040±0.23314
甘草脂溶黄酮组	10	0.5943±0.2011**	0.37004±0.30469
				甘草查耳酮组	10	0.3437±0.1324**	0.59993±0.31722*

模型组小鼠结肠MPO明显升高，3个黄酮给药组小鼠MPO则明显低于模型组（P＜0.01）。模型组镜下可见溃疡，病变主要在粘膜下层，组织水肿明显及大量炎性细胞浸润。甘草总黄酮组也可见溃疡，有较明显的组织水肿和炎细胞浸润，而甘草查耳酮组溃疡已较少，炎细胞浸润也少，对结肠粘膜病理损害的影响具有统计学意义（P＜0.05）。

实施例九：甘草黄酮类提取物对溃疡性结肠炎治疗作用

以1%甘草黄酮，0.2ml/10g（200mg/kg）剂量灌胃小鼠10d后造模，观察不同类型的甘草黄酮对小鼠腹泻的影响。

评分标准：0分，正常粪便；1分，软粪便；2分，无定形软便；3分，水样或脓样便。

表8 ：甘草黄酮对小鼠腹泻的影响

组别	动物数（只）	腹泻评价分值
			空白组	10	0±0
模型组	10	1.8±0.6#
			甘草总黄酮组	10	1.4±0.7
甘草脂溶黄酮组	10	1.3±0.5*
			甘草查耳酮组	10	1.0±0.6**

小鼠腹泻症状多为软便或无定形粪便，也可见水样粪便和脓血样粪便。依据小鼠腹泻症状评分，见表8，甘草总黄酮、甘草脂溶黄酮和甘草查耳酮组均可改善腹泻症状，但是只有甘草脂溶黄铜组（P＜0.05）和甘草查耳酮组（P＜0.01）具有统计学意义。

试验结果显示，甘草类黄酮提取物中脂溶性黄酮类提取物对于制备治疗溃疡性结肠炎疾病药物得到效果更好，同时，也显示甘草类黄酮提取物中的查耳酮类物质对于治疗溃疡性结肠炎疗效明显显著。

结论：甘草黄酮类提取物中、高剂量组小鼠体重恢复明显优于SASP，且SASP在刚开始给药的时候对小鼠具有一定的副作用，体重较其它组较低。高剂量组脾脏重量系数极显著升高（P<0.001），中剂量组显著升高（P<0.05），而SASP对脾脏重量系数的影响没有统计学意义；低、中、高三个剂量同SASP一样组小鼠结肠重量系数均有极显著降低（P<0.001）；中、高剂量均能极其显著地缓解结肠溃疡情况（P<0.001），均优于SASP；甘草黄酮高剂量能极显著减少结肠溃疡面积（P<0.001），中剂量能显著减少结肠溃疡面积（P<0.05），而SASP无统计学意义。综上，甘草黄酮类提取物相比阳性对照药物SASP对乙酸致小鼠溃疡性结肠炎表现出更好的治疗作用，甘草黄酮类提取物中甘草脂溶性黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎疾病药物得到良好的应用效果，甘草类黄酮提取物中的查耳酮类物质对于治疗溃疡性结肠炎疗效明显显著。

Claims (4)

1.一种甘草黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

2.如权利要求1所述的甘草黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述的甘草黄酮类提取物中甘草脂溶性黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎疾病药物中的应用。

3.如权利要求1或2任意一项所述的甘草黄酮类提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述的甘草类黄酮提取物中的查耳酮类物质在制备治疗溃疡性结肠炎疾病药物中的应用。

4.如权利要求1、2或3任意一项所述的甘草黄酮类提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：

 (1) 提取：甘草药材加50%-95％乙醇，回流提取2-3 次，每次提取1-3 小时，溶剂用量为5-20 倍量(L/kg)；

(2) 过滤：包括离心、抽滤、超滤、压滤，使用或不使用以下任意一种澄清剂或其组合：水、酸、醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101 果汁澄清剂、ZTC+1 天然澄清剂；

(3) 浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩；

(4) 干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥。