CN102988765A - 白及乙酸乙酯提取物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了白及乙酸乙酯提取物在制备抗菌药物中的用途。白及乙酸乙酯提取物对各种革兰氏阴性菌、阳性菌以及耐药菌均有良好的抑制作用，能够有效保护细菌感染个体，其药效活性与抗生素相当，尤其是该提取物还可以有效对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，为临床用药提供了更好的选择。

Description

白及乙酸乙酯提取物的用途

技术领域

本发明涉及白及乙酸乙酯提取物的新用途。

背景技术

感染类疾病，一直被视为极其凶险的疾病，直至Alexander Fleming于1928年偶然发现青霉素并用于临床后，人类与感染性疾病的斗争才有了一个重大突破。然而随着抗生素的广泛使用，滥用抗生素的危害远远超出人们的想象：英国的Jevons就首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),MRSA从发现至今感染几乎遍及全球，已成为院内感染的重要病原菌之一。研究发现，MRSA除对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药，MRSA还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性产生大量PABA等不同机制，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，即具有广谱耐药性，而万古霉素成为了攻克MRSA感染的最后一道防线。由此可见，细菌耐药性产生的速度远远超出了新药研发的速度，如果继续发展，终有一天会因为耐药性而导致现有所有抗生素无效，人们生病可能“无药可救”由此进入后抗生素时代。

正当人类面对耐药菌和机体耐药性迅速发展的严峻现实而焦头烂额之时，中医药作为新的抗菌药物脱颖而出，以其抗菌性强、毒副作用小而受到广大患者的青睐。

白及，又名甘根、白芨、白根等，为兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥块茎，主产于浙江、贵州、湖北、四川、湖南、河南、陕西等地。含有联苄类、二氢菲类、联菲类、芘类等化合物。中医认为，其性涩而收，能入肺止血，生肌治疮。研究表明，白及具有止血、抗癌、保护胃粘膜、代血浆、促进角质细胞游走的形成、促进血管内皮细胞黏附生长、抗溃疡、预防肠粘连、促进伤口愈合、免疫促进等药理作用。临床可用于上呼吸道等出血、褥疮、烧烫伤、肿瘤、肺结核、痤疮、百日咳等的治疗。

经文献检索发现，现药理研究主要集中在白及止血等效用上，抑菌活性的研究国内鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供白及乙酸乙酯提取物的新用途。

本发明提供了白及乙酸乙酯提取物在制备抗菌药物中的用途。

进一步地，所述药物是抗临床耐药菌的药物。

更进一步地，所述临床耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

进一步地，所述药物是抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的药物。

更进一步地，所述革兰氏阴性菌为支气管文血鲍特菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌或大肠埃希菌；所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、巨型球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌或表皮葡萄球菌。

其中，所述药物是治疗细菌感染性疾病的药物。

其中，所述白及乙酸乙酯提取物是由如下方法制备的：取白及，乙醇提取；醇提液回收乙醇后的浸膏，再按系统溶剂法提取，取乙酸乙酯部分，即得白及乙酸乙酯提取物。

进一步地，所述乙醇浓度为80~95%V/V。

进一步地，所述系统溶剂法中，依次用石油醚、乙酸乙酯进行提取。

其中，所述药物是以白及乙酸乙酯提取物为活性成分制备而成的口服剂、注射剂或外用制剂。

白及乙酸乙酯提取物对各种革兰氏阴性菌、阳性菌以及耐药菌均有良好的抑制作用，能够有效保护细菌感染个体，其药效活性与抗生素相当，尤其是该提取物还可以有效对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，为临床用药提供了更好的选择。

具体实施方式

本发明所述的白及乙酸乙酯提取物，按照中药化学领域中常规的系统溶剂法提取即可，具体操作可以参见下述实施例制备方法。除此之外，也可以直接按照现有文献报道的方法进行提取，如陆波等，白及不同提取部位对家兔血小板聚集的影响，解放军药学学报，2005年5期。

实施例1白及乙酸乙酯提取物的制备方法

称取白及药材250g，粉碎，加95%v/v乙醇加热回流提取两次，第一次10倍量，第二次8倍量，每次各1小时。将两次提取液合并，过滤，滤液减压回收溶剂，得粗浸膏31g。取粗浸膏，加水约250ml，超声混悬，转移至1000ml分液漏斗中，加石油醚萃取8次，每次300ml，余下的水层再用乙酸乙酯萃取10次，每次250ml，减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物8g。

实施例2白及乙酸乙酯提取物的制备方法

称取白及药材500g，粉碎，加80%v/v乙醇加热回流提取两次，第一次10倍量，第二次8倍量，每次各1小时。将两次提取液合并，过滤，滤液减压回收溶剂，得粗浸膏。取粗浸膏，干燥后，加石油醚振摇提取5次，余下的水层再用乙酸乙酯振摇提取5次，合并乙酸乙酯部位，减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物。

实施例3白及乙酸乙酯提取物的制备方法

称取白及药材100g，粉碎，加90%v/v乙醇加热回流提取两次，第一次12倍量，第二次10倍量，每次各1小时。将两次提取液合并，过滤，滤液减压回收溶剂，得粗浸膏。取粗浸膏，干燥后，加石油醚温浸3次，余下的水层再用乙酸乙酯温浸5次，合并乙酸乙酯部位，减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物。

以下通过试验例说明本发明的有益效果。

试验例1抗菌试验

1材料与仪器

1.1药物及制备

供试药物，白及，购自北京同仁堂成都分店，经成都中医药大学鉴定教研室马云桐老师鉴定为兰科植物白及Bletilla striata(Thund.)Reichb.f.的干燥块茎。白及的四个活性部位分别采取以下方法制备。

阳性药物，注射用盐酸万古霉素，规格：50万单位，浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：111204；注射用头孢噻肟钠，规格：1.0g，华北制药河北华民药业有限责任公司，批号：XF3120707；头孢克肟片，规格0.2g/片，浙江海正药业有限公司，批号120501。

造模药物：Mucin form Porcine Stomach(TypeⅡ),规格：100g，SIGMA-ALDRICH，批号：018K0079。

1.1.1乙酸乙酯部位的提取方法称取白及药材250g，粉碎，加95%v/v乙醇加热回流提取两次，第一次10倍量，第二次8倍量，每次各1小时。将两次提取液合并，过滤，滤液减压回收溶剂，得粗浸膏31g。剩余药渣备用。取粗浸膏，加水约250ml，超声混悬，转移至1000ml分液漏斗中，加石油醚萃取8次，每次300ml，减压回收石油醚。水层再用乙酸乙酯萃取10次，每次250ml，减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯部位8g（即本发明白及乙酸乙酯提取物）。剩余水层备用。

1.1.2醇提后水煎液部位取“1.1.1”中剩余的药渣，加8倍量的水（约2000ml）煎煮1小时，用纱布过滤，滤液加热至60℃，减压浓缩，得醇提后水煎液部位95g。

1.1.3正丁醇部位的提取方法取“1.1.1”中剩余的水层，加入正丁醇萃取10次，每次250ml，减压回收正丁醇，得正丁醇部位提取物7g。剩余水层备用。

1.1.4萃取后水部位取“1.1.3”中剩余的水层液，加热至60℃，减压浓缩，得萃取后水部位提取物12g。

1.2菌株

1.2.1标准菌株大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923（四川抗菌素工业研究所赠送）。

1.2.2受试菌株经VITEK-32、VITEK-60自动微生物鉴定分析仪进行鉴定，再经Biolog细菌鉴定仪（美国）及API20E、20NE、Staph系列和常规方法重新鉴定的10个种属的22株临床分离病原菌。

1.3仪器及试剂Mueller-Hinton agar(OXOID，批号：729683），营养琼脂培养基（杭州微生物试剂有限公司，批号：20100831-02），一次性无菌培养皿（江苏康健生物有限公司），Mcfarland Standard（bioMeriéux,Inc.批号：821772701）等。

2方法

2.1体外抑菌活性试验采用琼脂平板二倍稀释法分别测定白及乙酸乙酯部位、醇提后水煎液部位、萃取后水部位和正丁醇部位对11个种属26株病原菌和标准菌株的体外抑菌活性。

2.1.1含药平板制备4个不同部位分别用蒸馏水或DMSO稀释液进行倍比稀释，分别稀释成1：1、1︰2、1︰4、1︰8、1︰16、1︰32、1︰64、1︰128，1︰256共9个梯度。在一次性无菌培养皿中分别加入上述不同浓度梯度的稀释药液1ml和14ml灭菌的MH培养基，充分混匀，晾干备用。

2.1.2菌液配置：将受试菌株和药敏质控菌株用无菌生理盐水调至菌液浓度1.5×10⁶CFU/ml。

2.1.3最低抑菌浓度测定采用多点接种仪将实验菌株的菌液加入不同浓度梯度的含药平板和阳性对照平板，并以生理盐水代替菌液作阴性对照。37℃恒温培养18～24h，观察各菌株在含不同浓度梯度药物平板中的生长情况。在阴、阳性对照均成立的情况下，以培养皿中无细菌生长的最小质量浓度为试验部位对该菌的最低抑菌质量浓度（MIC）。

2.2体内抗菌活性试验

2.2.1预试验

实验菌株毒力的测定：37℃恒温培养受试耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌至对数生长期，用生理盐水稀释成不同浓度梯度的菌液。取不同浓度的菌液与10%胃膜素等量混合，按0.5ml/20g的菌液量腹腔注射小鼠，并以5%胃膜素做对照。在对照小鼠不死亡的前提下，记录小鼠14d内的死亡率，测定小鼠全部死亡的最低细菌量，即该菌液的最小致死量（MLD）。

体内有效剂量的预试：设置多个不同剂量组对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌所引起的感染模型小鼠进行腹腔注射，每组4只，1次/d，并提前2天给药，在第3天给药后0.5h攻毒，观察动物14d内的死亡情况，确定正式试验给药剂量。

2.2.2体内抗菌活性

取18～22g SPF级KM小鼠，雌雄各半，每组10只，分为注射用盐酸万古霉素组，注射用头孢噻肟钠组，头孢克肟片组，白及1、0.5、0.25、0.125g/kg组，生理盐水空白组，模型组，胃膜素对照组。均提前2天给药，1次/d，在第3天给药后0.5h攻毒，即选取含5%胃膜素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液腹腔注射。其中以生理盐水代替药物为模型组；以既不给药也不攻毒为空白组；以不给药只注射不含细菌的5%胃膜素为胃膜素对照组。观察小鼠攻毒后14d内的存活情况，统计其存活率。

3结果

3.1白及不同活性部位的体外抗菌活性采用琼脂平板二倍稀释法测定了白及4个部位对26株临床分离病原菌和标准菌株的MIC，结果见表1。

表1：白及4个部位对受试菌株的体外抑菌活性

注：“≥”表示白及提取部位在试验最大浓度时，未表现出抑菌活性。

由表1可知，白及对受试病原菌有抑菌活性。其中，醇提后水煎液和萃取后水部位在试验最大浓度时未表现出对受试菌株的抑菌活性，而正丁醇部位和乙酸乙酯部位均表现出较强的抑菌活性，其中尤以乙酸乙酯部位的抑菌活性明显，对受试菌株的最小MIC为65μg/ml。正丁醇部位除对1株支气管文血鲍特菌未表现出抑菌活性外，对其他受试菌株均表现出较强的抑菌活性，对受试菌株的最小MIC为16.667mg/ml。乙酸乙酯部位对所有受试菌株均表现出很强的抑菌活性，有广谱抑菌活性，且对“超级耐药菌”——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌亦有很好的抑菌活性。

3.2白及乙酸乙酯部位的体内抗菌活性

表2白及乙酸乙酯部位对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染模型小鼠的体内保护

ip：注射给药；ig：口服给药。

由表2可知，白及乙酸乙酯部位对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染小鼠有很强的保护作用，其中尤以腹腔注射0.5g/kg的保护力强，对小鼠的保护力达到了100%，腹腔注射0.25、0.125g/kg对小鼠的保护力亦达到90%、40%；灌胃1、0.5g/kg对小鼠的保护力达到50%、40%。

表3白及乙酸乙酯部位对大肠埃希菌感染模型小鼠的体内保护

由表3可知，白及乙酸乙酯部位对大肠埃希菌感染小鼠有很强的保护作用，其中尤以腹腔注射0.5、0.25g/kg的保护力强，保护力达到80%；灌胃1g/kg对感染小鼠的保护力达到50%。

4结论

白及在体外有广谱抑菌活性，对革兰阴性、阳性菌均有很好的抑菌活性，且对“超级耐药菌”——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也有很强的抑菌活性；对白及不同部位的抑菌活性进行比较研究发现，其中尤以乙酸乙酯部位的抑菌活性最为明显，表明乙酸乙酯部位是其主要的活性部位。

白及在体内亦有很强的抑菌活性，该实验选择革兰阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、革兰阴性菌大肠埃希菌为试验菌株，实验结果表明白及在体内亦有很强的抑菌活性。

Claims (10)

1.白及乙酸乙酯提取物在制备抗菌药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是抗临床耐药菌的药物。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述临床耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物是抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的药物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为支气管文血鲍特菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌或大肠埃希菌；所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、巨型球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌或表皮葡萄球菌。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗细菌感染性疾病的药物。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述白及乙酸乙酯提取物是由如下方法制备的：

取白及，乙醇提取；醇提液回收乙醇后的浸膏，再按系统溶剂法提取，取乙酸乙酯部分，即得白及乙酸乙酯提取物。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述乙醇浓度为80~95%V/V。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述系统溶剂法中，依次用石油醚、乙酸乙酯进行提取。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的用途，其特征在于：所述药物是以白及乙酸乙酯提取物为活性成分制备而成的口服剂、注射剂或外用制剂。