CN102531906A - 天然化合物p21在抑制肿瘤细胞生殖生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抑制肿瘤细胞生殖生长活性的天然化合物p21及其应用。天然化合物p21的结构式如式i所示。该化合物或其药学上可接受的盐可用于制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖药物或用于制备预防和/或治疗肿瘤药物。体外抗癌试验证实,化合物p21对乳腺癌细胞(mcf-7)、肺癌细胞(a549)、卵巢癌细胞(skov3)、结肠癌细胞(caco2、sw480)、非洲绿猴肾成纤维细胞(cos-7)均有较好的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及天然化合物P21在抑制肿瘤细胞生殖生长中的应用。
背景技术
肿瘤严重威胁着人类的健康,我国的肿瘤发病率和致死率均较高。目前抗肿瘤药物的研发比较滞后,还未出现一种彻底治愈肿瘤的药物。虽然我国研制出一些抗肿瘤药物但仍以进口国外的药物为主。因此,研发出具有我国自主知识产权的新型抗肿瘤药物,对于提高我国人民的生活水平具有非常重要的意义。
在特殊生境或极端环境下形成的特殊生物资源拥有特殊的基因及其表达产物,是人类的珍贵遗传资源宝库。如近年来发挥着巨大医疗作用的抗癌物质紫杉醇、治疗心血管病洛伐他汀、抗疟疾药物青蒿素等。特殊生境真菌和植物来源中功能性活性物质的开发利用,可产生丰富的自主知识产权成果,同时孕育着巨大的产业前景与经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然化合物P21及其应用。
本发明所提供的天然化合物P21,其结构式如式I所示。
本发明所提供的化合物P21是从微生物固体发酵提取物中分离得到的。再应用现代色谱,质谱和NMR等技术对该化合物进行纯化和结构解析。
化合物P21的生产菌株是地丝霉属菌株(Geomyces sp.)NJ-13,该菌株分离自南极洲土壤样品,并于2008年05月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号为CGMCC 2481。
利用菌株Geomyces sp.发酵制备化合物P21的方法,主要包括以下步骤:
a)将Geomyces sp.进行固体(稻米)发酵,得到发酵培养物;
b)向所述发酵培养产物中加入乙酸乙酯进行提取,得到提取液,将所述提取液减压蒸馏,得到粗提物;
c)将所述粗提物进行减压硅胶柱层析分离而得到活性组分溶液,将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离得到式(I)的化合物。
本发明的再一个目的是提供化合物P21的用途。
本发明所提供的化合物P21的用途为:化合物P21或其药学上可接受的盐在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖药物中的应用。
本发明还保护一种抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物,它的有效成分为化合物P21。
本发明中所述真核生物为哺乳动物。
所述肿瘤细胞为癌细胞;所述癌细胞具体可为肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或肾成纤维细胞。
本发明提供的化合物P21的用途还为:化合物P21或其药物学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤为癌;所述癌具体可为肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌。
以化合物P21或其药学上可接受的盐为有效成分制备的预防和/或治疗肿瘤的药物,也属于本发明的保护范围。
所述预防和/或治疗肿瘤药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织;或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
以化合物P21或其药学上可接受的盐为活性成分制备的抗肿瘤药物,需要的时候,在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
以化合物P21或其药学上可接受的盐制备的预防和/或治疗肿瘤药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明通过构建细胞筛选模型以鉴定该化合物是否具有抑制肿瘤发生发展的作用。构建的细胞筛选模型有乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)等,采用体外细胞增殖实验MTT法高通量筛选该化合物能够抑制何种肿瘤细胞的生殖生长,经试验发现该化合物能够较好的抑制上述肿瘤细胞的生殖生长过程,并且对该化合物呈现剂量效应即随着化合物浓度的增高对肿瘤细胞的生殖生长的抑制效果越好。
附图说明
图1为肿瘤细胞对天然化合物P21的剂量效应;乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)。
图2为天然化合物P21对肿瘤细胞的IC50值。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例中所用的菌株(Geomyces sp.)NJ-13于2008年05月07日,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC 2481。
实施例1、天然化合物P21的制备及结构鉴定
a.菌株Geomyces sp.的固体发酵
菌株Geomyces sp.的活化。PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15g,纯净水1000mL,121℃高压蒸汽灭菌30min,制成试管斜面,挑取菌丝体接种于试管斜面上,25℃培养10天。
菌株Geomyces sp.的固体发酵。稻米培养基的制备(将400g稻米和600mL纯净水等分加入5个500mL三角瓶中,浸泡过夜,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用);从试管斜面上挑取菌丝体于装有无菌水的试管中配成菌悬液,将制备好的菌悬液(孢子浓度为1×106个/mL)5mL接种于稻米培养基上,在25℃无菌培养间培养40天。
b.粗提物的提取
待发酵完毕,将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次,将有机溶剂减压蒸馏至干燥,得到11.5g粗提物。
c.粗提物的分离纯化
将粗提物用正己烷-二氯甲烷-甲醇体系进行减压硅胶柱层析,所用流动相为:正己烷∶二氯甲烷(v/v)=100∶0,80∶20,60∶40,40∶60,20∶80,0∶100;二氯甲烷∶甲醇(v/v)=400∶1,200∶1,100∶1,100∶2,100∶2,100∶3,100∶3,100∶4,100∶5,100∶6,100∶7,100∶8,100∶9,0∶100;共计20个梯度,每个梯度的洗脱体积均为400mL,按照极性由小到大的顺序将粗提物分成20个组分,在活性跟踪(测试20个组分对乳腺癌细胞(MCF-7)和肺癌细胞(A549)的抑制活性)指导下,发现在二氯甲烷∶甲醇=100∶1(v/v)作为流动相洗脱得到的组分有抑制活性,收集活性组分(2.4g)。
将活性组分通过用石油醚-乙酸乙酯体系进行减压硅胶柱层析,所用流动相为:石油醚∶乙酸乙酯(v/v)=100∶0,99∶1,97∶3,95∶5,90∶10,85∶15,80∶20,75∶25,70∶30,65∶35,60∶40,50∶50,30∶70,20∶80,0∶100;共计15个梯度,每个梯度的洗脱体积均为400mL,按照极性由小到大的顺序将粗提物分成15个组分,在活性跟踪(测试20个组分对乳腺癌细胞(MCF-7)和肺癌细胞(A549)的抑制活性)指导下,发现在石油醚∶乙酸乙酯=85∶15(v/v)作为流动相洗脱得到的组分有抑制活性,收集活性组分(85mg)。
将活性组分通过HPLC纯化而得到15mg化合物P21,其中HPLC的条件是:采用Agilent 1100型半制备高压液相色谱仪,Agilent C18反相半制备色谱柱(5μm、9.4x250mm),流速2.0mL/min,用甲醇和水作为流动相,制备条件:甲醇/水(63/37,v/v)等度洗脱10min后,63%甲醇/水至80%甲醇/水线性梯度洗脱25分钟,得到P21的保留时间tR=33.00min。
将上述方法制备的P21进行高分辨质谱(HRESIMS)、红外光谱(IR)和核磁共振谱分析,其中高分辨质谱由南京大学质谱测试中心提供测试(测试仪器型号为Bruker Esquire 3000plus),红外光谱由北京大学化学学院提供测试(测试仪器型号为Nicolet Magna-IR750),核磁共振谱由中国医学科学院药物研究所提供测试(测试仪器型号为Varian Mercury-400和Varian Mercury-500)。本发明制备的化合物P21的理化数据见表1,氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据见表2。
表1.化合物P21的物化常数
表2.化合物P21的氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据
a在500MH以CDCl3为溶剂测试。
b在100MHz以CDCl3为溶剂测试。
以上数据与发明人发表的文章“Bioactive Asterric Acid Derivatives from the Antarctic Ascomycete Fungus Geomyces sp.,Journal of Natural Products.2008,71,1643-1646”中所报道的化合物n-butyl asterrate数据相比,证实得到化合物P21即为n-butyl asterrate,其结构如下:
综上从真菌Geomyces sp.中提取并分离了天然化合物P21,经过进一步的纯化,结合高效液相色谱,质谱和核磁共振技术分析鉴定该化合物的结构特征。
实施例2、高通量筛选天然化合物P21对肿瘤细胞生殖生长的影响
构建细胞筛选模型:乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)。
采用细胞增殖实验MTT法检验化合物P21对以上7种肿瘤细胞生殖生长的影响。首先把细胞接种到96孔板,每种肿瘤细胞的接种密度不同,生长速度较快的肿瘤细胞接种的密度较低如乳腺癌细胞(MCF-7)、卵巢癌细胞(SKOV3)。另外根据天然化合物P21对各种肿瘤细胞的处理时间的不同也要适当的调整肿瘤细胞的接种密度,如处理时间较长肿瘤细胞的接种密度较低,为了验证几种肿瘤细胞对该化合物的剂量效应,每种化合物至少选择三个不同的化合物浓度进行处理肿瘤细胞,而两个处理浓度之间的梯度最好保持一致,每种处理浓度要设置三个重复。
将化合物P21用DMSO作溶剂分别配制成浓度为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM及0.0001μM的待测溶液。
具体如下:
1、将乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞悬液接种至96孔板,每孔接种200μl(5000个细胞/孔),于37℃,5%CO2的培养箱内培养24h,然后倾去各孔培养液。将化合物P21的溶液(浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM)分别加入到96孔板中MCF-7细胞的培养孔内,每个浓度接种3孔,每孔加入200μl;将其置于37℃,5%CO2的培养箱内培养72h。
2、肺癌细胞(A549)每孔接种200μl(10000个细胞/孔);加入的化合物P21溶液的浓度分别为1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM;P21对A549的处理时间为72h,其余同1。
3、卵巢癌细胞(SKOV3)每孔接种200μl(4000个细胞/孔);加入的化合物P21溶液的浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM;P21对SKOV3的处理时间为72h,其余同1。
4、结肠癌细胞(Caco2)每孔接种200μl(7500个细胞/孔);加入的化合物P21溶液的浓度分别为1μM、0.1μM、0.01μM;P21对Caco2的处理时间为72h,其余同1。
5、结肠癌细胞(SW480)每孔接种200μl(7500个细胞/孔);加入的化合物P21溶液的浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM;P21对SW480的处理时间为72h,其余同1。
6、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)每孔接种200μl(10000个细胞/孔);加入的化合物P21溶液的浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0.0001μM;P21对COS-7的处理时间为72h,其余同1。
在测定MTT值之前四个小时每孔加入20ul MTT(浓度5mg/ml)处理肿瘤细胞,四小时后洗掉肿瘤细胞培养基,每孔加入150ul的DMSO,然后低速率下震荡十分钟左右,在酶标仪490nm-630nm双波长的条件下测定MTT值(光密度OD值),按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。
本实验中的OD对照、OD实验值均为扣除掉OD空白的值。
化合物P21对上述细胞抑制作用的结果见图1。
实施例3、测定天然化合物P21对肿瘤细胞的IC50值
测定天然化合物P21对乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)的IC50值。
首先要确定天然化合物P21的六个处理浓度,每个浓度梯度之间保持一致,六个浓度分别为:0.0001、0.001、0.01、0.1、1.0、10(uM),每种浓度处理要设置三个重复。对照用DMSO处理。根据化合物的处理时间以及肿瘤细胞的生殖生长速率来调整肿瘤细胞在96孔板的接种密度(具体接种密度及处理时间同实施例2)。在测定MTT值之前四个小时每孔用20ul MTT处理肿瘤细胞,四小时后洗掉肿瘤细胞培养基,每孔加入150ul的DMSO,然后低速率下震荡十分钟左右在酶标仪490nm-630nm双波长的条件下测定MTT值(光密度OD值),按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。根据得到的化合物各个处理浓度的MTT值,采用IC50值的计算公式得到化合物对肿瘤细胞的IC50值。结果见图2。
计算IC50值计算公式:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率 。
Claims (9)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述真核生物为哺乳动物;所述肿瘤细胞为癌细胞;所述癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或肾成纤维细胞。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述肺癌细胞为肺癌细胞A549,所述乳腺癌细胞为乳腺癌细胞MCF-7,所述卵巢癌细胞为卵巢癌细胞SKOV3,所述结肠癌细胞为结肠癌细胞Caco2或结肠癌细胞SW480,所述肾成纤维细胞为非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7。
4.式I所示的化合物或其药物学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用;
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述肿瘤为癌;所述癌为肺癌、乳腺癌、卵巢癌或结肠癌。
6.一种抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物,它的有效成分为所述式I所示化合物或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的药物,其特征在于:所述真核生物为哺乳动物;所述肿瘤细胞为癌细胞;所述癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或肾成纤维细胞。
8.一种预防和/或治疗肿瘤的药物,它的有效成分为所述式I所示的化合物或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求8所述的药物,其特征在于:所述肿瘤为癌;所述癌为肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌。
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