CN102442985A

CN102442985A - 一种具有抑制肿瘤细胞生殖生长活性的天然化合物p71及其应用

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Publication number: CN102442985A
Application number: CN2011102937710A
Authority: CN
Inventors: 李毅; 车永胜; 常智杰; 耿永涛; 庄文颖
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-09-29
Filing date: 2011-09-29
Publication date: 2012-05-09

Abstract

本发明公开了一种具有抑制肿瘤细胞生殖生长活性的天然化合物P71及其应用。天然化合物P71的结构式如式I所示。该化合物或其药学上可接受的盐可用于制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖药物或用于制备预防和/或治疗肿瘤药物。体外抗癌试验证实，化合物P71对乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)均有较好的抑制效果。

Description

一种具有抑制肿瘤细胞生殖生长活性的天然化合物P71及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有抑制肿瘤细胞生殖生长活性的天然化合物P71及其应用。

背景技术

肿瘤严重威胁着人类的健康，我国的肿瘤发病率和致死率均较高。目前抗肿瘤药物的研发比较滞后，还未出现一种彻底治愈肿瘤的药物。虽然我国研制出一些抗肿瘤药物但仍以进口国外的药物为主。因此，研发出具有我国自主知识产权的新型抗肿瘤药物，对于提高我国人民的生活水平具有非常重要的意义。

在特殊生境或极端环境下形成的特殊生物资源拥有特殊的基因及其表达产物，是人类的珍贵遗传资源宝库。如近年来发挥着巨大医疗作用的抗癌物质紫杉醇、治疗心血管病洛伐他汀、抗疟疾药物青蒿素等。特殊生境真菌和植物来源中功能性活性物质的开发利用，可产生丰富的自主知识产权成果，同时孕育着巨大的产业前景与经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种天然化合物P71及其应用。

本发明所提供的天然化合物P71，其结构式如式I所示。

(式I)

本发明所提供的化合物P71是从微生物固体发酵提取物中分离得到的。再应用现代色谱，质谱和NMR等技术对该化合物进行纯化和结构解析，鉴定出它是一种新型的化合物。

化合物P71的生产菌株是Lachnum virgmeum，该菌株分离自海南省，并于2011年09月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC 5294。

利用菌株L.virgineum发酵制备化合物P71的方法，主要包括以下步骤：

a)将Lachnum virgineum进行固体发酵，得到发酵培养物；

b)向所述发酵培养产物中加入有机溶剂进行提取，得到含式I所示的化合物的提取液。

其中，步骤a)中所述固体发酵中所用的培养基具体为稻米培养基。

所述发酵的条件为：在25℃无菌培养40天；

所述b)中所述有机溶剂包括多种不溶于水的在室温下是液体的有机溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、苯、等，优选乙酸乙酯。

所述方法还包括下述步骤：对所述含式I所示的化合物的提取液进行减压蒸馏，得到粗提物；将所述粗提物先进行硅胶柱层析分离，得到活性组分溶液；将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离得到所述式(I)所示的化合物。

本发明的再一个目的是提供化合物P71的用途。

本发明所提供的化合物P71的一个用途为：化合物P71及其药学上可接受的盐在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖药物中的应用。

本发明还保护一种抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物，它的有效成分为化合物P71。

本发明中所述真核生物为哺乳动物。

所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞具体可为肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或肾成纤维细胞。

本发明提供的化合物P71的另一个用途还为：化合物P71或其药物学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤为癌；所述癌具体可为肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌。

以化合物P71或其药学上可接受的盐为有效成分制备的预防和/或治疗肿瘤的药物，也属于本发明的保护范围。

所述预防和/或治疗肿瘤药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

以化合物P71或其药学上可接受的盐为活性成分制备的抗肿瘤药物，需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

以化合物P71或其药学上可接受的盐制备的预防和/或治疗肿瘤药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明通过构建细胞筛选模型以鉴定该化合物是否具有抑制肿瘤发生发展的作用。构建的细胞筛选模型有乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)等，采用体外细胞增殖实验MTT法高通量筛选该化合物能够抑制何种肿瘤细胞的生殖生长，经试验发现该化合物能够较好的抑制上述肿瘤细胞的生殖生长过程，并且对该化合物呈现剂量效应即随着化合物浓度的增高对肿瘤细胞的生殖生长的抑制效果越好。

附图说明

图1为肿瘤细胞对天然化合物P71的剂量效应；乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)。

图2为天然化合物P71对肿瘤细胞的IC₅₀值。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的菌株Lachnum virgineum于2011年09月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 5294。

实施例1、天然化合物P71制备及结构鉴定

a.菌株L.virgineum的固体发酵培养

菌株L.virgineum的活化。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL，制成试管斜面，挑取菌丝体接种于试管斜面上，25℃培养10天；

菌株L.virgineum的固体发酵。稻米培养基的制备(将400g稻米和600mL纯净水等分加入5个500mL三角瓶中，浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却待用)；从试管斜面上挑取菌丝体于装有无菌水的试管中配成菌悬液，将制备好的菌悬液(孢子浓度为1×10⁶个/mL)5mL接种于稻米培养基上，在25℃无菌培养间培养40天。

b.粗提物的提取

待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，将有机溶剂减压蒸馏至干燥，得到11.5g粗提物。

c.粗提物的分离纯化

将粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析，所用流动相为石油醚∶乙酸乙酯/V∶V＝100∶0，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90，0∶100；乙酸乙酯∶甲醇/V∶V＝90∶10，80∶20，0∶100，每个馏分收集400ml，减压浓缩，共收集14个馏分。

测试14个馏分对乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)的抑制活性，将活性组分(石油醚∶乙酸乙酯＝60∶40)通过Sephdex-LH 20(购自：GE HealthcareBio-SciencesAB，100％甲醇洗脱)分离，收集活性组分(175mg)。

将活性组分通过HPLC纯化而得到117mg化合物P71，其中HPLC的条件是：采用Agilent 1100型半制备高压液相色谱仪，Agilent C₁₈反相半制备色谱柱(5μm、9.4x250mm)，流速2.0mL/min，用甲醇和水作为流动相，制备条件：40％至100％甲醇/水梯度洗脱(线性梯度)25分钟，得到P71的保留时间t_R＝23.20min。

将上述方法制备的P71进行高分辨质谱(HRESIMS)、红外光谱(IR)和核磁共振谱分析，其中高分辨质谱由南京大学质谱测试中心提供测试(测试仪器型号为BrukerEsquire 3000^plus)，红外光谱由北京大学化学学院提供测试(测试仪器型号为NicoletMagna-IR 750)，核磁共振谱由中国医学科学院药物研究所提供测试(测试仪器型号为Varian Mercury-400)。化合物P71的理化数据见表1，氢谱(¹H-NMR)和碳谱(¹³C-NMR)数据见表2。

表1.化合物P71的物化常数

表2.化合物P71的氢谱(¹H-NMR)和碳谱(¹³C-NMR)数据

^a在400MH以DMSO-d₆为溶剂测试。

^b在100MHz以DMSO-d₆为溶剂测试。

证实得到化合物P71的结构如下：

综上从真菌L.virgineum中提取并分离了天然化合物P71，经过进一步的纯化，结合高效液相色谱，质谱和核磁共振技术分析鉴定该化合物的结构特征。发现其是一种具有抑制肿瘤细胞生殖生长活性的新型天然化合物。

实施例2、高通量筛选天然化合物P71对肿瘤细胞生殖生长的影响

构建细胞筛选模型：乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)。

采用细胞增殖实验MTT法检验该化合物对以上几种肿瘤细胞生殖生长的影响，首先把细胞接种到96孔板，每种肿瘤细胞的接种密度不同，生长速度较快的肿瘤细胞接种的密度较低如乳腺癌细胞(MCF-7)、卵巢癌细胞(SKOV3)。另外根据天然化合物P71对各种肿瘤细胞的处理时间的不同也要适当的调整肿瘤细胞的接种密度，如处理时间较长肿瘤细胞的接种密度较低，为了验证几种肿瘤细胞对该化合物的剂量效应，每种化合物至少选择三个不同的化合物密度进行处理肿瘤细胞，而两个处理浓度之间的梯度最好保持一致，每种处理浓度要设置三个重复。

将化合物P71用DMSO作溶剂分别配制成浓度为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM及0.0001μM的待测溶液。

具体如下：

1、将乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞悬液接种至96孔板，每孔接种200μl(5000个细胞/孔)，于37℃，5％CO₂的培养箱内培养24h，然后倾去各孔培养液。将化合物P71的溶液(浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0.0001μM)分别加入到96孔板中MCF-7细胞的培养孔内，每个浓度接种3孔，每孔加入200μl；将其置于37℃，5％CO₂的培养箱内培养72h。

2、肺癌细胞(A549)每孔接种200μl(10000个细胞/孔)；加入的化合物P71溶液的浓度分别为1μM、0.1μM、0.01μM；P71对A549的处理时间为72h，其余同1。

3、卵巢癌细胞(SKOV3)每孔接种200μl(4000个细胞/孔)；加入的化合物P71溶液的浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0.0001μM；P71对SKOV3的处理时间为72h，其余同1。

4、结肠癌细胞(Caco2)每孔接种200μl(7500个细胞/孔)；加入的化合物P71溶液的浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0.0001μM；P71对Caco2的处理时间为72h，其余同1。

5、结肠癌细胞(SW480)每孔接种200μl(7500个细胞/孔)；加入的化合物P71溶液的浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0.0001μM；P71对SW480的处理时间为72h，其余同1。

6、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)每孔接种200μl(10000个细胞/孔)；加入的化合物P71溶液的浓度分别为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM；P71对COS-7的处理时间为72h，其余同1。

在测定MTT值之前四个小时每孔加入20ul MTT(浓度5mg/ml)处理肿瘤细胞，四小时后洗掉肿瘤细胞培养基，每孔加入150ul的DMSO，然后低速率下震荡十分钟左右在酶标仪490-630nm双波长的条件下测定MTT值(光密度OD值)，按公式计算肿瘤细胞生长抑制率。

本实验中的OD_对照、OD_实验值均为扣除掉OD_空白的值。

化合物P71对上述细胞抑制作用的结果见图1。

实施例3、测定天然化合物P71对几种肿瘤细胞的IC50值

测定天然化合物P21对乳腺癌细胞(MCF-7)、肺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(SKOV3)、结肠癌细胞(Caco2、SW480)、非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7)的IC50值。

首先要确定天然化合物P71的六个处理浓度，每个浓度梯度之间保持一致，六个浓度分别为：0.0001、0.001、0.01、0.1、1.0、10(uM)，每种浓度处理要设置三个重复。对照用DMSO处理。根据化合物的处理时间以及肿瘤细胞的生殖生长速率来调整肿瘤细胞在96孔板的接种密度(具体接种密度及处理时间同实施例2)。在测定MTT值之前四个小时每孔用20ulMTT处理肿瘤细胞，四小时后洗掉肿瘤细胞培养基，每孔加入150ul的DMSO，然后低速率下震荡十分钟左右在酶标仪490-630nm双波长的条件下测定MTT值。根据得到的各个化合物处理浓度的MTT值，采用IC50值的计算公式从而得到化合物对肿瘤细胞的IC50值。结果见图2。

计算IC₅₀值计算公式：lgIC50＝Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

其中，Xm：lg最大剂量；I：lg(最大剂量/相临剂量)；P：阳性反应率之和；Pm：最大阳性反应率；Pn：最小阳性反应率。

Claims

1.结构式如式I所示的化合物：

(式I)。

2.制备所述式I所示的化合物的方法，包括下述步骤：

a)将Lachnum virgineum进行固体发酵，得到发酵培养物；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a)中所述固体发酵中所用的培养基为稻米培养基；所述发酵的条件为：在25℃无菌培养40天；所述Lachnumvirgineum的保藏编号为CGMCC No.5294；

所述b)中所述有机溶剂为乙酸乙酯。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括下述步骤：对所述含式I所示的化合物的提取液进行减压蒸馏，得到粗提物；将所述粗提物先进行硅胶柱层析分离，得到活性组分溶液；将所述活性组分溶液用高效液相色谱分离得到所述式(I)所示的化合物。

5.权利要求1中所述式I所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖药物中的应用或在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞或结肠癌细胞；

所述肺癌细胞优选肺癌细胞A549，所述乳腺癌细胞优选乳腺癌细胞MCF-7，所述卵巢癌细胞优选卵巢癌细胞SKOV3，所述结肠癌细胞优选结肠癌细胞Caco2或结肠癌细胞SW480，所述肾成纤维细胞优选非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7；

所述肿瘤为癌；所述癌为肺癌、乳腺癌、卵巢癌或结肠癌。

7.一种抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物，它的有效成分为权利要求1中所述式I所示化合物或其药学上可接受的盐。

8.一种预防和/或治疗肿瘤的药物，它的有效成分为权利要求1中所述式I所示的化合物或其药学上可接受的盐。

9.根据权利要求7或8所述的药物，其特征在于：所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞或结肠癌细胞；

所述肿瘤为癌；所述癌为肺癌、乳腺癌、卵巢癌或结肠癌。

10.Lachnum virgineum，其保藏编号为CGMCC No.5294。