CN110218744A - 一种通过微生物发酵制备曲地酸的方法 - Google Patents

一种通过微生物发酵制备曲地酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过微生物发酵制备曲地酸的方法。第一方面，本发明要求保护Pseudogymnoascus pannorum BJZ13在制备曲地酸中的应用。第二方面，本发明要求保护一种制备曲地酸的方法，包括如下步骤：发酵培养Pseudogymnoascus pannorum BJZ13，得到曲地酸。本发明公开了Pseudogymnoascus pannorum BJZ13的一种新用途，即发酵培养Pseudogymnoascus pannorum BJZ13，从发酵产物中分离纯化得到曲地酸。本发明提供的制备曲地酸的方法，操作简单、成本低廉、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为曲地酸类药物的资源开发提供了新途径。

Description

一种通过微生物发酵制备曲地酸的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种通过微生物发酵制备曲地酸的方法。
背景技术
曲地酸是一类含二苯醚结构的化合物，具有抗菌、抗肿瘤等医药活性，以及杀菌、杀线虫及抑制水芹种子萌发等农药活性。利用微生物生产曲地酸，可以获得纯度较高的曲地酸单体，从而避免化学合成副产物的残留，并且微生物为活体为合成场所，利用生物自身的资源产生曲地酸，可以避免资源的浪费和对环境的破坏。微生物易于繁殖和大量培养，操作简单、成本低廉、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力，是生产曲地酸药物的理想途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过微生物发酵制备曲地酸的方法。
第一方面，本发明要求保护Pseudogymnoascus pannorum BJZ13在制备曲地酸中的应用。Pseudogymnoascus pannorum BJZ13已于2018年03月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.15389。
第二方面，本发明要求保护一种制备曲地酸的方法，包括如下步骤：发酵培养Pseudogymnoascus pannorum BJZ13，得到曲地酸。
发酵培养具体包括如下步骤：
(1)将Pseudogymnoascus pannorum BJZ13的单菌落接种至种子培养基，15℃、120r/min振荡培养7天，得到种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液接种至装有发酵培养基的锥形瓶(4mL种子液/瓶)，15℃静置培养40天，得到发酵培养的产物。
种子培养基的制备方法：可溶性淀粉20g/L、FeCl3 0.00065g/L、MgSO4 0.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、(NH4)2SO4 0.65g/L，余量为水，调pH至7.2-7.4，然后121℃高压灭菌20min，冷却至室温时添加氨苄抗生素并使其浓度为1μL/mL。
发酵培养基的制备方法：取500mL锥形瓶，加入50g大米和80mL蒸馏水，121℃高压灭菌20min。
所述方法还包括对所述发酵培养的产物进行有机相提取的步骤。
所述有机相提取中采用的有机溶剂为乙酸乙酯和二氯甲烷。
所述有机相提取的方法包括如下步骤：取发酵培养的产物，采用乙酸乙酯进行提取，然后收集乙酸乙酯相进行减压浓缩，得到浸膏；然后取浸膏，采用二氯甲烷进行提取，然后收集二氯甲烷相进行减压浓缩，得到二氯甲烷相浸膏，又称粗提物。
所述有机相提取的方法包括如下步骤：
(1)取发酵培养的产物，加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；
(2)完成步骤(1)后，在残留物中加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；
(3)完成步骤(2)后，在残留物中加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；
(4)完成步骤(3)后，在残留物中加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；
(5)将步骤(2)得到的乙酸乙酯相、步骤(3)得到的乙酸乙酯相和步骤(4)得到的乙酸乙酯相合并，减压浓缩，得到浸膏；
(6)取步骤(5)得到的浸膏，用二氯甲烷进行提取，然后减压浓缩，得到二氯甲烷相浸膏，又称粗提物。
所述有机相提取的方法包括如下步骤：
(1)完成发酵培养后，在所述锥形瓶中加入乙酸乙酯至400mL，然后超声破碎20min，收集乙酸乙酯相；
(2)完成步骤(1)后，在所述锥形瓶中加入乙酸乙酯至400mL，然后超声破碎20min，收集乙酸乙酯相；
(3)完成步骤(2)后，在所述锥形瓶中加入乙酸乙酯至400mL，然后超声破碎20min，收集乙酸乙酯相；
(4)完成步骤(3)后，在所述锥形瓶中加入乙酸乙酯至400mL，然后超声破碎20min，收集乙酸乙酯相；
(5)将步骤(2)得到的乙酸乙酯相、步骤(3)得到的乙酸乙酯相和步骤(4)得到的乙酸乙酯相合并，减压浓缩，得到浸膏；
(6)取步骤(5)得到的浸膏，用二氯甲烷进行提取(二氯甲烷充分渗入浸膏后，室温静置1小时)，然后减压浓缩，得到二氯甲烷相浸膏，又称粗提物。
所述方法还包括从二氯甲烷相浸膏中获得曲地酸的步骤。
从二氯甲烷相浸膏中获得曲地酸包括如下步骤：取二氯甲烷相浸膏，用二氯甲烷溶解，然后进行正相硅胶开放柱色谱分离，然后进行结晶。
正相硅胶开放柱色谱分离的参数：硅胶粒度为100-200目；洗脱初始时刻流动相为二氯甲烷，洗脱终止时刻流动相为甲醇，洗脱过程中的流动相为二氯甲烷和甲醇的混合物；流动相的流速为3mL/min；洗脱过程为50h，洗脱过程中，二氯甲烷占流动相的体积份数由100％线性下降至0％，相应的甲醇占流动相的体积份数由0％线性上升至100％；收集二氯甲烷占流动相的体积份数为98％-94％时的组分。
结晶的具体步骤：取正相硅胶开放柱色谱分离收集的液体，减压浓缩(该组分不能完全溶于二氯甲烷，因此向其中滴加甲醇使溶液澄清不粘稠)，然后进行结晶，结晶析出后析出多余液体，再加入二氯甲烷/甲醇混合体系使结晶完全溶解，然后进行重结晶，待结晶析出后析出多余液体，再加入二氯甲烷/甲醇混合体系使结晶完全溶解，然后进行重结晶，得到的针状结晶。二氯甲烷/甲醇混合体系由10体积份二氯甲烷和1体积份甲醇混匀得到。
本发明公开了Pseudogymnoascus pannorum BJZ13的一种新用途，即发酵培养Pseudogymnoascus pannorum BJZ13，从发酵产物中分离纯化得到曲地酸。本发明提供的制备曲地酸的方法，操作简单、成本低廉、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为曲地酸类药物的资源开发提供了新途径。
附图说明
图1为BLAST序列比对结果。
图2为结晶1H-NMR图(氢谱谱图；400MHz,氘代丙酮)。
图3为结晶13C-NMR图(碳谱谱图；100MHz,氘代丙酮)。
图4为结晶HSQC谱图(400/100MHz,氘代丙酮)。
图5为结晶HMBC谱图(400/100MHz,氘代丙酮)。
图6为结晶HR-ESI-MS谱图。
保藏说明
菌株名称：BJZ13
拉丁名：Pseudogymnoascus pannorum
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年03月08日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15389
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
BILON92-IIDL超声波细胞粉碎机(用于超声破碎)：上海珂淮仪器有限公司。RE-52AA旋转蒸发器(用于减压浓缩)：上海亚荣生化仪器厂。SHZ-III型循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂。核磁共振仪：Bruker Avance III 400MHz，TMS为内标。高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪：micrOTOF-Q，Bruker公司。
实施例1、Pseudogymnoascus pannorum BJZ13的获得及鉴定
三洋藓的采集时间：2015年8月8日。
三洋藓的采集地点：北极地区斯瓦尔巴(Svalbard)群岛新奥尔松地区(Ny-78°54′01.242″N，12°09′33.816″E)。
1、预处理
取采集得到的三洋藓，用无菌水将泥沙等杂质洗净。
2、表面消毒
取预处理后的三洋藓，在无菌条件下剪碎，然后用75％乙醇消毒1min，然后用无菌水冲洗冲洗5次(每次1min)。
3、共生菌培养
取表面消毒后的剪碎的三洋藓，在无菌条件下均匀铺在培养基上，15℃培养5-15天。培养基：可溶性淀粉20g/L，FeCl3 0.00065g/L，MgSO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，(NH4)2SO40.65g/L，pH 7.2-7.4，琼脂2g/100mL，121℃高压灭菌20min，然后加入氨苄抗生素并使其浓度为1μL/mL。
4、共生菌的纯化
步骤3培养数天后，在无菌条件下，逐步将新长出的菌体挑到新的平板上进行培养，数天后菌落形成，依照菌落形态、颜色的差异和菌落长出时间初步判断菌种类型，挑选出不同菌种并分别接种于新的平板上。
重复以上操作直至分离出纯菌落。
5、菌种鉴定
将已纯化的菌种接种于平板上，送往北京六合华大基因科技有限公司进行测序鉴定。对已纯化的菌种进行测序，其ITS序列见序列表的序列1。
通过NCBI的Blast数据中的核酸数据进行比对分析，BLAST序列比对结果见图1。通过序列比对，该菌种与Pseudogymnoascus pannorum(Geomyces pannorus)同源性为99％。
6、菌种保藏
Pseudogymnoascus pannorum BJZ13已于2018年03月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.15389。
实施例2、利用Pseudogymnoascus pannorum BJZ13制备曲地酸
一、培养Pseudogymnoascus pannorum BJZ13
1、将Pseudogymnoascus pannorum BJZ13的单菌落接种至种子培养基，15℃、120r/min振荡培养7天，得到种子液。
种子培养基的制备方法：可溶性淀粉20g/L、FeCl3 0.00065g/L、MgSO4 0.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、(NH4)2SO4 0.65g/L，余量为水，调pH至7.2-7.4，然后121℃高压灭菌20min，冷却至室温时添加氨苄抗生素并使其浓度为1μL/mL。
2、将步骤1得到的种子液接种至装有发酵培养基的锥形瓶(4mL种子液/瓶)，15℃静置培养40天。
发酵培养基的制备方法：取500mL锥形瓶，加入50g大米和80mL蒸馏水，121℃高压灭菌20min。
二、制备粗提物
1、完成步骤一的2后，在所述锥形瓶中加入乙酸乙酯至400mL，用玻璃棒捣碎，然后超声破碎20min，收集乙酸乙酯相。
2、完成步骤1后，在所述锥形瓶(其中具有步骤1收集乙酸乙酯相后的残留物)中加入乙酸乙酯至400mL，然后超声破碎20min，收集乙酸乙酯相。
3、完成步骤2后，在所述锥形瓶(其中具有步骤2收集乙酸乙酯相后的残留物)中加入乙酸乙酯至400mL，然后超声破碎20min，收集乙酸乙酯相。
4、完成步骤3后，在所述锥形瓶(其中具有步骤3收集乙酸乙酯相后的残留物)中加入乙酸乙酯至400mL，然后超声破碎20min，收集乙酸乙酯相。
5、将步骤2得到的乙酸乙酯相、步骤3得到的乙酸乙酯相和步骤4得到的乙酸乙酯相合并，然后采用旋转蒸发器进行减压浓缩，得到浸膏。
6、取步骤5得到的浸膏，用二氯甲烷进行提取(二氯甲烷充分渗入浸膏后，室温静置1小时)，然后采用旋转蒸发器进行减压浓缩，得到二氯甲烷相浸膏，又称粗提物。
每升完成步骤一的发酵体系，在步骤二中制备得到72.2g粗提物。
三、获得曲地酸
1、取步骤二的6得到的粗提物，用二氯甲烷溶解，然后进行正相硅胶开放柱色谱分离。
硅胶粒度100-200目。
洗脱初始时刻流动相为二氯甲烷，洗脱终止时刻流动相为甲醇，洗脱过程中的流动相为二氯甲烷和甲醇的混合物。流动相的流速为3mL/min。洗脱过程为50h，洗脱过程中，二氯甲烷占流动相的体积份数由100％线性下降至0％，相应的甲醇占流动相的体积份数由0％线性上升至100％。
收集二氯甲烷占流动相的体积份数为98％-94％时的组分。
2、取步骤1收集的液体，然后采用旋转蒸发器进行减压浓缩。该组分不能完全溶于二氯甲烷，因此向其中滴加少量甲醇使溶液澄清不粘稠。
3、完成步骤2后，用锡箔纸封口容器，用牙签扎出密集小孔，放入通风橱中，等待结晶。待结晶析出后，析出多余液体，再加入二氯甲烷/甲醇混合体系(二氯甲烷/甲醇混合体系由10体积份二氯甲烷和1体积份甲醇混匀得到)使结晶完全溶解。
4、完成步骤3后，用锡箔纸封口容器，用牙签扎出密集小孔，放入通风橱中，重结晶。待结晶析出后，析出多余液体，再加入二氯甲烷/甲醇混合体系使结晶完全溶解。
5、完成步骤4后，用锡箔纸封口容器，用牙签扎出密集小孔，放入通风橱中，重结晶，得到的针状结晶。
每g粗提物，得到13.2mg针状晶体。
6、将步骤5得到的针状结晶溶解于氘代丙酮，进行核磁鉴定和HR-ESI-MS鉴定。
核磁鉴定的参数：1H-NMR(acetone-d6,400MHz),13C-NMR(acetone-d6,100MHz),HSQC(acetone-d6,400/100MHz),HMBC(acetone-d6,400/100MHz)。核磁鉴定的结果见表1。1H-NMR图见图2。13C-NMR图见图3。HSQC图见图4。HMBC图见图5。
HR-ESI-MS鉴定的参数：喷射电压3500V,温度180℃，Set Nebulizer 0.6Bar,ScanBegin 50m/z，Set End plate offset-500V，Set Dry Gas 6.0l/min，Scan End 1000m/z，Set Collision Cell RF 150.0Vpp。HR-ESI-MS图见图6。
结果表明，步骤5得到的针状结晶的结构式如式(Ⅰ)所示，为曲地酸。
表1结晶的核磁数据(δin ppm and J in Hz)
SEQUENCE LISTING
<110> 北京师范大学
<120> 一种通过微生物发酵制备曲地酸的方法
<130> GNCYX191084
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 570
<212> DNA
<213> Pseudogymnoascus pannorum
<400> 1
tttccgtagg gtgacctgcg gaaggatcat tacagtagtc gcccgggttg ccgcaaggcc 60
tcccgggtaa cctaccaccc tttgtttatt acactttgtt gctttggcaa gcctgccctc 120
gggctgctgg ctccggccgg cgagcgcttg ccagaggacc taaactctgt ttgtctatac 180
tgtctgagta ctatataata gttaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg 240
atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga 300
atctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360
tacaaccctc aagctcagct tggtgttggg ccccgccgcc ccggcgggcc ctaaagtcag 420
tggcggtgcc gtccggctcc gagcgtagta attcttctcg ctctggaggt ccggtcgtgt 480
gctcgccagc aacccccaat ttttttcagg ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct 540
gaacttaagc atatcaataa agcggaggaa 570

Claims (10)

1.Pseudogymnoascus pannorum BJZ13在制备曲地酸中的应用；
Pseudogymnoascus pannorum BJZ13的保藏登记号为CGMCC No.15389。
2.一种制备曲地酸的方法，包括如下步骤：发酵培养Pseudogymnoascus pannorumBJZ13，得到曲地酸；Pseudogymnoascus pannorum BJZ13的保藏登记号为CGMCC No.15389。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对所述发酵培养的产物进行有机相提取的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述有机相提取中采用的有机溶剂为乙酸乙酯和二氯甲烷。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述有机相提取的方法包括如下步骤：取发酵培养的产物，采用乙酸乙酯进行提取，然后收集乙酸乙酯相进行减压浓缩，得到浸膏；然后取浸膏，采用二氯甲烷进行提取，然后收集二氯甲烷相进行减压浓缩，得到二氯甲烷相浸膏。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述有机相提取的方法包括如下步骤：
(1)取发酵培养的产物，加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；
(2)完成步骤(1)后，在残留物中加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；
(3)完成步骤(2)后，在残留物中加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；
(4)完成步骤(3)后，在残留物中加入乙酸乙酯，然后超声破碎，收集乙酸乙酯相；
(5)将步骤(2)得到的乙酸乙酯相、步骤(3)得到的乙酸乙酯相和步骤(4)得到的乙酸乙酯相合并，减压浓缩，得到浸膏；
(6)取步骤(5)得到的浸膏，用二氯甲烷进行提取，然后减压浓缩，得到二氯甲烷相浸膏。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括从所述二氯甲烷相浸膏中获得曲地酸的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：从二氯甲烷相浸膏中获得曲地酸包括如下步骤：取二氯甲烷相浸膏，用二氯甲烷溶解，然后进行正相硅胶开放柱色谱分离，然后进行结晶。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
正相硅胶开放柱色谱分离的参数：硅胶粒度为100-200目；洗脱初始时刻流动相为二氯甲烷，洗脱终止时刻流动相为甲醇，洗脱过程中的流动相为二氯甲烷和甲醇的混合物；流动相的流速为3mL/min；洗脱过程为50h，洗脱过程中，二氯甲烷占流动相的体积份数由100％线性下降至0％，相应的甲醇占流动相的体积份数由0％线性上升至100％；收集二氯甲烷占流动相的体积份数为98％-94％时的组分。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
结晶的步骤：取正相硅胶开放柱色谱分离收集的液体，减压浓缩，然后进行结晶，结晶析出后析出多余液体，再加入二氯甲烷/甲醇混合体系使结晶完全溶解，然后进行重结晶，待结晶析出后析出多余液体，再加入二氯甲烷/甲醇混合体系使结晶完全溶解，然后进行重结晶，得到的针状结晶，即为曲地酸；二氯甲烷/甲醇混合体系由10体积份二氯甲烷和1体积份甲醇混匀得到。
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