CN102038676B

CN102038676B - 治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药中的应用

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Publication number: CN102038676B
Application number: CN201010534837A
Authority: CN
Inventors: 左国营; 安静; 左晖; 冯筱巍; 李杨; 王根春; 张云玲; 余巍; 尹玉琴
Original assignee: KUNMING GENERAL HOSPITAL OF CHENGDU MILITARY REGION
Current assignee: KUNMING GENERAL HOSPITAL OF CHENGDU MILITARY REGION
Priority date: 2010-11-08
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2030-11-08
Also published as: CN102038676A

Abstract

一种治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药中的应用，含有治疗有效量的如下结构式(I)的异巴西红厚壳素或包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物和药学上可接受的载体；以及异巴西红厚壳素或包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物活性成分在制备抗耐药菌(含非耐药菌)药物中的应用，以及作为抗生素中增敏活性成分和抗生素的增敏剂中的应用。

Description

治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体地，涉及治疗耐药菌感染的药物及其活性成分在制药中的应用。

背景技术

随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌对常用抗生素产生耐药性，且耐药程度日益加重。自从1961年英国首先报道耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)以来，至今世界各地相继发现，且MRSA感染呈上升趋势，甚至引起医院内爆发流行。目前MRSA与爱滋病、肝炎、癌症并列为当今世界上的四大顽症。MRSA对多种抗生素耐药，致病力强且治疗效果差，为引起医院感染的主要病原菌之一。由于其多重耐药性，即除了对万古霉素等少数几种抗生素有效外，几乎对现有各类抗生素如β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类等抗生素都耐药，而且感染多发生于免疫缺陷者、老弱患者及烧伤、手术患者，故治疗难度大、病死率高，引起医务工作者的高度重视。建国以来，我国虽然对中草药抗金葡菌等感染的作用进行过筛选研究，但这些研究多限于药材提取物，对耐药菌的作用也只是在近年来才得到关注，国内迄今罕见针对MRSA感染的单体化合物的研究报道。迄今，现有技术中未见异巴西红厚壳素具有治疗耐药菌感染的作用的报道，也没有对MRSA作用时具有对β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素的增敏作用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供治疗耐药菌感染的药物，其中含有治疗有效量的如下结构式(I)的异巴西红厚壳素(Isojacareubin)或包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物和药学上可接受的载体；以及异巴西红厚壳素或包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物活性成分在制备抗耐药菌(含非耐药菌)药物中的应用，以及作为抗生素中增敏活性成分和抗生素的增敏剂中的应用。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种治疗耐药菌感染的药物，其中含有治疗有效量的如下结构式(I)所示的异巴西红厚壳素及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物和药学上可接受的载体，

(I：异巴西红厚壳素)

结构式(I)所示的异巴西红厚壳素及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物在制备抗耐药菌药物中的应用，

结构式(I)的异巴西红厚壳素及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物在制备非耐药菌药物中的应用。

所说耐药菌是指耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

所说非耐药菌是指金黄色葡萄球菌。

本发明还提供了结构式(I)的异巴西红厚壳素及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物作为抗生素中增敏活性成分的应用。

以及，结构式(I)的异巴西红厚壳素及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物用于制备抗生素的增敏剂。

上面提到的抗生素为β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素。

本发明上述技术方案的提出是基于当前临床耐药菌感染的实际，结合植物药抗菌药敏筛选和有效成分分离纯化方法，从藤黄科(Guttiferae)金丝桃属植物如地耳草(Hypericum japonicum Thunb.)中提取分离异巴西红厚壳素并证实其抗耐药菌活性。本发明对中药地耳草进行提取分离纯化得到异巴西红厚壳素，并首次发现其与β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素联合作用时，对抗生素具有增敏作用，能够增强β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素的抗MRSA作用(所谓“逆转”是指对MRSA菌株的抗菌活性达到非耐药菌株的强度)。

本发明的化合物异巴西红厚壳素及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物可经口或不经过口给药，给药量因药物不同而各有不同，对成人来说，每天1-1000mg比较合适。

经口服给药时，首先使化合物或提取物与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式给药；非经口给药时可以注射液、输液剂或栓剂等形式给药。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术。

附图说明

附图1-4为异巴西红厚壳素(化合物I)与四种抗生素联合应用对MRSA的时间杀菌曲线，其中：

图1为异巴西红厚壳素(化合物I)与氨苄西林联合的时间杀菌曲线。

图2为异巴西红厚壳素(化合物I)与头孢他啶联合的时间杀菌曲线。

图3为异巴西红厚壳素(化合物I)与左氧氟沙星联合的时间杀菌曲线。

图4为异巴西红厚壳素(化合物I)与阿奇霉素联合的时间杀菌曲线。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

从地耳草地上部分中提取分离单体异巴西红厚壳素：

取地耳草(Hypericum japonicum Thunb.Murray)干燥全草粗粉4.76kg于室温下用80％乙醇23L浸渍7天，过滤，重复3次。提取液合并，减压浓缩，得浸膏505g。将浸膏用蒸馏水制成悬浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分配萃取。各有机层减压蒸干后分别得到90g，160g，105g浸膏，余为水部位。取乙酸乙酯层浸膏90g用硅胶柱(200-300目，2kg)，以乙酸乙酯-甲醇(1∶0-0∶1)为洗脱剂梯度洗脱，其中5％甲醇洗脱部位(8g)再用硅胶柱(300-400目，300g)以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(3∶1∶0.2-2∶2∶1)为洗脱剂梯度洗脱，3∶1∶0.2溶剂洗脱部位(0.6g)进行低压硅胶柱层析和葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，经薄层层析检查，含相同组分者合并，得到纯化合物异巴西红厚壳素150mg。

异巴西红厚壳素的波谱数据：黄色粉末(甲醇)，C₁₈H₁₄O₆，ESI-MS：m/z[M+1]⁺327；¹H-NMR(400MHz)：7.58(1H，d，J＝8.8Hz，H-8)，7.05(1H，d， J＝10.0Hz，H-4′)，6.92(1H，d，J＝8.8Hz，H-7)，6.15(1H，s，H-2)，5.72(1H，d，J＝10.0Hz，H-3′)，1.44(6H，s，2′，2Me)；¹³C-NMR(100MHz)：162.8(C-1)，98.8(C-2)，160.18(C-3)，102.7(C-4)，51.7(C-4a)，146.5(C-4b)，132.9(C-5)，152.9(C-6)，115.4(C-7)，116.6(C-8)，113.3(C-8a)，180.4(C-9)，101.4(C-9a)，78.6(C-2′)，127.8(C-3′)，113.8(C-4′)，28.3(C-2′Me)。

实施例2：从地耳草地上部分制备抗MRSA活性提取物：

按照实施例1的操作步骤，得到含异巴西红厚壳素的浸膏505g。将浸膏用蒸馏水制成悬浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分配萃取。得到乙酸乙酯部分为富含异巴西红厚壳素结构的植物提取物160g。

实施例3：

用作药敏试验的临床耐药菌株MRSA即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)的筛选：

1.试验材料

抗菌素药敏纸片(中国药品生物制品检定所)，MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)。

2.标本来源

从申请人医院的临床标本中分离筛选10株细菌标本，编号为MRSA004、MRSA055、MRSA092、MRSA123、MRSA144、MRSA155、MRSA189、MRSA247、MRSA328、MRSA330，冰箱-20℃下保存备用。

3.细菌鉴别

依据《全国临床检验操作规程》及本领域技术人员公知的细菌鉴别方法对上述标本细菌进行分离、培养，经鉴定为金黄色葡萄球菌(SA)，并按公知的抗菌素药敏常规测试方法(K-B纸片法)，参照美国临床试验室标准委员会(NCCLS)2004年标准进行耐药菌鉴定，头孢西丁对该标本的抑菌圈均≤19mm，故视为耐药SA菌株(MRSA)。

4.药敏试验

进一步用K-B纸片法，按照我国卫生部于2000年5月1日颁布实施的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》(SAST)常规操作，用MH琼脂培养基于35℃培养 20小时，测定10株MRSA对常用抗菌素的敏感性，结果见表1。

表1.MRSA菌株对抗生素的药敏试验结果

实施例4：

异巴西红厚壳素对耐药菌株MRSA的抗生素增敏作用测定：

1.试验材料

培养基：MH肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)；受试药：异巴西红厚壳素(由地耳草中提取分离得到)氨苄西林(华北制药)，头孢他啶(积大制药)，左氧氟沙星(扬子江制药)、阿奇霉素(扬子江制药)，溶剂：DMSO(分析纯)，蒸馏水；标准金黄色葡萄球菌(MSSA)：ATCC25923(中国药品生物制品检定所)，耐药菌(MRSA)：MRSA004、MRSA055、MRSA092、MRSA123、MRSA144、MRSA155、MRSA189、MRSA247、MRSA328、MRSA330。

2.药液制备

无菌DMSO将乙酸乙酯提取物和异巴西红厚壳素单体、氨苄西林、头孢他啶、左氧氟沙星和阿奇霉素分别配成配成2048μg/mL、64μg/mL、2048μg/mL、2048μg/mL、512μg/mL、8192μg/mL溶液作为原药溶液。

稀释法分别测定氨苄西林、头孢他啶、左氧氟沙星、阿奇霉素、乙酸乙酯提取物和单体对MRSA的最低抑菌浓度值(Minimal inhibitory concentration，MIC)，把单体、左氧氟沙星先分别配成1024μg/mL、128μg/mL的原液，氨苄西林、头孢他啶、阿奇霉素均配成2048μg/mL的原液，均使用稀释法分别测定他们对MRSA的M IC，控制菌悬液浓度为1.0×10⁶CFU/mL。

3.菌液的制备

用接种环把菌株接种在MH琼脂平板上，置于35℃恒温箱中培养24h，再用接种环把菌株转移至试管中，用无菌生理盐水配成浓度为1.0×10⁶CFU/mL控制菌悬液。

4.测定药物抑制MRSA的最小抑菌浓度(MIC)

采用公知的二倍稀释法，取无菌96孔板，于每横排1号孔加200μL MH肉汤培养基作空白对照，12号孔加MH肉汤培养基和菌液各100μL作阳性对照。每横排2-11号孔先各加入50μL MH肉汤培养基，取原药液50μL与2号孔混匀，继而吸取50μL加入3号孔中，依次类推稀释至第11号孔，弃去50μL，2-11号孔各都加100μL稀释为1.0×10⁶CFU/mL菌液摇匀，置培养箱中于35℃培养24小时，按本领域技术人员公知方法进行受试药物活性评价，所得测定结果见表2。

表2.乙酸乙酯提取物和异巴西红厚壳素与四种抗生素单用对MSSA和10株MRSA的MIC(单位：μg/mL)

EA，乙酸乙酯提取物；ISJ，异巴西红厚壳素；MSSA：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(标准菌ATCC25923)；AMP，氨苄西林；CAZ，头孢他啶；LEO，左氧氟沙星；AZI，阿奇霉素.

5.异巴西红厚壳素与抗生素联合抑菌实验

5.1棋盘式微量稀释法(checkerboard microdilution assay)

棋盘法能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。合用的两种药物于96孔板上以二维棋盘的纵(A至H)横(2-11)两方向分别进行二倍的倍比稀释，测定联合用药的MIC。FICI是评价药物体外联合用药的两药相互作用方式的主要参数。部分抑菌浓度指数(Fractional inhibitoryconcentration，FIC)为每一种药物联合抑菌时所需最低抑菌浓度(MIC_c)与单独时MIC_a的比值，而FICI则等于两种药物FIC之和。计算的公式为；FICI＝FIC₁+FIC₂＝MIC_1a/MIC_1c+MIC_2a/MIC_2c。当FICI≤0.5时，为协同作用；当1≥FICI＞0.5时，为相加作用；当2≥FICI＞1时，药物体外的相互作用方式为无关；当FIC指数＞2时，为拮抗作用。结果见表3。

表3.异巴西红厚壳素与四种抗生素对10株MRSA联合用药MIC(μg/mL)和FIC指数

^aISJ，异巴西红厚壳素；AMP，氨苄西林；CAZ，头孢他啶；LEO，左氧氟沙星；AZI，阿奇霉素.^bale，单独作用；icn，联合作用.^cMIC₅₀，抑制50％MRSA的浓度；MIC₉₀，抑制90％MRSA的浓度.^dFICI₅₀，抑制50％MRSA的FIC指数；FICI₉₀，抑制90％MRSA的FIC指数.^eadd，相加；ind，无关；syn，协同.

5.2时间杀菌曲线(Time-kill curves)

绘制每种抗生素与单体联合的时间杀菌曲线，每种药物的浓度均为MIC。菌液于37℃恒温箱中培养，分别于0、4、8、12、24h，从菌液种各取100μL液体，以0.9％无菌生理盐水10倍稀释，然后再从不同稀释倍数的液体中各取100μL均匀涂铺于固体琼脂培养基表面，37℃恒温箱中培养24h后计数菌落数，以log₁₀CFU/mL对时间做曲线。两药合用后与最有效单药相比，菌落数下降≥2log₁₀CFU/mL时确认两药具有协同作用，菌落数下降1-2log₁₀CFU/mL时认为两药具有相加作用，菌落数下降或上升＝1log₁₀CFU/mL认为两药两药相互作用为无关，菌落数上升＞1log₁₀CFU/mL认为具有拮抗作用(Chin，J.N.et al.J.Antimicrob.Chemoth.2008，61，365-370)。结果见图1。

实施例5：

按实施例1和2的方法先制得异巴西红厚壳素，以及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例6：

按实施例1和2的方法先制得异巴西红厚壳素，以及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例7：

按实施例1和2的方法先制得异巴西红厚壳素，以及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物，与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例8：

按实施例1和2的方法先制得异巴西红厚壳素，以及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物，按其与赋形剂重量比为1∶5-1∶10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例9：

按实施例1和2的方法先制得异巴西红厚壳素，以及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物，按常规口服液制法制成口服液。

实施例10：

按实施例1和2的方法先制得异巴西红厚壳素，以及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

实施例11：

按实施例1和2的方法先制得异巴西红厚壳素，以及包含异巴西红厚壳素结构的植物提取物，按其与赋形剂重量比为3∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

Claims

1.异巴西红厚壳素作为唯一活性成分在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的应用，其中含有治疗有效量的如下结构式（I）所示的异巴西红厚壳素和药学上可接受的载体，

（I：异巴西红厚壳素）。

2.异巴西红厚壳素作为唯一活性成分在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物中的应用，其中含有治疗有效量的如下结构式（I）所示的异巴西红厚壳素和药学上可接受的载体，

（I：异巴西红厚壳素）。

3.如权利要求1或2所述的结构式（I）化合物和载体在制备抗生素中增敏活性成分的应用，所说的抗生素为-内酰胺类或氟喹诺酮类抗生素。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物，可以为单独的药物，或为与内酰胺类或氟喹诺酮类抗生素联合使用的药物，或为与内酰胺类或氟喹诺酮类抗生素混合制备而成的药物。