CN103877101A

CN103877101A - 葫芦素在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN103877101A
Application number: CN201410089854.1A
Authority: CN
Inventors: 杨宝峰; 张妍; 杜智敏; 王立波; 朱久新; 朴贤美; 吴立军
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2014-06-25

Abstract

本发明涉及葫芦素在制备抗肿瘤药物中的应用，具体涉及葫芦素为葫芦素B或葫芦素D中的一种或二者的组合物在制备通过抑制血管新生或者诱导细胞凋亡进而抗肿瘤的药物中的应用。本发明通过常规工艺可制备成多种剂型，如片剂、散剂、胶囊剂、混悬剂、糖浆剂、口服液、软膏剂、贴剂、注射剂。可以单独给药或者联合治疗，用于抑制血管新生、诱导细胞凋亡而抗肿瘤。

Description

葫芦素在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及葫芦素在制备抗肿瘤药物中的应用，具体涉及葫芦素B或葫芦素D中的一种或二者的组合物在制备通过抑制血管新生或者诱导细胞凋亡进而抗肿瘤的药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

葫芦素（Cucurbitacins）属于19-甲基出现在C-9位上的一类四环三萜化合物，主要分布于葫芦科植物中，在十字花科、玄参科、秋海棠科、杜英科、四数木科等高等植物及一些大型真菌中也有发现。中国科学院昆明植物所研究员邱明华带领科技人员在发现的一系列新型葫芦素的基础上，研究了229个几乎所有的葫芦素类化合物，提出了新的结构分类模式，由此前的5类结构类型重新分为12类，得到了国际学术界的认可。目前，我国批准生产的葫芦素又叫葫芦素BE，为中药甜瓜蒂（别名：苦丁香）提取物，主要含葫芦素B、E等成分，现有的提取物中葫芦素B含量为60%以上，其质量标准收载于我国部颁标准中（标准编号：WS3-B-3711-98，第十九册，P223～224）。葫芦素片用于治疗慢性肝炎（葫芦素片，药学通报1986,21(6):357），经上海、北京、重庆等地十三家医院临床，其有效率为75.2%，显效率为44.6%。临床上观察到葫芦素片能较全面地改善慢性肝炎常见症状和主要体征，并有明显的降酶（S-GPT）、降浊（TTT、ZnTT）和降胆红质作用，停药后不引起S-GPT反跳，对蛋白倒置和高球蛋白血症也有明显的纠正作用，还能提高慢性肝炎患者的非特异性细胞免疫能力，无明显毒副作用。除此以外，葫芦素片还能用于治疗原发性肝癌，经上海、北京、广西等地六家医院临床观察，统计169例，有效率69%，显效率39%。临床观察表明，该药与5-氟脲嘧啶比较，其改善症状、消除肝痛、缩小瘤体、延长生存期、恢复体力等方面均优于对照组，且无一般化疗药物的毒副作用（治疗肝炎、肝癌新药葫芦素片，中草药，1987,18(10):21；葫芦素治疗原发性肝癌50例临床观察，新药与临床，1984,3(2):21-22；葫芦素的药理与临床应用，中草药，1992,23(11):605-608）。最近有作者将葫芦素片与化疗药联合，治疗中晚期肝癌，中位生存期由单一化疗药的6.1±7.12月，提高到12.5±7.54月（葫芦素片加化疗药治疗中晚期原发性肝癌的临床疗效观察，癌症，1989,8(6):434-436）；另有文献发现葫芦素B，E对鼻咽癌细胞具有较强的杀伤作用；有文献指出，长疗程用药（6周）能明显抑制肝纤维组织增生，防止肝脂肪变性以及肝硬变的形成和发展。现有专利多为与剂型相关的专利，如“纳米葫芦素制剂药物及其制备方法，申请号：0110358.3”、“葫芦素环糊精包合物及其制剂，申请号：02153647.3”、“葫芦素脂质体组方及其制剂，申请号：02144633.4”、“葫芦素滴丸及其制备方法，申请号：200310100943.3”。最近公开了一项新用途专利“200610046738.7”，将葫芦素用于升白和与化疗药物联合治疗，逆转化疗药物的降白作用。尽管诸多研究表明葫芦素提取物可以用于肿瘤的治疗，但作用机制不详，造成药物用药剂量较大，不良反应多。麻醉狗急性试验表明，葫芦素混合物在6mg/kg时会导致狗的死亡。在大鼠亚急毒性试验中，剂量为2mg/kg，服用两个月后，会对动物心脏功能产生一定影响；当剂量增至5、10及15mg/kg时，可分别导致个别动物死亡及部分死亡，甚至是大部分死亡。随着剂量从0.12、0.3至0.9mg/kg的提高，动物会逐渐出现食欲减退，体重减轻，严重贫血，死亡等严重后果。明确药物的作用机制，可以增加用药的针对性，减少药物不良反应。

肝癌是指原发于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约60万，居恶性肿瘤的第五位。目前我国原发性肝癌发病人数约占全球肝癌病人的55%。肝癌已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。然而，由于肝癌细胞具有易侵入和易扩散等生物学特性，目前对于肝癌的治疗效果不容乐观。

血管新生（angiogenesis）是从已有血管发芽生成新血管的过程，对恶性实体肿瘤的生长、转移乃至预后都有着极其重要的意义。血管生成是恶性实体肿瘤突破上皮基底膜后进一步生长所必须的。肿瘤中新形成的血管具有其自身独特的结构特点。多数学者认为，新生血管的结构特点使恶性肿瘤组织发生远处转移成为可能。因此，恶性实体肿瘤中新生血管的定量被认为是一种重要的独立的预后标志。现有研究结果未见有关将“葫芦素B或葫芦素D”、通过抑制血管新生而抑制肿瘤的报道。

发明内容

针对现有技术，本发明申请保护葫芦素的一种新的用途，即葫芦素在制备抗肿瘤药物中的应用，具体涉及葫芦素B或葫芦素D中的一种或二者的组合物在制备通过抑制血管新生或者诱导细胞凋亡进而抗肿瘤的药物中的应用。葫芦素为葫芦科、十字花科、玄参科、秋海棠科、杜英科、四数木科植物及其大型真菌中提取的一类四环萜类化合物。

本发明中，所述葫芦素的有效成分为葫芦素B和葫芦素D，其中，葫芦素B和葫芦素D抑制人脐静脉内皮细胞增殖的半抑制浓度分别为0.037μM和0.28μM；本发明葫芦素B和葫芦素D诱导细胞凋亡和抑制新血管生成的有效给药剂量均为1μM。

本发明通过常规制备工艺可加工成多种剂型，如片剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、糖浆剂、口服液、软膏剂、贴剂、注射剂；本发明的给药途径包括外用、口服或者注射。可以单独给药也可以联合治疗，通过抑制新血管生成和诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤扩散和癌细胞转移。

附图说明

图1为葫芦素B和D对人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）活力的影响；

图2为葫芦素B和D对新生血管的影响图；

图3为葫芦素B和D对人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的影响图；

图4为葫芦素B和D对Bax,Bcl-2,活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白表达的影响，其中图A为葫芦素B，图B为葫芦素D，1为活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，2为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1葫芦素B（CuB，检测纯度大于97%）和葫芦素D(CuD）体外抑制细胞增殖的药效学试验

1、将人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）（购自ATCC）置于96孔板中，调整细胞浓度为每孔1×10⁴个，并在每孔加入200μL培养液，恒温37℃培养过夜；

2、将CuB和CuD以PBS溶解至不同浓度并加至上述细胞培养液中培养12h；

3、将MTT储备液加至上述细胞培养液中，于37℃在黑暗处培养4h；

4、移去培养液并加入一定量的DMSO后，室温下震荡15min，并于490nm处测定各样品的吸收。

结果见图1和表1；由图1可知，CuB和CuD可抑制HUVEC的增殖并且该作用成剂量依赖性；由表1可知，CuB和CuD抑制HUVEC增殖的IC₅₀值分别为0.037μM和0.28μM。

表1CuB和CuD抑制HUVEC增殖的IC₅₀值

实施例2葫芦素B（CuB，检测纯度大于97%）和葫芦素D（CuD）体外抑制毛细管样结构形成的药效学试验

1、将人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）置于具有基底膜基质的24孔板中，并以含有CuB和CuD的血管新生抑制剂，于37℃、5%CO2的湿润培养箱中培养过夜；

2、12h后移去死亡细胞，将细胞染色，以PBS清洗后后拍下细胞图片；

3、使用Image-Pro软件测定新血管生成水平并与对照组进行比较；

结果见图2，由图2可知，以VEGFR3(血管内皮生长因子受体3)抗体FLT4为阳性对照，在浓度为1000nM时，CuB和CuD能显著抑制新血管生成。

实施例3葫芦素B（CuB，检测纯度大于97%）和葫芦素D(CuD）体外诱导细胞凋亡的药效学试验

1、将人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）以CuB和CuD培养12h后，以流式细胞术检测细胞凋亡；

2、将人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）以不同浓度CuB和CuD培养12h后，将细胞进行TUNEL染色。观察细胞颜色并拍下细胞倒置的荧光显微镜下的形态图片；

结果见图3，由图3可知，随着CuB和CuD剂量的增加，其诱导HUVEC凋亡的能力也相应增加。

实施例4葫芦素B（CuB，检测纯度大于97%）体外对细胞凋亡的药效学试验

1、将人体脐静脉内皮细胞（HUVEC）置于无血清的细胞培养基培养12h后，分别以不同浓度的CuB再培养12h后进行细胞裂解；

2、HUVEC细胞裂解产物悬浮于细胞裂解液中，并以BCA法测定蛋白浓度；

3、使用Western-blot检测细胞裂解液中与凋亡相关蛋白的表达；

结果见图4，由图4可知，CuB和CuD能增加活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase3）和Bax蛋白的表达，降低B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase3）的表达，结果显示，CuB和CuD可促进HUVEC的凋亡。

Claims

1.葫芦素在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述葫芦素在制备通过抑制血管新生或者诱导细胞凋亡进而抗肿瘤的药物中的应用，其中，葫芦素为葫芦素B或葫芦素D中的一种或二者的组合物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葫芦素为葫芦科、十字花科、玄参科、秋海棠科、杜英科、四数木科植物或大型真菌中提取的一类四环萜类化合物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葫芦素B和葫芦素D抑制人脐静脉内皮细胞增殖的半抑制浓度分别为0.037μM和0.28μM。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葫芦素诱导细胞凋亡和抑制新血管生成的有效给药剂量均为1μM。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葫芦素结合医学上可接受的载体通过常规制备工艺可加工成片剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、糖浆剂、口服液、软膏剂、贴剂或注射剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葫芦素的给药途径包括外用、口服或者注射。