CN115337313A - 葫芦素E在制备通过FAK/AKT/GSK3β通路治疗脑胶质瘤药物中的应用 - Google Patents

葫芦素E在制备通过FAK/AKT/GSK3β通路治疗脑胶质瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及葫芦素E在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。本发明公开了葫芦素E在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用，具体涉及葫芦素E在制备通过FAK/AKT/GSK3β通路治疗脑胶质瘤药物中的用途。本发明发现葫芦素E能显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖，具有开发抗脑胶质瘤药物的应用前景。

Description

葫芦素E在制备通过FAK/AKT/GSK3β通路治疗脑胶质瘤药物中 的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及葫芦素E在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用，具体涉及葫芦素E在制备通过FAK/AKT/GSK3β通路治疗脑胶质瘤药物中的应用。
背景技术
脑胶质瘤是最常见的原发性颅内脑瘤之一，其侵袭性强、术后复发快、死亡率高，被认为是神经外科最棘手的早亡实体瘤之一。世界卫生组织(World HealthOrganization，WHO)按照恶性程度由低到高将脑胶质瘤依次分为I级、II级、III级和IV级，其中IV级多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme，GBM)是最常见的恶性原发性脑肿瘤，5年生存率仅为7.2％。
目前脑胶质瘤的治疗仍然是医学上的一个难题，其治疗方法主要包括手术切除、放射治疗、化学治疗和免疫治疗等，但效果却不尽人意，其术后复发快、变异多且预后差，几乎无法达到临床治愈，多药耐药性和高复发率是成功治疗的两大阻碍。
随着天然药物的蓬勃发展，中药单体的抗肿瘤作用逐渐受到大家的重视。葫芦素E(Cucurbitacine，CUE)来源于葫芦科植物，是葫芦素家族中的一种四环三萜类化合物，具有抗炎、抗病毒和抗癌等多种药理功能。据多项研究报道，葫芦素E不仅能抑制胃癌、肝癌、肺癌和结肠癌等癌细胞的增殖，还能诱导多种癌细胞凋亡和G2/M期阻滞，然而葫芦素E对脑胶质瘤的作用及机制还不清楚。
发明内容
针对上述背景技术所提，本发明的目的在于提供一种葫芦素E在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。在本发明中，通过体外细胞活性实验证实了葫芦素E对于脑胶质瘤细胞增殖具有抑制作用，葫芦素E是通过FAK/AKT/GSK3β通路达到治疗脑胶质瘤的目的。具体而言，葫芦素E是通过抑制EGF介导的FAK/AKT/GSK3β磷酸化以抑制脑胶质瘤细胞增殖而达到治疗脑胶质瘤的目的。此外，葫芦素E还能抑制脑胶质瘤细胞中PCNA、KI67、CyclinB1和CyclinD1蛋白的表达。
为实现上述目的，本发明具体采用如下技术手段：
本发明提供了葫芦素E在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述治疗肿瘤药物的有效活性成分为葫芦素E，所述肿瘤为脑胶质瘤。
进一步地，所述药物中葫芦素E通过FAK/AKT/GSK3β通路治疗脑胶质瘤。
进一步地，所述药物能够抑制脑胶质瘤细胞的增殖。
进一步地，所述药物抑制脑胶质瘤细胞增殖是葫芦素E通过抑制EGF介导的FAK、AKT和GSK3β活性而达到的。
进一步地，所述药物由葫芦素E和药学上可接受的辅料和/或赋形剂组成。
进一步地，所述药物中葫芦素E的质量百分含量为1％-99％。
进一步地，所述药物的剂型为片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液或气雾剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明主要侧重降低脑胶质瘤细胞中FAK、AKT、GSK3β磷酸化表达的抗胶质瘤药物研究。本发明发现葫芦素E能够显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖，提示葫芦素E有望作为抗脑胶质瘤药物进行开发。
附图说明
图1为CUE抑制脑胶质瘤细胞增殖实验结果柱形图。
图2为CUE抑制脑胶质瘤细胞中KI67蛋白表达结果荧光图。
图3为CUE下调脑胶质瘤细胞中FAK/AKT/GSK3β蛋白磷酸化表达实验结果图。
图4为CUE抑制脑胶质瘤细胞中PCNA、CyclinB1和CyclinD1蛋白表达实验结果图。
图5为CUE阻断脑胶质瘤中EGF诱导FAK/AKT/GSK3β通路磷酸化表达实验结果图。
图6为CUE通过EGF介导的FAK/AKT/GSK3β信号通路抑制脑胶质瘤细胞的增殖实验结果柱形图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书所使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非用于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1 CCK8检测细胞活性实验
本发明采用脑胶质瘤细胞株U87-MG和U251-MG作为研究对象，研究葫芦素E对脑胶质瘤细胞增殖的影响。用不同浓度(0，0.01，0.025，0.25，2.5，25μM)CUE处理细胞，培养24小时后，加入CCK8(购买于同仁化学公司)反应2h，观察CUE对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用，从图1中可观察到CUE的浓度越高，对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用越强。为了进一步检测CUE作用不同时间对细胞活力的影响，选用2.5μM(IC50)CUE分别处理细胞24h、48h、72h，检测后发现CUE以剂量依赖性和时间依赖性的方式显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖，抑制时间越长，抑制效果越明显(如图1所示)。
实施例2细胞免疫荧光实验
本发明采用脑胶质瘤细胞株U87-MG和U251-MG作为研究对象，研究葫芦素E对脑胶质瘤细胞中KI67蛋白表达的影响。将细胞接种在12孔板中，贴壁后，加入2.5μM CUE处理24h。用预冷的PBS清洗3次，加入4％多聚甲醛固定15min。固定之后，再次用预冷的PBS清洗3次，再加入0.25％Triton-100(0.25％Triton X-100in PBS)破膜10min。随后，用1％BSA的PBST(0.1％Tween-20)进行封闭。封闭过后，每孔加入200μL ki67抗体(cat.no.27309-1-AP；Proteintech,Wuhan,China)，放于4℃湿盒中过夜孵育。经PBS洗涤后，加入山羊抗鼠荧光二抗(cat.no.ab150080)孵育1h，再用DAPI进行细胞核染色，在倒置荧光显微镜下进行荧光信号检测，从图2中可观察到CUE抑制脑胶质瘤细胞中KI67蛋白的表达。
实施例3 CUE下调脑胶质瘤中FAK/AKT/GSK3β蛋白磷酸化的表达
本发明采用脑胶质瘤细胞株U87-MG和U251-MG作为研究对象，研究葫芦素E对脑胶质瘤细胞中FAK/AKT/GSK3β蛋白磷酸化表达的影响。使用2.5μM CUE刺激细胞不同时间点(0，0.5，1，2，8，24h)后，用Western Blot检测细胞中FAK、AKT和GSK3β蛋白磷酸化表达的变化，从图3中可观察到CUE处理时间越长，对脑胶质瘤细胞中FAK/AKT/GSK3β蛋白磷酸化表达抑制作用越强。
实施例4 CUE抑制脑胶质瘤中PCNA、CyclinB1和CyclinD1蛋白的表达
本发明采用脑胶质瘤细胞株U87-MG和U251-MG作为研究对象，研究葫芦素E对脑胶质瘤细胞中PCNA、CyclinB1和CyclinD1蛋白表达的影响。使用2.5μM CUE刺激细胞不同时间点后，用Western Blot检测细胞中PCNA、CyclinB1和CyclinD1蛋白表达的变化，从图4中可观察到CUE处理时间越长，对脑胶质瘤细胞中PCNA、CyclinB1和CyclinD1蛋白表达抑制作用越强。
实施例5 CUE阻断脑胶质瘤中EGF诱导FAK/AKT/GSK3β通路磷酸化表达
本发明采用脑胶质瘤细胞株U87-MG和U251-MG作为研究对象，研究葫芦素E是否通过抑制FAK/AKT/GSK3β信号通路来调控脑胶质瘤细胞的增殖。用2.5μM CUE刺激细胞后，再用20ng/mL的EGF激活脑胶质瘤细胞中FAK、AKT和GSK3β磷酸化的表达，用Western Blot检测细胞中FAK、AKT和GSK3β蛋白磷酸化表达的变化，从图5中可观察到CUE可以抑制EGF所诱导的FAK、AKT和GSK3β磷酸化水平。
实施例6 CUE通过EGF介导的FAK/AKT/GSK3β信号通路抑制脑胶质瘤细胞的增殖
本发明采用脑胶质瘤细胞株U87-MG和U251-MG作为研究对象，研究CUE是否通过EGF介导的FAK/AKT/GSK3β信号通路抑制脑胶质瘤细胞的增殖。在EGF存在或不存在的情况下，用2.5μM CUE处理细胞72h后，加入CCK8反应2h进行检测，从图6中可以观察到CUE可以明显抑制EGF诱导的脑胶质瘤细胞的增殖。同理，在EGF存在或不存在的情况下，用10μM FAK抑制剂PF-562271处理细胞72h后，加入CCK8反应2h进行检测，从图6中可以观察到FAK抑制剂PF-562271也能明显抑制EGF诱导的胶质瘤细胞的增殖。
以上所描述的实施例仅表达了本发明的几种优选实施例，其描述较为具体和详细，但并不用于限制本发明。应当指出，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种变化和更改，凡在本发明的构思和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.葫芦素E在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述治疗肿瘤药物的有效活性成分为葫芦素E，所述肿瘤为脑胶质瘤。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中葫芦素E通过FAK/AKT/GSK3β通路治疗脑胶质瘤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物能够抑制脑胶质瘤细胞的增殖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物抑制脑胶质瘤细胞增殖是葫芦素E通过抑制EGF介导的FAK、AKT和GSK3β活性而达到的。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物由葫芦素E和药学上可接受的辅料和/或赋形剂组成。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物中葫芦素E的质量百分含量为1％-99％。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液或气雾剂。
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