CN108113993A - 一种葫芦素d在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葫芦素D在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用，葫芦素D对恶性胶质瘤细胞系A172、U‑87MG、U‑251MG的半抑制浓度为700nM、150nM、200nM，在250nM、500nM两个浓度下能对胶质瘤细胞的迁移和增殖有不同程度的抑制，还会降低ATP酶活力从而影响其代谢水平，阻滞细胞周期以及诱导凋亡。为恶性脑胶质瘤的治疗提供了一种新的化疗药物的备选方案。

Description

一种葫芦素D在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种葫芦素D在制备抗胶质瘤药物中的应用。

(二)背景技术

恶性胶质瘤(Glioblastoma，GBM)是中枢神经系统肿瘤中恶性度最高的一种，其患者五年以上生存率低于10％。胶质瘤生长特点为浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，所以理论上手术无法完全切除，依旧存在治疗困难和术后预后性差等问题。尽管十年以来对恶性胶质瘤的治疗手段有所进步，就目前来说化疗依旧是治疗该疾病最为成熟的方法。但是就目前的临床应用来看，传统化疗药物还存在副作用大，肿瘤抗药性以及无法穿透血脑屏障等问题。所以目前急需一种效果更强、对正常细胞毒副作用更小的小分子药物来治疗恶性胶质瘤。

近年以来，生物学家研究了大量从草药中提取出来的混合物作为一种新的抗癌药物来源，而且已经有数种天然产物被证实对多种癌症，如白血病、宫颈癌、卵巢癌具有明显的抗癌左右。葫芦素是从葫芦科植物中提取的一种四环三萜类植物类固醇，在中医上已被广泛应用多年。最初葫芦素是作为一种治疗慢性肝炎和肝癌的有效成分，进一步研究表明葫芦素类似物葫芦素B,D,E,I,Q通过周期阻滞和诱导凋亡作用对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、生长的作用。

葫芦素D作为近年新分离的一种三萜类葫芦素已经被发现对宫颈癌、乳腺癌具有一定的抗癌的作用。目前葫芦素D在药物研究中，尚未有其对恶性胶质瘤的抗癌作用的报道。经过我们的长期研究，我们发现葫芦素D可以作为一种活性物质，对恶性胶质瘤有一定的治疗作用。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种葫芦素D的新应用，具体为葫芦素D在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种葫芦素D在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用。

进一步，所述胶质瘤细胞为胶质瘤细胞U-87MG、胶质瘤细胞U-251MG或胶质瘤细胞A172。

所述葫芦素D结构式如下：

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明提供一种葫芦素D在制备抗胶质瘤活性抑制剂中的应用，具体的体现在葫芦素D对恶性胶质瘤细胞系A172、U-87 MG、U-251 MG的半抑制浓度为700nM、150nM、200nM，在250nM、500nM两个浓度下能对胶质瘤细胞的迁移和增殖有不同程度的抑制，还会降低ATP酶活力从而影响其代谢水平，阻滞细胞周期以及诱导凋亡。为恶性脑胶质瘤的治疗提供了一种新的化疗药物的备选方案。

(四)附图说明

图1是葫芦素D对三种胶质瘤细胞系细胞增殖抑制作用的量效关系曲线图。

图2是葫芦素D作用下三种胶质瘤细胞系细胞生长曲线。

图3是葫芦素D对三种胶质瘤细胞系的细胞形态影响的光镜图。

图4是葫芦素D对胶质瘤细胞迁移能力的影响，a、b、c分别为A172、U-87MG、U-251MG在不同时段、不同葫芦素D浓度处理情况下划痕宽度的光镜照片，d为对三种细胞迁移距离的统计图。

图5是葫芦素D对U-87MG、A172细胞侵袭能力的影响，a为U-87MG、A172 Transwell实验结果的明场光镜照片，b为不同浓度葫芦素D处理下视野中两种细胞数目的统计图。

图6是葫芦素D对U-87MG、A172细胞增殖能力的影响，a为为U-87MG、A172 BrdU实验结果的免疫荧光照片，b为两种细胞不同浓度葫芦素D处理下视野中阳性细胞所占比例的结果统计图。

图7是葫芦素D对U-87MG、A172细胞系细胞凋亡的影响，a为流式细胞仪检测凋亡的结果图，b为不同浓度葫芦素D处理下U-87MG、A172细胞晚期凋亡细胞所占比例的统计图，c为不同浓度葫芦素D处理下U-87MG、A172细胞早期凋亡细胞所占比例的统计图。

图8是葫芦素D对U-87MG、A172胶质瘤细胞系信号通路的影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：葫芦素D对胶质瘤细胞U-87MG增殖和毒性的影响

用含10％胎牛血清的DMEM培养基配制胶质瘤细胞U-87MG(购自ATCC)，加入96孔板中，每孔100μl(5000个细胞/孔)的。将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO₂)。分别向培养板的孔中加入含有终浓度0.05μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、1μM葫芦素D的含10％胎牛血清的DMEM培养基，每孔200μl。将培养板在培养箱孵育48小时。弃去培养基换成含有10％CCK8的DMEM培养基。将培养板在培养箱内孵育1小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)。以不含胶质瘤细胞U-87MG和葫芦素D，含CCK8的培养孔为空白对照，以不含葫芦素D，含胶质瘤细胞U-87MG和CCK8的培养孔为阴性对照。

活力计算：细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

A(加药)：含胶质瘤细胞U-87MG、CCK8和葫芦素D的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK8而没有胶质瘤细胞U-87MG和葫芦素D的孔的吸光度

A(0加药)：具有胶质瘤细胞U-87MG、CCK8而没有葫芦素D的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

同样条件下，分别用胶质瘤细胞系A172、U-251MG代替U-87MG进行试验，结果如图1所示，葫芦素D对性胶质瘤细胞系A172、U-87MG、U-251MG的半抑制浓度分别为700nM、150nM、200nM。

实施例2：葫芦素D对不同种类胶质瘤细胞增殖的抑制

用含10％胎牛血清的DMEM培养基在96孔板中配置100μl的胶质瘤细胞U-87MG(5000个/孔)。将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO₂)。向培养板加入含有0.5μM葫芦素D的含10％胎牛血清的DMEM培养基，每孔200μl，以加入等量PBS替代葫芦素D的含10％胎牛血清的DMEM培养基作为对照。将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(0-6天)，每天在固定时间对加入和未加入药物的孔板中的细胞进行计数并绘制生长曲线。

同样条件下，分别用胶质瘤细胞系A172、U-251 MG代替U-87 MG进行试验，结果如图2所示，未经药物处理的细胞数目正常增加，而被葫芦素D处理的细胞几乎没有增殖。

实施例3：BrdU标记法分析葫芦素D对细胞增殖的影响

1、细胞样品的准备：

取对数生长的U-87 MG细胞，培养至汇合度为70％时，分别加入终浓度0.25μM、0.5μM葫芦素D继续培养48h。

2、BrdU标记：

A.48小时后加入终浓度为90g/L的BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)，于37℃环境中孵育2小时。

B.培养基孵育2小时后，弃培养基，PBS清洗细胞2次，每次5分钟。

3、细胞固定化：

每孔加入200μl细胞固定液(4％多聚甲醛)室温孵育30分钟，弃固定液。PBS清洗3次，每次5分钟。

4、HCl固定：

向步骤3的培养孔中每孔加入足以覆盖细胞的2M的HCl水溶液，于37℃环境中孵育20分钟后，PBS清洗2次，再每孔加入足以覆盖细胞的pH8.5、0.1M硼酸缓冲液静置孵育10分钟，PBS清洗3次。

5、封闭：

用5％的羊血清室温封闭1小时。

6、孵育一抗、二抗

一抗(小鼠BrdU单抗)孵育4℃过夜，PBS洗涤3次后，孵育二抗(goat-anti-mouseIgG1(r1),594)1小时，在二抗孵育结束前5分钟按照体积比1:10000的比例加入DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，PBS清洗三次。荧光显微镜下拍照。

同样条件下，以A172细胞代替U-87MG细胞进行试验，结果如图6所示，统计结果图6中b表示经过葫芦素D处理的U-87MG细胞与未加药处理的细胞相比增殖程度显著降低。

实施例4：葫芦素D对胶质瘤侵袭能力的影响

1、细胞样品的准备

将含有10％FBS的DMEM培养基换成无血清的DMEM培养基对健康生长的U-87MG细胞进行饥饿处理24h。将饥饿处理后的细胞消化下来后分别用含中浓度(0.5μM)和低浓度(0.25μM)葫芦素D以及不含葫芦素D的DMEM培养基重悬密度为25细胞/μl的细胞悬液，在transwell上室中(一类有通透性的杯状的装置，可以认为这是一种膜滤器(Membranefilters)，也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports))加入200μl细胞悬液。24孔板下室一般加入500μl含20％FBS DMEM培养基。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。常规培养24h。

在Lab-Tek载玻片小室(Chamber Slides)上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用PBS洗2遍载玻片。

2、染色观察

弃掉小室中的培养基之后，用棉签擦去上室中的细胞，用0.1％的结晶紫对膜下侧的细胞进行染色，染色后在显微镜下进行拍照，随机选取5个视野对细胞数目进行统计分析。

同样条件下，以A172细胞代替U-87MG细胞进行试验，结果如图5所示，统计结果图5中b表示经过葫芦素D处理的U-87MG细胞与未加药处理的细胞相比侵袭能力显著降低。

实施例5：葫芦素D对胶质瘤迁移能力的影响

1、细胞样品的准备

取对数生长的U-87MG细胞铺在六孔板中，细胞汇合度至80％左右时，用中号枪头进行划痕实验，PBS清洗2遍洗去漂浮的细胞，加入不含血清的分别含有中浓度(0.5μM)和低浓度(0.25μM)葫芦素D以及不含葫芦素D的DMEM培养基。

2、拍照观察

在显微镜下每隔24小时对划痕部位拍照，并对划痕宽度进行统计分析。

同样条件下，以A172、U251细胞代替U-87MG细胞进行试验，结果如图4所示，统计结果图4中d表示经过葫芦素D处理的U-87MG细胞与未加药处理的细胞相比迁移能力显著降低。

实施例6：通过细胞流式仪分析葫芦素D对细胞凋亡的影响

1、细胞样品的准备：

a.孵育6个6cm dish U-87MG细胞至70％-80％的汇合度，按照葫芦素D浓度分别为0，0.25μM，0.5μM加药后继续放回细胞培养箱中孵育。

b.加药48h后把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。注意：对于贴壁细胞，胰酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，从而导致细胞坏死的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳性，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。同时，胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA，因为EDTA可能会影响Annexin V与磷脂酰丝氨酸的结合。

c.加入步骤b中收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意：加入步骤b中的细胞培养液非常重要，一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC，导致染色失败。

2.AnnexinV/PI双染色：

将步骤c中收集的细胞重悬于100μl binding buffer，加入2μl Annexin-V-FITC(20ug/ml)，轻轻混匀，避光冰上放置15min。转至流式检测管，加入400μl PBS，每个样品临上机前加入1μl碘化丙啶染色液(PI，50μg/ml)，2分钟后完成流式检测。同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。单染Annexin V-FITC及PI的各一管作为阳性对照。染色完成后用滤网过滤样品，完成流式检测。同样条件下，以A172细胞进行试验。

3.流式检测和分析：采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。结果如图7所示，统计结果图7中b、c表示经过葫芦素D处理的A172、U-87 MG细胞与未加药处理的细胞相比早期凋亡与晚期凋亡细胞比例显著增加。

实施例7：Western Blotting分析葫芦素D对细胞中相关基因及信号通路的影响1、蛋白样品制备及收集：

a、在6孔板中培养U-87MG细胞至健康状态，分别加入终浓度分别为0，0.25μM，0.5μM的葫芦素D，每种浓度各2孔，48小时后吸取培养液，用预冷的PBS洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

b、按1ml RIPA裂解液加10μl蛋白酶抑制剂及10μl磷酸酶抑制剂配制裂解混合液，摇匀置于冰上。

c、每孔细胞加400μl步骤b制备的裂解液混合液，在冰上裂解30分钟，为使细胞充分裂，培养瓶要经常来回摇动。

d、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

e、于4度下12000rpm离心5分钟。

f、将离心后的上清(即为蛋白样品)分装转移到1.5ml的离心管中。使用BCA试剂盒测蛋白浓度。

2、电泳：

a、样品处理

在收集的蛋白样品中加入5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5分钟。

b、上样与电泳

冷却到室温后，取20ul步骤a蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内，样品两侧泳道加入等体积1x loading buffer，Marker也用1x loading buffer调整至20ul(与样品等体积)。设置电泳装置，使用100V，15分钟，后再使用200V，30分钟，当溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

3、转膜：

a、组装转膜夹子：先将转膜夹子(一面为黑色)，衬垫，剪好的PVDF膜(预先用甲醇浸泡)和双侧滤纸在转移缓冲液中浸泡15分钟。然后在转移液中打开转膜夹子，先夹子黑面上依次放上衬垫、双侧滤纸、电泳完的凝胶、PVDF膜，双侧滤纸、衬垫，合上夹子。

b、转膜：将组装好的转膜夹子装入转移槽，夹子黑面对应转移槽黑色一侧。在转移槽中倒满转移液，两遍放入冰袋，将转移槽置于加满冰的泡沫盒中。接通电源，300毫安转移2小时。

4、封闭：

a、转膜完毕后，把PVDF膜放置到预先准备好的TBST液中，摇床上漂洗10分钟，更换TBST液后继续洗涤10分钟，共洗涤3次。

b、吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。

5、一抗孵育：

a、用BSA液将一抗P53按照1:5000，T-Erk按照1:5000，P-Erk按照1:5000，P38按照1:1000，GAPDH按照1:5000，-Actin按照1:5000稀释。吸去PVDF膜上的封闭液，加入配好的一抗缓冲液，摇床4℃缓慢摇动孵育过夜。

b、回收一抗。加入TBST液，在摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再更换洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。

6、二抗孵育：

a、用BSA液将辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔或鼠来源的二抗按照1:5000稀释。吸去PVDF膜上的洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温摇床上缓慢摇动孵育1H。

b、回收二抗。加入TBST液在摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。

7、显影成像：

将PVDF膜放入适合大小的盒子中，加入ECL发光液，完全覆盖PVDF膜，充分反应。用凝胶成像仪曝光保存蛋白条带图像。

同样条件下，以A172细胞进行试验，结果如图8所示，与未经过药物处理的对照相比，经过药物处理的U-87MG、A172的Akt1、Stat3、Erk1、P38、p-P38基因蛋白表达水平没有改变，但其中Akt1、Stat3、Erk1的磷酸化蛋白p-Akt1、p-Stat3、p-Erk1水平降低，P53基因蛋白表达水平增高，作为内参基因的GAPDH和β-actin没有变化。说明药物通过影响Akt、Erk、Stat信号通路从而抑制了肿瘤的增殖与迁移，通过P53信号通路诱导细胞凋亡。

Claims (2)

1.一种葫芦素D在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述胶质瘤细胞为胶质瘤细胞A172、胶质瘤细胞U-87 MG或胶质瘤细胞U-251 MG。