CN104740621B - 一种抗肿瘤免疫原z5的制备方法及应用 - Google Patents
一种抗肿瘤免疫原z5的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤免疫原Z5的制备方法及应用，属于生物工程技术领域。本发明所提供的方法是在培养基中接种H22肝癌细胞同时加入香菇多糖进行共培养，培养结束后取出，反复冻融破碎细胞，离心分离后留取沉淀，最终获得抗肿瘤免疫原Z5。接种本发明所制备的免疫原的小鼠存活率可提高100％，胸腺指数和脾脏指数分别达到3.31、4.83，血清抗体效价达到51200×。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤免疫原Z5的制备方法及应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
目前我国肝癌患病人数逐年升高，香菇多糖作为一种具有良好生理活性的功能性因子，在肝癌患者的治疗与康复上具有重要意义。按照肿瘤病发位置的不同，肝癌分为原发性和继发性两大种，其具有长潜伏期、高度恶性、进展快、易转移、强侵袭性、起病隐匿、预后差等特点。
每年全世界新发现恶性肿瘤病人人数约为635万人，其中肝癌占到恶性肿瘤的4％即6万例，并且世界各地的肝癌发病率也在逐年上升。目前，肝癌已成为国内肿瘤死亡病因的第二位，每年约十三万患者死于肝癌。每年全世界因肝癌死亡的人数占所有因癌症死亡的人的人数的40％,致死率高。由于它是发生在代偿功能极强、体积巨大的肝脏中，说以过去一般性检查方法难以发现早期肝癌。一旦发现就常常已是中、晚期肝癌，失去了治疗的良机，所以肝癌患者的存活期往往很短。
LC是一种高度恶性的肿瘤，目前其治疗方法有中医中药治疗、西医的手术治疗、介入治疗、放射治疗、免疫治疗、基因治疗等方面。但是临床治疗效果不佳。现已形成以手术切除为主，其他非手术切除治疗措施(如：放射治疗、生物及免疫治疗、中药治疗等)为辅的治疗格局。迄今为止，对肝癌的研究仅在治疗上取得一定的成果，但是在肝癌的预防上仍是空白，目前采用的免疫治疗方法也只是应用到术后的恢复上，并没有真正的利用免疫系统从预防的角度防止肝癌的发生。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种抗肿瘤免疫原的制备方法，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种抗肿瘤免疫原的制备方法，该方法是在培养基中接种H22肝癌细胞同时加入香菇多糖进行共培养，培养结束后取出，反复冻融破碎细胞，离心分离后留取沉淀。
所述方法的步骤如下：
1)将对数生长期的小鼠H22肝癌细胞加入到RPMI1640培养液中，同时加入香菇多糖进行共培养，获得培养物；
2)将步骤1)所得的培养物进行反复冻融后，离心分离留取沉淀。
优选地，所述步骤1)所述小鼠H22肝癌细胞，接种数量为2～6.25×107个/mL；所述RPMI1640培养液，含有10％已灭活胎牛血清，使用量为1mL；所述香菇多糖，添加量为50～175μg/mL；所述共培养，培养温度37℃，培养时间为40-56h，CO2浓度为5％。
优选地，步骤2)所述反复冻融，是使用液氮反复冻融5次；步骤2)所述离心分离，是在4℃，4000r/min条件下离心5min。
所述方法的具体步骤如下：
1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞至细胞浓度为2～6.25×107个/mL，同时加入1mL 175μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养48h，培养结束后获得培养物；
2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。
所述方法用于肝癌免疫预防。
本发明获得的有益效果如下：
1.利用本发明所提供的制备方法制备出的免疫原接种小鼠可以有效的延长小鼠的存活率，相对于对照组，接种本发明所制备的免疫原的小鼠存活率可提高100％。
2.利用本发明所提供的制备方法制备出的免疫原接种小鼠可以有效的保护小鼠的免疫器官，相对于对照组，接种本发明所制备的免疫原的小鼠存的胸腺指数和脾脏指数分别达到3.31、4.83。
3.利用本发明所提供的制备方法制备出的免疫原接种小鼠可以有效的提高小鼠的细胞免疫，相对于对照组，接种本发明所制备的免疫原的小鼠脾淋巴细胞增殖指数12.44(ConA)、9.39(LPS)，巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数分别达到60％、3.1。
4.利用本发明所提供的制备方法制备出的免疫原接种小鼠可以有效的提高小鼠的体液免疫，相对于对照组，接种本发明所制备的免疫原的小鼠血清抗体效价达到51200×。
附图说明
图1为实施例1-7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数(**P<0.01vs模型组，*P<0.05vs模型组)。
图2为实施例1-7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率(**P<0.01vs模型组，*P<0.05vs模型组)。
图3为实施例1免疫成功小鼠血清抗体效价(*P<0.01vs模型组)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用小鼠H22肝癌细胞由北京301医院惠赠，其他所用仪器、材料、试剂和方法，未经特殊说明，均为本领域常规仪器、材料、试剂和方法，均可通过商业渠道获取。
实施例1
本实施例提供了一种抗肿瘤免疫原的制备方法，步骤如下：
1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞至细胞浓度为6.25×107个/mL，同时加入1mL 175μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养48h，培养结束后获得培养物；
2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。
实施例2
本实施例提供了一种抗肿瘤免疫原的制备方法，步骤如下：
1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞至细胞浓度为2～6.25×107个，同时加入1mL 50μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养48h，培养结束后获得培养物；
2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。
实施例3
本实施例提供了一种抗肿瘤免疫原的制备方法，步骤如下：
1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞至细胞浓度为2～6.25×107个/mL，同时加入1mL 100μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养48h，培养结束后获得培养物；
2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。
实施例4
本实施例提供了一种抗肿瘤免疫原的制备方法，步骤如下：
1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞至细胞浓度为2～6.25×107个/mL，同时加入1mL 175μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养40h，培养结束后获得培养物；
2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。
实施例5
本实施例提供了一种抗肿瘤免疫原的制备方法，步骤如下：
1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞至细胞浓度为2～6.25×107个，同时加入1mL 175μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养44h，培养结束后获得培养物；
2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。
实施例6
本实施例提供了一种抗肿瘤免疫原的制备方法，步骤如下：
1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞至细胞浓度为2～6.25×107个，同时加入1mL 175μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养52h，培养结束后获得培养物；
2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。
实施例7
本实施例提供了一种抗肿瘤免疫原的制备方法，步骤如下：
1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞2～6.25×107个/mL，同时加入1mL 175μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养56h，培养结束后获得培养物；
2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。
实施例8
1.小鼠的免疫
将实施例1-7已制备好的免疫原接种到小鼠体内，每组10只小鼠，每组小鼠各免疫3次，每周一次，免疫期间每天同一时间记录小鼠体重。所用小鼠为昆明种小白鼠，清洁级，6-8周，雌性，体重20-22g。
3周后，对各个免疫组以及模型组进行造模(1.6×106个H22细胞/只)处理。空白组用同剂量的生理盐水(0.2mL/只)处理。
2.免疫小鼠存活情况
小鼠造模后，记录前15天各组昆明小鼠的体重值；造模25天后，记录各小组昆明小鼠死亡的数目，并计算各实验组存活时间、生命延长率(increase in life span，ILS)及存活率。
3.免疫小鼠体指数
免疫后的小鼠中的一份经过造模20天后，采用断颈的手法处死各组小鼠并解剖小鼠，去除周围的结缔组织分离出小鼠的胸腺、脾脏以及肝脏。用分析天平分别称量各只小鼠的体重以及脾脏、胸腺和肝脏的重量，并计算出胸腺指数和脾指数。
4.巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的测定
(1)提前3天，配制无菌的6％可溶性淀粉肉汤，并向各组实验小鼠的腹腔注射肉汤，1ml淀粉肉汤/只。
(2)于3天之后，向各组实验小鼠的腹腔注射1％鸡红细胞悬液，每只0.5～1ml，然后轻轻揉动小鼠腹部。
(3)30min后，向各组小鼠的腹腔注射生理盐水，每只注射2ml，并轻柔小鼠腹部数次，用注射器吸出小鼠腹腔液，滴1滴于洁净载玻片上，推成薄片或涂片，晾干后甲醇固定4～5min。
(4)滴加瑞氏-吉姆萨染液，染色3min，用流水冲洗掉，不要晃动，以防细胞团破散，自然晾干，使用油镜观察。巨噬细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，核呈蓝色，而胞浆则呈红色。
(5)显微镜下及时计数100个巨噬细胞，记录吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和吞噬的鸡红细胞总数。按下列公式计算吞噬率和吞噬指数。
5.抗血清的制备
免疫成功后的小鼠进行眼球取血，并将小鼠的血液放置于1.5ml无菌离心管中，室温下静置约2h后，低温离心(4℃，3000r/min，10min)，将离心后的上清分装于200μl离心管内，每管50μl，-20℃储存备用。同时，空白组中正常健康小鼠也经眼球采血，制备空白血清。
6.免疫小鼠抗体效价测定
(1)抗原包被：抗原用包被液稀释，一般浓度为0.5-10μg/ml。96孔酶标板，每孔100μl，4℃包被过夜。
(2)洗涤：弃去包被液，用PBST洗涤3次，每孔250μl，每次洗涤3min。
(3)封闭：每孔100μl，37℃，1h。
(4)洗涤：弃去封闭液，用PBST洗涤3次，每孔250μl，每次3min。
(5)加抗体(抗体用保温液稀释)：
①空白对照：蒸馏水，100μl。
②阴性对照：加空白组小鼠的血清，400×，100μl。
③阳性对照：加各种免疫组血清，4000×，100μl。(1：4000倍稀释)
④样品稀释：将各组样品按倍比法用稀释液(1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800以及1:25600)，每孔100μl，放入细胞培养箱了，37℃，1h。
(6)丢弃去抗体溶液，用PBST洗涤3次，每孔250μl，每次洗涤3min。
(7)加酶标二抗：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，4000×，每孔100μl，37℃，1h.
(8)弃去酶标二抗溶液，用PBST洗涤4次，每孔250μL，每次洗涤3min。
(9)加底物溶液，每孔100μl，室温下暗处放置30min。
(10)直接向各孔中加终止液，每孔50μl。
(11)使用酶标仪在495nm处检测，并记录数据。
7.淋巴细胞增殖效果测定
(1)采用眼球放血法处死小鼠，放入盛有75％酒精的烧杯中浸泡3-5min。
(2)取出小鼠放在无菌平皿中，放入超净工作台内，用剪刀剪开小鼠皮肤，打开腹腔，找到脾，用镊子分离剔除结缔组织和脂肪后摘除脾。
(3)制备脾细胞悬液。
1)将脾置于无菌平皿中，用RPMI-1640完全培养液洗涤。
2)另取一个含6ml完全RPMI-1640培养液的平皿，将一张大小适中的200目不锈钢网的中央浸没于液体中，再将洗涤后的脾置于不锈钢网上，一手用镊子持网，另一手用剪刀剪碎脾，并用注射器针芯挤压研磨脾组织，使分散的细胞通过网孔进入平皿内的液体中，获得粗制脾细胞悬液。
3)用吸管将细胞悬液转移到10ml离心管中，并用吸管轻轻吹打后自然沉淀3-5min(去除大块组织)；再用吸管将上层悬液细胞移入另一10ml离心管，4℃低速离心(1000-1500r/min，5-10min)；弃上清，重悬细胞。
(4)低渗去除红细胞：加入预冷Tris-NH4Cl红细胞裂解液1ml，轻轻吹打混匀，室温静置1-2min，溶解红细胞；加5mlRPMI-1640完全培养液终止反应。
(5)洗涤：4℃低速离心(1000r/min，5-10min)，重复2-3次，弃上清，最后将沉淀细胞重悬于2ml RPMI-1640完全培养液中。
(6)细胞计数后，用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为2×106/ml。
T淋巴细胞转化实验：取制备好的脾细胞悬液加入到96孔培养板中，每孔100μl，实验每孔加100μlConA(终浓度为5μg/ml)，对照孔加培养液100μl，均设3个复孔，置5％CO2培养箱中，37℃培养68h，之后1000r/min离心5min，弃上清。每孔加MTT溶液100μl，继续培养4h，离心弃上清。每孔加DMSO150μl，溶解Fomazan颗粒，充分震荡后静置20min，酶标仪570nm波长下读数，计算刺激指数(SI)，判断淋巴细胞增殖程度。
B淋巴细胞转化实验：方法参照T淋巴细胞转化实验的实验方案，其中把ConA试剂改换为LPS试剂，每孔的终浓度为10μg/ml。
8.检测结果
8.1免疫小鼠存活情况
利用实施例1-7所述制备免疫原免疫小鼠的存活情况如表1所示。由表1可知，利用本发明所提供方法制备的免疫原(实施例1)的小鼠存活率(100％)明显高于对照组和其他实验组，可100％预防小鼠肝癌的发生，实施例2、3也具有一定的免疫效果，两组小鼠的存活率均达到60％，其他组小鼠的存活率仅为0-10％。此外，利用本发明所提供方法制备免疫原(实施例1)免疫小鼠的生命延长率达到110.08％，实施例2、3的生命延长率分别为57.65％、62.94％，与模型组及其他实验组小鼠存在显著差异。说明本发明所提供方法制备的免疫原具有良好的免疫预防小鼠肝癌特性。
表1实施例1-7小鼠的生存状况(n＝5)
**P<0.01vs模型组，*P<0.05vs模型组
8.2免疫小鼠体指数
胸腺和脾脏是小鼠的重要免疫器官，其质量的大小可间接的反应小鼠免疫器官的功能，免疫细胞的数量和活化程度。利用实施例1-7所述制备免疫原免疫小鼠的小鼠体指数如表2所示。由表2可知，利用本发明所提供方法制备的免疫原(实施例1)免疫的小鼠体指数(胸腺指数3.31±0.59、脾脏指数4.83±0.24)明显高于模型组和实施例4-7实验组，接近于空白组小鼠。该结果说明免疫小鼠的胸腺和脾脏等免疫器官得到保护，进而保证了机体对癌细胞增殖的抑制效果。
表2各组小鼠体指数(n＝5)
**P<0.01vs模型组，*P<0.05vs模型组
8.3巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力
巨噬细胞是免疫效应细胞,具有免疫防御、免疫监视、免疫调节以及抗原呈递等多种免疫功能，在机体的免疫系统中尤其是对肿瘤免疫起重要作用。利用实施例1-7所述制备免疫原免疫小鼠的巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力如图1、2所示。由图1、2可知，利用本发明所提供方法制备的免疫原免疫小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力明显高于对照组和其他实验组。利用本发明所提供方法制备的免疫原免疫小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数可分别达到60％和3.1，与模型组的27％和1.2相比，具有显著性差异。
8.4抗体效价
抗体是机体的免疫系统在抗原刺激下，产生的可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。机体内针对某个抗原产生的特异性抗体的多少，反映机体对这一抗原产生的体液免疫的强弱。利用实施例1所述制备免疫原免疫成功小鼠的抗体效价如图3所示。由图3可知，利用本发明所提供方法制备的免疫原的抗体效价可达到51200×。该结果说明利用实施例1所述制备的免疫原具有激活小鼠体液免疫的功能。
8.5淋巴细胞增殖效果
脾淋巴细胞增殖指数可反映脾细胞被活化情况，只有活化的脾细胞才具有抑制癌细胞增殖的免疫能力。利用实施例1-7所述制备免疫原免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖情况如表3所示。由表3可知，利用本发明所提供方法制备的免疫原免疫小鼠的淋巴细胞增殖明显高于对照组和其他实验组。实施例1(本发明)小鼠脾淋巴细胞增殖指数可分别达到12.44±0.24(ConA)和9.39±0.35(LPS)，与模型组小鼠(ConA：1.87，LPS：1.63)相比，差异显著。因此，本发明所提供方法制备的免疫原可激活小鼠的细胞免疫。
表3脾淋巴细胞增殖实验结果(n＝5)
**P<0.01vs模型组，*P<0.05vs模型组
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种抗肿瘤免疫原Z5的制备方法，其特征在于，在培养基中接种H22肝癌细胞同时加入香菇多糖进行共培养，培养结束后取出，反复冻融破碎细胞，离心分离后留取沉淀；
所述加入香菇多糖，加入浓度为175μg/mL；所述共培养，共培养时间为48h。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)将对数生长期的小鼠H22肝癌细胞加入到RPMI1640培养液中，同时加入香菇多糖进行共培养，获得培养物；
2)将步骤1)所得的培养物进行反复冻融后，离心分离留取沉淀。
3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述小鼠H22肝癌细胞，接种量为2～6.25×107个/mL。
4.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述RPMI1640培养液，含有10％已灭活胎牛血清，使用量为4mL。
5.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述共培养，培养温度37℃，培养时间为48h，CO2浓度为5％。
6.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述反复冻融，是使用液氮反复冻融5次。
7.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述离心分离，是在4℃，4000r/min条件下离心5min。
8.权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)在4mL含有10％已灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，接种对数生长期的小鼠H22肝癌细胞至细胞浓度为2～6.25×107个/mL，同时加入1mL 175μg/mL的香菇多糖，在37℃，CO2浓度为5％的条件下培养48h，培养结束后获得培养物；
2)利用液氮反复冻融步骤1)所得培养物5次后，在4℃，4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留沉淀。
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