CN106729680A - 一种癌症疫苗制剂的制备方法及应用 - Google Patents

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曾令文
方志远
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Abstract

本发明提出了一种广谱的治疗性癌症疫苗制剂的制备方法，本发明所述治疗性肿瘤疫苗是根据肿瘤细胞体积较大这一特性，通过膜过滤法截获肿瘤细胞，然后超声破碎获得全肿瘤细胞抗原，并将破碎物通过与佐剂混合制备成治疗性肿瘤疫苗制剂。所得到的肿瘤疫苗制剂能够达到46.85％的抑瘤率，并且该方法操作简单，成本低廉，能够快速制备得到。

Description

一种癌症疫苗制剂的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及疫苗领域，特别是指一种癌症疫苗制剂的制备方法，本发明还涉及一种癌症疫苗制剂的应用。
背景技术
癌症，也称肿瘤，已经成为全球夺取生命最多的疾病，而关于癌症的治疗方法，主要有化疗，免疫疫苗等方式，化疗由于具有较强的副作用，对患者会造成非常大的损伤，而免疫疗法则由于其特异性，在制备方面难度更高，同时，针对不同的个人，也可能具有不同的药效。
发明内容
本发明提出一种癌症疫苗制剂的制备方法，具有制备快速，个性化更强，成本低，得到的产品排斥反应低等优势。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种癌症疫苗制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取患者血液；
(2)将血液经过过滤膜进行过滤；
(3)将过滤截留的癌细胞收集；
(4)将获得的癌细胞进行体外扩增；
(5)将扩增后的癌细胞进行破碎处理，得到破碎物；
(6)将破碎物与佐剂进行混合制备得到癌症疫苗。
优选的，取患者的血量5-25ml。
优选的，所述过滤膜包括聚碳酸酯膜。
优选的，所述过滤膜的孔径范围是4-30um，不同的细胞大小不一，而癌细胞的个体相对正常细胞更大，通过上述过滤膜及孔径范围的挑选，可以实现对癌细胞的截留。
优选的，步骤(2)中，过滤过程中其他参数的控制包括在室温条件下，以红细胞裂解液为样本稀释剂，pH保持在6.99-7.05。
优选的，细胞体外扩增条件的特征在于：将血液中的肿瘤细胞富集后进行后续的扩增培养，培养条件为37℃恒温，5％CO2浓度。
优选的，步骤(5)中，破碎的方式包括超声破碎法，破碎后，癌细胞被全部杀死，而其中所携带的表面抗原则依然保留，形成疫苗制剂的基础。
优选的，步骤(6)中，加入的佐剂为不完全弗氏佐剂，不完全弗氏佐剂配制方法：按1-5:1的比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用；佐剂与破碎物的配比为1：1，混合工艺为注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。
所述癌症疫苗制剂在癌症治疗中的应用。
本发明的所述癌症疫苗制剂的制备方法，通过细胞粒径、体积的大小不同，结合具体的操作工艺，实现对癌细胞的截留，并将癌细胞杀死而保留表面抗原，结合其他佐剂等形成癌症疫苗制剂，方法简单，易于推广，并且该方法得到的产品快速，便捷，同时，还具有极高的个体化适应性，降低了免疫排斥。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：细胞培养
实验材料：MCF-7细胞株、10％胎牛血清、请链霉素混合液。
试验方法：将MCF-7细胞株培养与含10％太牛血清、青霉素100IU/mL、链霉素100Χug/mL的培养液中(改良1640培养基)，于37℃、5％CO2培养箱中培养，带生长至对数期时，按3Χ104/mL与健康志愿者的外周血混合。
实施例2：肿瘤细胞的分离
实验材料：8um聚碳酸酯膜、25mL注射器
试验方法：将实施例1中得到的肿瘤细胞与外周血的混合液20mL与红细胞裂解液混合，然后通过8um聚碳酸酯膜过滤，弃去滤液，然后将聚碳酸酯膜用PBS进行冲洗，得到的洗涤液离心后用1％Triton-X100的PBS缓冲液重悬，然后进行超声破碎；对照组为不含肿瘤细胞的健康志愿者的外周血，以上述相同条件进行过滤、洗涤和超声破碎。最后将超声破碎无与佐剂进行混合制得肿瘤疫苗。
实施例3：抑瘤实验
实验材料：健康昆明系小鼠、MCF-7乳腺癌小鼠、小鼠乳腺癌细胞(MCF-7)，改良1640培养基(购自HyClone)，胎牛血清。
实验方法：
(1)建立荷瘤鼠模型：无菌操作取MCF-7乳腺癌小鼠腹水，台盼蓝染色计数，调整细胞浓度为1Χ107个/mL，于每只健康昆明系小鼠右腋皮下接种0.2mL，制成实体型荷瘤鼠模型。
(2)制备肿瘤疫苗：根据实施例1所示进行小鼠MCF-7细胞株的培养；将培养的细胞按照实施例2所述方法制成肿瘤疫苗及对照组。
(3)分组和治疗：将健康昆明系小鼠12只随机分为2组，每组各6只。空白组：肿瘤细胞接种当天，于小鼠腿根部皮下注射生理盐水；实验组：肿瘤细胞接种当天，与小鼠腿根部皮下注射肿瘤疫苗。每间隔1天重复1此，共3次。所有小鼠接种肿瘤后第15天处死，取瘤体，称重，计算瘤重抑制率。
(4)称取肿瘤重量并计算肿瘤抑制率处死小鼠取出瘤体后，剥离干净，用滤纸擦拭血污，电子天平称取瘤重，计算抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤大小-疫苗注射组肿瘤大小)/对照组肿瘤大小Χ100％
结果显示，空白对照组的肿瘤重量平均为(3.65+/-0.40)g，疫苗注射组肿瘤的平均重量为(1.94+/-0.22)g。这一结果说明注射肿瘤疫苗后，瘤体重量降低，抑瘤率达到46.85％，说明本专利所述肿瘤疫苗的制备方法可制备得到具有治疗活性的疫苗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种癌症疫苗制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取患者血液；
(2)将血液经过过滤膜进行过滤；
(3)将过滤截留的癌细胞收集；
(4)将获得的癌细胞进行体外扩增；
(5)将扩增后的癌细胞进行破碎处理，得到破碎物；
(6)将破碎物与佐剂进行混合制备得到癌症疫苗。
2.如权利要求1中所述癌症疫苗制剂的制备方法，其特征在于：取患者的血量5-25ml。
3.如权利要求1中所述癌症疫苗制剂的制备方法，其特征在于：所述过滤膜包括聚碳酸酯膜。
4.如权利要求3中所述癌症疫苗制剂的制备方法，其特征在于：所述过滤膜的孔径范围是4um-30um。
5.如权利要求4中所述癌症疫苗制剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，过滤过程中其他参数的控制包括在室温条件下，以红细胞裂解液为样本稀释剂，pH保持在6.99-7.05。
6.如权利要求1中所述癌症疫苗制剂的制备方法，其特征在于：将血液中的肿瘤细胞富集后进行后续的扩增培养，培养条件为37℃恒温，5％CO2浓度。
7.如权利要求1中所述癌症疫苗制剂的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，破碎的方式包括超声破碎。
8.如权利要求1中所述癌症疫苗制剂的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，加入的佐剂为不完全弗氏佐剂，佐剂与破碎物的配比为1：1，混合工艺为注射器混合法，从而获得癌症疫苗制剂。
9.如权利要求1-8中任一所述癌症疫苗制剂在癌症治疗中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102343086A (zh) * 2010-05-28 2012-02-08 四川大学 治疗或预防肿瘤的药物、肿瘤全细胞疫苗及其制备方法和用途
CN104740621A (zh) * 2015-03-25 2015-07-01 黑龙江八一农垦大学 一种抗肿瘤免疫原z5的制备方法及应用
CN105699641A (zh) * 2016-01-28 2016-06-22 山东省肿瘤防治研究院 一种外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法

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