CN105030794B - 恒河猴免疫抑制模型的建立 - Google Patents

Abstract

恒河猴免疫抑制模型的建立，本发明提供了环磷酰胺在制备恒河猴免疫抑制模型中的应用，通过选用不同剂量的环磷酰胺静脉注射恒河猴，确定适当的免疫抑制造模剂量，建立与人类免疫抑制状况下的各项免疫指标变化趋势一致的疾病模型，其中环磷酰胺的最佳用法和用量为：静脉注射，按体重一日约15mg/kg。本发明还提供了一种制备恒河猴免疫抑制模型的方法以及由该方法制备的免疫抑制动物模型。本发明动物模型可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药研发、免疫抑制机理研究、病毒感染模型建立等领域，为前述应用提供较啮齿类动物模型更为理想、可靠的实验动物模型及完善的评价体系。

Description

恒河猴免疫抑制模型的建立

技术领域

本发明具体涉及环磷酰胺在制备恒河猴免疫抑制模型中的应用以及恒河猴免疫抑制模型及其制备方法。

背景技术

动物疾病模型的建立与运用越来越广泛，目前多集中于啮齿类，但它们的生理机能和人类有很大的差距。利用非人灵长类动物恒河猴建立实验动物疾病模型具有无可比拟的优势，恒河猴在生化代谢、生殖生理特性及组织结构等方面与人类高度相似，并且与人类遗传物质上有98％左右的同源性。并且作为生物医学研究模型已有近百年的历史，如建立帕金森病、结核病、肝移植等疾病模型，数据十分丰富，早已被用作医学和生物学各领域研究的理想实验动物造模。

环磷酰胺是治疗恶性肿瘤最常用的烷化剂代表药物，具有广谱抗癌作用，是联合化疗、手术和放疗辅助化疗的常用药物之一，环磷酰胺的毒副作用主要是免疫抑制。机体注射环磷酰胺后可导致血生化、血常规、淋巴细胞亚群、细胞免疫因子等指标均表现出相应变化，呈现剂量依赖性变化。有文献表明大剂量的环磷酰胺会致机体肝肾功能损伤，Winkelstein等的文献报道低剂量的环磷酰胺能够增强机体的免疫功能。为有效评价保健食品在减轻化疗毒副作用中的功能，高芃等研究并报道了采用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型的方法。研究结果显示，高剂量的环磷酰胺能抑制机的体免疫功能，低剂量的环磷酰胺能够促进机体的免疫功能，不同的注射方式和灌胃方式对机体免疫功能的作用也不同，所以环磷酰胺对对机体所引起的双重作用主要取决于其用药的剂量和给药形式的不同。但目前而言环磷酰胺更多的是作为一种免疫抑制剂，并且已有大量研究表明其能抑制动物的细胞和体液免疫应答，造成动物的免疫抑制。

由于啮齿类动物与灵长类动物在生理机能等方面存在很大差异，高芃等建立的小鼠免疫抑制模型作为人用生物技术新药研发、人类免疫抑制机理研究和病毒感染模型建立等方面的评价体系，其可靠性存疑。另外，据检索，目前未见利用非人灵长类建立免疫抑制模型的相关报道。

发明内容

本发明的目的是建立恒河猴免疫抑制模型，为生物技术新药研发、免疫抑制机理研究、病毒感染模型建立等提供理想、可靠的实验动物模型及完善的评价体系。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：环磷酰胺在制备恒河猴免疫抑制模型中的应用，具体为将剂量为按体重一日15mg-30mg/kg的环磷酰胺施用于恒河猴。其中，环磷酰胺的优选剂量为按体重一日15mg/kg；施用方式优选静脉注射。

本发明还公开了一种制备恒河猴免疫抑制模型的方法，具体为将剂量为按体重一日15mg-30mg/kg的环磷酰胺施用于恒河猴。其中，环磷酰胺的优选剂量为按体重一日15mg/kg；施用方式优选静脉注射。

本发明还提供了由上述方法制备得到的恒河猴免疫抑制模型。

本发明还提供了一种评价潜在的提高机体免疫力的药物或保健品的方法，具体包括：

1)将环磷酰胺施用于恒河猴，施用方法为：隔日一次，连续4-5次，静脉注射给予环磷酰胺，施用剂量为：按体重15mg-30mg/kg/次。

2)将候选物施用于步骤1)所述的恒河猴；

3)用恒河猴免疫抑制模型评价潜在的提高机体免疫力的药物或保健品。

其中，步骤3)用于评价潜在的提高机体免疫力的药物或保健品的指标主要是通过血生化、血常规、流式细胞术、淋巴细胞增殖试验、荧光定量PCR技术检测得到的相关指标。

本发明动物模型可以用于啮齿类动物模型无法完成的生物技术新药研发、免疫抑制机理研究、病毒感染模型建立等领域，为前述应用提供较啮齿类动物模型更为理想、可靠的实验动物模型及完善的评价体系，具有良好的理论与应用价值。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

附图说明

图1.恒河猴淋巴细胞抑制率实验结果(备注：H：高剂量组，M：中剂量组，L：低剂量组的2号和3号动物，L1：低剂量组的1号动物；A：给药前与给药后相比差异极显著(P＜0.01)；a：给药前与给药后差异显著(P＜0.05)；B：给药前与停药后相比差异极显著(P＜0.01)；b：给药前与停药后相比差异显著(P＜0.05))。

图2.高剂量组H1给药前的CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺值。

图3.高剂量组HI给药后第5天的CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺值。

图4.低剂量组L1给药前的CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺值。

图5.低剂量组L1给药后第5天的CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺值。

图6.低剂量组L2给药前的CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺值。

图7.低剂量组L2给药后第5天的CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺值。

图8.恒河猴IL-2mRNA相对表达量荧光定量PCR实验结果。

图9.恒河猴IFN-γmRNA相对表达量荧光定量PCR实验结果。

图10.恒河猴TNF-αmRNA相对表达量荧光定量PCR实验结果(备注：H：高剂量组，M：中剂量组，L：低剂量组的2号和3号动物，L1：低剂量组的1号动物；A：给药前与给药后相比差异极显著(P＜0.01)；a：给药前与给药后差异显著(P＜0.05)；B：给药前与停药后相比差异极显著(P＜0.01)；b：给药前与停药后相比差异显著(P＜0.05))。

具体实施方式

实施例1恒河猴免疫抑制模型的建立

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

选取川西亚种健康恒河猴9只，平均体重3.5±0.5kg，平均年龄3-4岁，由四川农业大学实验动物工程技术中心/国家实验用恒河猴种源基地提供。动物生产许可证：SCXK(川)2013-22，动物使用许可证：SYXK(川)2013-105。

1.1.2实验试剂

环磷酰胺、刀豆蛋白(ConA)、生理盐水、血生化试剂盒、血常规试剂盒、RPMI--1640培养基、酒精、噻唑蓝(MTT)、PBS缓冲液、二甲基亚砜(DMSO)、青霉素、链霉素、犊牛血清、4％台盼蓝、Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC处理水、人体淋巴细胞分离液、SYBR-Green II荧光染料、RNA逆转录试剂盒、RNA提取试剂盒。

1.1.3实验仪器

电子天平、全自动血细胞分析仪(Beckman coulter LH750)、全自动生化分析仪(Olympus)、超净工作台、CO2细胞培养箱、光学生物显微镜(Olympus)、冷冻高速离心机、PCR管离心机、酶标仪(Bio-Rad)、脱色震荡床、漩涡震荡仪、数显恒温搅拌循环水箱、CFX96Touch Deep Well^TM Real-Time PCR Detection System(美国BIO-RAD公司)、全自动凝胶图象分析仪器(BM-Rad)、恒压电泳仪(Bio-Rad)、微波炉(格兰仕)、流式细胞仪器(美国DB公司)、实验室冰箱。

1.1.4实验器具及耗材

一次性注射器、4ml EDTA-K2真空抗凝管、100ml玻璃瓶、烧杯、10μl移液枪，200μl移液枪，1000μl移液枪、2.0ml EP管(RNase free)、一次性96孔细胞培养板、流式检测专用管、200μl PCR管(RNase free)、10μl枪头、200μl枪头、1000μl枪头(RNase free)；一次性PE手套、一次性帽子口罩、一次性塑料脱水盒、冰盒、0.2ml八连管等。

2.实验方法

2.1实验动物培养与取材

选9只体重相当(平均体重3.5±0.5kg)的健康成年(平均年龄3±0.5岁)恒河猴，随机标记成三组。分别为环磷酰胺30mg/kg的高剂量组(H1，H2，H3)，环磷酰胺15mg/kg的中剂量组(M1，M2，M3)，环磷酰胺5mg/kg的低剂量组(L1，L2，L3)。在实验开始前1周单笼喂养。给药前后每只实验动物分别静脉采集抗凝血5.0ml和全血2.0ml。每次给药均是将环磷酰胺溶解在2.0mL的灭菌生理盐水中。给药前采血一次(每次采血均为早上8:00，采血前一天，晚上8:00后禁止给动物投食和喂水直到第二天采血结束)，为正常组，采用实验动物自身前后对照。隔天给药，即给药后第1天、第3天、第5天、第7天。停药后每隔4天采血，采血两次，即停药第4天、第8天，观察动物的免疫恢复情况。每天观察动物的临床表现。

2.2血液学检测

用4ml的EDTA-K2真空抗凝管采集血常规检测用血500μl，立即在血液自动分析仪上测定试验所需要的各项指标。使用注射器静脉采集全血2ml，置于灭菌EP管中，离心机8000r/min，离心5min，吸取上层透明血清(切勿吸取到红细胞层)，放于-80℃保存待检测。同一实验室完成血清的所有检测项目和采用同一批号试剂。

2.3淋巴细胞增值试验

2.3.1淋巴细胞分离

血样标本用4.0ml的EDTA-K2真空抗凝管采集全血2.0ml。采集到的抗凝血2.0ml与RPMI-1640培养液等量稀释，然后小心将稀释后的血液加入已装有2.0ml淋巴细胞分离液的离心管中，缓慢匀速加入，保证淋巴细胞分离液与血液有明显的分层，然后放入低温高速离心机离心20分钟，2000r/min，取出离心管可见明显分层。使用移液枪将中间白色淋巴细胞层小心吸出，取2.0ml的PBS溶液洗涤吸取的淋巴细胞，小心吹散细胞，2000r/min离心20分钟，充分将淋巴细胞与淋巴细胞分离液洗脱。重复两次，注意轻轻吹散细胞，避免影响细胞活性。

2.3.2淋巴细胞培养

用0.4％台盼蓝拒染法，在光学显微镜下进行活淋巴细胞计数，调整活淋巴细胞浓度至105-106个/ml的单细胞悬液。将每只恒河猴的细胞悬液分两组加入96孔培养板中，每孔100μl。一组加含ConA的RPMI-1640完全培养基(链霉素100μ/ml，青霉素100μ/ml，小牛血清10％)100μl(相当于ConA的终浓度为5mg/L)为实验组，另一组加不含ConA的RPMI-1640100μl作为对照，培养3天。每组设5个重复孔，另设3个空白调零孔。

2.3.2终止淋巴细胞培养

DMSO终止培养，于培养结束前4h每孔加MTT(5.0mg/ml，采用PBS配制，pH＝7.4)20μl。继续孵育，直至培养结束，将悬浮细胞放置在96孔板离心机2000r/min，离心10min，离心后吸弃孔内上清液。每孔加200μl DMSO，脱色震荡床振荡10min，结晶物被充分融解。在570nm波长处测量各孔的吸光值，记录结果。

细胞生长抑制率(IR)＝(1-加药组吸光值/对照组吸光值)×100％。

2.4流式细胞术

流式细胞血样标本用4.0ml的EDTA-K2真空抗凝管采集全血500μL。根据样品数对流式检测专用管进行编号，另准备2个空白管；涡旋器混匀血样后取50μl抗凝静脉全血样于流式细胞测量管中，每管均加入CD3⁺和CD3⁺CD4⁺单抗各10μl，CD3⁺CD8⁺20μl(避光)，再用涡旋器混匀；放入冰箱保鲜室4℃反应30min(避光)；加入裂解液2000μl，涡旋器混匀；避光常温反应15min；离心机1000r/min，离心5min；弃上清液，加入PBS缓冲液1000μl，涡旋器混匀；离心机1000r/min，离心5min；弃上清液，加入PBS缓冲液500μl，过滤细胞；加500μL PBS上机，每一样本各检测10000个细胞，流式细胞仪测细胞阳性表达率，采用Cell Quest软件进行数据分析。

2.5荧光定量PCR

2.5.1淋巴细胞分离

血样标本用4.0ml的EDTA-K2真空抗凝管采集全血2.0ml。采集到的抗凝血2.0ml与RPMI-1640培养液等量稀释，然后小心将稀释后的血液加入已装有2.0ml淋巴细胞分离液的离心管中，缓慢匀速加入，保证淋巴细胞分离液与血液有明显的分层，然后放入低温高速离心机离心20分钟，2000r/min，取出离心管可见明显分层。使用移液枪将中间白色淋巴细胞层小心吸出，取2.0ml的PBS溶液洗涤吸取的淋巴细胞，小心吹散细胞，2000r/min离心20分钟，充分将淋巴细胞与淋巴细胞分离液洗脱。重复两次，注意轻轻吹散细胞，避免影响细胞活性。

2.5.2总RNA提取

取50μl的淋巴细胞于离心管中，加入1ml的Trizol静置5min，4℃12000r/min离心5min。将轻轻吸取的上清液，注入新的EP管中(切勿吸取沉淀)，向此EP管中加入Trizol的五分之一的体积量三氯甲烷(氯仿)，盖紧EP管，用手上下剧烈震荡，使溶液无分相，充分乳化，置于超净工作台内静置5min，然后12000r/min离心15min，4℃。取出EP管，此时匀浆分为三层，为有颜色的下层及有机相、中间的白色蛋白层、无色的上清液。在不吸取中间白色层的情况下轻轻的吸取上清液，注入另一新的EP管。把等体积的异丙醇加入上清液中，上下颠倒混匀溶液，在15℃-30℃下静置10min。然后4℃12000r/min离心10min，试管底部出现白色沉淀，弃去上清液，缓慢沿着离心管壁加入RNase-free ddH₂O配制的75％乙醇清洗RNA沉淀，4℃12000r/min离心3min后倾倒出乙醇并晾干(为更好的控制RNA中离子的含量，应尽量除尽乙醇)。室温下采用非离心式加热干燥沉淀2min-5min，保证RNA可溶解。适量的RNase-FreeddH₂O溶解沉淀，使用移液枪吹打沉淀，利于RNA的溶解，贮存于-80℃待用。

每次提取的RNA提取液均要检测里面是否溶有RNA。称取0.15g琼脂糖，溶解于10mlPBS电泳缓冲液中，加热至沸腾，反复沸腾冷却三次后加入1μl GoldView，混匀后灌制凝胶板(即制作用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA)。待凝胶冷却后，拔出梳子，取出凝胶，放置在倒有适量PBS缓冲液在电泳槽内，注意正负极。将2μl染液与5μl RNA样品与在EP手套上轻轻吹打混匀，然后小心点样，打开电泳仪开关，电泳约15min，关闭电源。小心取出凝胶于全自动凝胶图象分析仪器(Bio-Rad)上照相并分析。

2.5.3合成cDNA反转录反应体系：

在超净工作台内操作，严格按照说明书，使用反转录试剂盒(Takara)，在冰上加样，采用gDNA Eraser除去提取的RNA中的基因组DNA，去除基因组DNA反应体系见表1。然后反转录成cDNA并储存于-20℃，反转录体系见表2。

表1 去除基因组DNA反应体系

反应条件为：42℃静置2min(或者室温5min)，85℃终止反应，得到的去除基因组DNA的RNA保存于-4℃直至使用。

表2 反转录反应体系

反应条件为：37℃静置15min，85℃放置5sec终止反应，得到的cDNA保存于-20℃待使用。

2.5.4待测基因实时定量PCR

采用BIO-RAD CFX96序列检测系统来进行荧光定量PCR。严格按照说明书，使用0.2ml的八连管加样，先跑温度梯度选出每个因子的最适合温度。每个待测样品分别以内参基因β-action作为对照，并设立不加模板阴性对照，每个样品做三个重复组，三次得到的Ct值结果平均值为最终测定结果。反应体系见表3(试验加样均在超净工作台操作，冰上加样。)

表3 FQ-PCR反应体

表4 FQ-PCR反应条件

由大连宝生物工程有限公司合成引物，干扰素-γ、白介素-2、肿瘤坏死因子-α及内参β-action序列分别为：

IFN-gamma (F)5′-TCC AAC GCA AAG CAG TAC ATG A-3′，

(R)5′-CGA CCT CGA AAC ATC T GA CTC C-3′；

IL-2 (F)5′-CAC AGC TAC AAC TGG AGC ATT TAC T-3′，

(R)5′-GAT GTT TCA ATT CTG TGG CCT TC-3′；

TNF-alpha (F)5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT GCT-3′，

(R)5′-ATG GGC TAC AGG CTT GTC ACT T-3′；

ACTB (F)5′-AAG GAGAAG CTG TGC TAC GTC G-3′，

(R)5′-TGC CCA GGAAGG AAG GTT G-3′。

2.5.3扩增产物特异性检测

引物扩增的PCR产物特异性通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。即称取0.15g琼脂糖，溶解于10ml PBS电泳缓冲液中，加热至沸腾，反复沸腾冷却三次后加入1μl GoldView，混匀后灌制凝胶板，制作用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA。待凝胶冷却后，拔出梳子，取出凝胶，放置在倒有适量PBS缓冲液在电泳槽内，注意正负极。将2μl染液与5μl RNA样品与在EP手套上轻轻吹打混匀，然后小心点样，打开电泳仪开关，电泳约15min，关闭电源。小心取出凝胶于全自动凝胶图象分析仪器(Bio-Rad)上照相并分析。

2.5.4待测基因表达量分析

通过测定目的基因结合SYBR Green II所发出的荧光信号来确定其表达量，实时荧光定量PCR的Ct值表示反应管内荧光信号达到设定值时所经历的循环数。本试验使用β-action基因mRNA的表达量为内参，采用相对定量的方法。分别计算试验待测样品ΔCt值，再计算出ΔΔCt值，并用2^{-averageΔΔCt}来表示不同待测样品中目的基因的表达量相对于对照组的变化倍数。(公式ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因，公式ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt对照组)

2.6试验数据统计

各项试验数据均使用SPSS 20.0软件进行单因素和T检验方差分析，最终结果表示为平均值±标准差。显著性差异水平表示为：P＜0.01差异极显著，P＜0.05差异显著。

3.实验结果

3.1血液学结果

3.1.1血生化结果

血生化检测详细结果详见表5-8。

从表5可见，高剂量组中各项指标均呈现升高趋势。TP和ALB出现了极显著上升(P＜0.01)，高于正常范围，停药第四天仍然显著高于给药前(P＜0.05)，且高于正常范围，在停药第八天仍然没有恢复至正常范围。AST和ALT在给药第五天、第七天、停药第四天和第八天均出现显著或者极显著升高(P＜0.05或者P＜0.01)，高于正常范围，并且在停药第八天后仍然高于正常范围。ALP在给药第七天和停药第四天出现显著升高(P＜0.05)，且高于正常范围。TBIL、Scr和BUN高剂量组在给药后均出现升高，且给药第三天后直到停药第四天均高于正常范围。

从表6可见，中剂量组中各项指标均出现缓慢的升高趋势，但没有显著性(P＞0.05)。TP、ALB、AST、ALT、ALP、TBIL、Scr和BUN指标虽有升高，但均处于正常范围内。

从表7可见，低剂量组中各项指标均未出现明显的升高或者降低趋势。TP、ALB、AST、ALT、ALP、TBIL、Scr和BUN指标都处于正常范围内。

从可见表8，低剂量组L1中各项指标均未出现明显的升高或者降低趋势。TP、ALB、AST、ALT、ALP、TBIL、Scr和BUN指标都处于正常范围内。

血生化检测肝肾功能在临床上应用普遍。给药后高剂量组和中剂量组的各项指标均出现剂量依赖性升高，低剂量组的各项指标均未出现明显的变化。但高剂量组的各项指标在给药第五天或者第七天高出正常范围，并且有些指标还出现了显著性的升高(P＜0.05)，表明肝肾功能出现损伤，停药后各项指标未降至正常范围，表明停药后肝肾功能并未立即恢复。中剂量组和低剂量组的肝肾指标均在正常范围内，表明肝肾功能均未出现损伤。

3.1.2血常规结果

血常规各项检测结果详见表9-12。

从表9可见，高剂量组WBC、GR#、LY#在给药第五天至停药第四天均出现显著或极显著下降(P＜0.05或者P＜0.01)，且都低于正常范围，在停药第八天未出现明显的上升，仍然低于正常范围。HGB在给药第七天出现极显著降低(P＜0.01)，停药第四天显著低于给药前(P＜0.05)，且均低于正常范围，停药第八天恢复至正常范围。RBC在给药第五天和第七天均出现显著下降(P＜0.05)，且低于正常范围，在停药第八天恢复至正常范围。PLT在给药第五天和第七天均出现显著下降(P＜0.05)，给药第七天低于正常范围，在停药第四天和第八天恢复至正常范围。

从表10可见，高剂量组WBC、GR#、LY#在给药第七天均出现显著下降(P＜0.05)，且都低于正常范围，在停药后出现明显的上升，在停药第八天恢复至正常范围。HGB、RBC、PLT在给药均出现降低趋势停药后又缓慢恢复至给药前的指标，HGB和RBC都在生产范围内，PLT在给药第七天低于正常范围，停药后恢复至正常范围。

从表11可见，低剂量组的各个指标均未出现明显变化，且都处于正常范围内。

从表12可见，低剂量组L1的各个指标均呈现上升趋势。在给药第七天WBC、GR#、LY#、HGB出现显著升高(P＜0.05)，停药后出现降低，恢复至给药前的水平。HGB在给药第七天高于正常范围。

血常规检测免疫指标在临床上有普遍的应用。检测的免疫指标有白细胞数(WBC)、中性粒细胞绝对数(GR#)、淋巴细胞绝对数(LY#)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)。高剂量组和中剂量组给药后各项指标均呈现剂量依赖性的下降，低于正常范围，并且高剂量组在停药后各项指标未恢复至正常范围，中剂量组恢复至正常范围，低剂量组各项指标未有明显变化，低剂量组L1各项指标呈现上升趋势，停药后恢复至给药前水平。

3.2淋巴细胞增值试验结果

从附图1可见，高剂量组和中剂量组在给药后淋巴细胞抑制率均呈现上升趋势，停药后出现缓慢的下降趋势。高剂量组在给药后第五天抑制率显著升高(P＜0.01)，给药后第七天极显著升高(P＜0.05)，停药后第四天仍然显著高于给药前(P＜0.05)。中剂量组在给药后第七天抑制率极显著高于给药前(P＜0.01)，停药第四天显著高于给药前(P＜0.05)，停药第八天显著低于最后一次给药(P＜0.05)，并且与给药前无显著差异。低剂量组的L2和L3号动物未出现显著的差异性。低剂量组L1给药后淋巴细胞抑制率呈现下降趋势，给药第七天抑制率显著高于给药前(P＜0.05)，停药后抑制率出现上升趋势。

3.3流式细胞术实验结果

流式细胞术检测结果详见表13-15。

从表13可见，淋巴细胞亚群CD3⁺的比值。高剂量组和中剂量组在给药后淋巴细胞亚群CD3⁺的比值均呈现下降趋势，停药后出现缓慢的上升趋势。高剂量组在给药后第五天CD3⁺T的比值显著降低(P＜0.05)，给药后第七天极显著降低(P＜0.01)，停药后第四天仍然显著低于给药前(P＜0.05)，停药后第八天显著高于给药第七天(P＜0.05)。中剂量组在给药后第七天CD3⁺T的比值显著低于给药前(P＜0.05)，停药第四天显著低于给药前(P＜0.05)，停药第八天显著高于最后一次给药(P＜0.05)，并且与给药前无显著差异。低剂量组的L2和L3号动物未出现明显的差异性。低剂量组L1给药后CD3⁺T的比值呈现下降趋势，给药第七天CD3⁺T的比值显著高于给药前(P＜0.05)，停药后CD3⁺T的比值出现升高趋势，并且停药第八天与给药前无显著差异(P＞0.05)。

从表14可见，淋巴细胞亚群CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺的比值。高剂量组和中剂量组在给药后淋巴细胞亚群CD3⁺CD4⁺的比值均呈现下降趋势，停药后出现缓慢的上升趋势。高剂量组在给药后第五天CD3⁺CD4⁺T的比值显著降低(P＜0.05)，给药后第七天极显著降低(P＜0.01)，停药后第四天仍然显著低于给药前(P＜0.05)。中剂量组在给药后第七天CD3⁺CD4⁺T的比值极显著低于给药前(P＜0.01)，停药第八天显著高于最后一次给药(P＜0.05)，并且与给药前无显著性差异(P＞0.05)。低剂量组的L2和L3号动物未出现明显的差异性。低剂量组L1给药后CD3⁺CD4⁺T的比值呈现上升趋势，给药第七天CD3⁺CD4⁺T的比值显著高于给药前(P＜0.05)，停药后CD3⁺CD4⁺T的比值呈现降低趋势，并且停药第八天与给药前无显著差异(P＞0.05)。

从表15可见，淋巴细胞亚群CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺的比值。高剂量组和中剂量组在给药后淋巴细胞亚群CD3⁺CD8⁺的比值均呈现下降趋势，停药后出现缓慢的上升趋势。高剂量组在给药后第七天CD3⁺CD8⁺T的比值显著降低(P＜0.05)，停药后第八天与给药前无显著性差异(P＞0.05)。中剂量组在给药后第七天CD3⁺CD8⁺T的比值极显著低于给药前(P＜0.01)，停药第八天显著高于最后一次给药(P＜0.05)，并且与给药前无显著性差异(P＞0.05)。低剂量组的L2和L3号动物未出现明显的差异性。低剂量组L1给药后CD3⁺CD8⁺T的比值呈现上升趋势，给药第七天CD3⁺CD8⁺T的比值上升至最大，停药后CD3⁺CD8⁺T的比值呈现降低趋势，并且停药第八天与给药前无显著差异(P＞0.05)。

高剂量组和中剂量组的淋巴细胞亚群CD3⁺的比值、CD3⁺CD4⁺的比值和CD3⁺CD8⁺比值均在在给药后第三天出现降低，给药第五天至第七天均出现显著性降低(P＜0.05)，有些还出现极显著差异(P＜0.01)。中剂量组在停药后淋巴细胞亚群CD3⁺的比值、CD3⁺CD4⁺的比值和CD3⁺CD8⁺比值出现上升趋势，在停药第八天淋巴细胞亚群CD3⁺的比值、CD3⁺CD4⁺的比值和CD3⁺CD8⁺比值与给药前相比均未有显著性差异。高剂量组在停药第四天淋巴细胞亚群CD3⁺的比值和CD3⁺CD4⁺的比值仍然显著性高于给药前，在停药第八天后才有明显的上升趋势。低剂量组中2号和3号动物给药前、给药和停药后均未有显著性差异(P＞0.05)。低剂量组1号动物的淋巴细胞亚群CD3⁺的比值、CD3⁺CD4⁺的比值和CD3⁺CD8⁺比值在给药第五天均出现显著性升高(P＜0.05)，在停药第八天下降至给药前的水平。流式细胞术的细胞分布见图2-图7。

3.4荧光定量实验结果

淋巴细胞内IL-2、IFN-γ、TNF-α的mRNA相对表达量详细结果见图8-10。

从图8可见，淋巴细胞内IL-2的mRNA相对表达量。高剂量组和中剂量组在给药后IL-2的表达量均呈现下降趋势，停药后出现缓慢的上升趋势。高剂量组在给药后第五天IL-2的表达量显著降低(P＜0.05)，给药后第七天极显著降低(P＜0.01)，停药后第四天仍然显著低于给药前(P＜0.05)，停药后第八天显著高于最后一天给药(P＜0.05)。中剂量组在给药后第七天IL-2的表达量极显著低于给药前(P＜0.01)，停药第八天显著高于最后一次给药(P＜0.05)。低剂量组的L2和L3号动物的IL-2的表达量未出现明显的差异性。低剂量组L1给药后IL-2的表达量呈现上升趋势，给药第七天IL-2的表达量显著高于给药前(P＜0.05)，停药后IL-2的表达量呈现降低趋势，并且停药第八天与给药前无显著差异(P＞0.05)。

从图9可见，淋巴细胞内IFN-γ的mRNA相对表达量。高剂量组和中剂量组在给药后IFN-γ表达量均呈现下降趋势，停药后出现缓慢的上升趋势。高剂量组在给药后第五天，第七天IFN-γ表达量均极显著降低(P＜0.01)，停药后第四天仍然显著低于给药前(P＜0.05)，并且显著高于最后一次给药(P＜0.05)，停药第八天极显著高于最后一天给药。中剂量组在给药后第七天和停药第四天IFN-γ表达量显著低于给药前(P＜0.05)，停药第八天极显著高于最后一次给药(P＜0.01)。低剂量组的L2和L3号动物未出现明显的差异性。低剂量组L1给药后IFN-γ表达量呈现缓慢的上升趋势，在给药第七天IFN-γ表达量显著高于给药前(P＜0.05)，停药后IFN-γ表达量呈现降低趋势，并且停药第八天与给药前无显著差异(P＞0.05)。

从图10可见，淋巴细胞内TNF-α的mRNA相对表达量。高剂量组和中剂量组在给药后TNF-α的表达量均呈现下降趋势，停药后出现缓慢的上升趋势。高剂量组在给药后第五天TNF-α的表达量显著降低(P＜0.05)，给药后第七天极显著降低(P＜0.01)，停药后第八天显著低于给药前(P＜0.05)，并且显著高于给药最后一天(P＜0.05)。中剂量组在给药后第七天CD3⁺CD4⁺的比值极显著低于给药前(P＜0.01)。低剂量组的L2和L3号动物的TNF-α的表达量未出现明显的差异性。低剂量组L1给药后TNF-α的表达量呈现上升趋势，给药第七天TNF-α的表达量显著高于给药前(P＜0.05)，停药后TNF-α的表达量呈现降低趋势，并且停药第八天与给药前无显著差异(P＞0.05)。

高剂量组和中剂量组的IL-2、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达量均在在给药后第三天出现降低，给药第五天至第七天均出现显著性降低(P＜0.05)，有些还出现极显著差异(P＜0.01)。中剂量组在停药后IL-2、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达量出现上升趋势，除IFN-γ的mRNA表达量在给药后第四天仍然显著(P＜0.05)低于给药前，在停药第八天IL-2、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达量与给药前相比均未有显著性差异。高剂量组在停药后第四天IL-2和IFN-γ仍然显著性高于给药前，在停药第八天后才有明显的上升趋势。低剂量组中2号和3号动物给药前、给药和停药后均未有显著性差异(P＞0.05)。低剂量组1号动物的IL-2、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达量在给药第五天均出现显著性升高(P＜0.05)，停药后均出现下降趋势，在停药第八天下降至给药前的水平。

4.讨论

环磷酰胺常被用作免疫抑制剂，大剂量的环磷酰胺可以导致机体免疫抑制。机体注射环磷酰胺后可导致血生化、血常规、淋巴细胞亚群、细胞免疫因子等指标均表现出相应变化，呈现剂量依赖性变化。本试验结果显示高剂量组和中剂量组恒河猴的淋巴细胞亚群CD3⁺、CD3⁺CD4⁺及CD3⁺CD8⁺；细胞免疫因子白介素-2、肿瘤坏死因子-α及干扰素-γ；免疫细胞白细胞、中性粒细胞绝对数及淋巴细胞绝对数等均出现剂量依赖性的降低，淋巴细胞抑制率出现剂量依赖性的升高，表现为免疫抑制，与高芃等人采用环磷酰胺建立免疫抑制小鼠的研究结果一致。有文献表明大剂量的环磷酰胺会致机体肝肾功能损伤。试验结果显示高剂量的环磷酰胺可导致恒河猴的谷丙转氨酶、谷草转氨酶及尿素等出现剂量依赖性升高，且高出正常范围，表明肝肾功能损伤，这与李业鹏等人在免疫低下小鼠上的研究结果一致。中剂量组的恒河猴表现为肝肾功能正常，表明适当剂量的环磷酰胺可建立肝肾功能正常的免疫抑制模型，这与杨宪勇等人在不同小鼠品种上得到的研究结果一致。杨颖等人的研究表明，停止注射环磷酰胺后，机体的免疫系统功能会逐渐恢复。本试验中中剂量组出现了恢复趋势，这与杨颖和英勇等人在啮齿类动物上的研究结果相符。

又有Winkelstein等的文献报道低剂量的环磷酰胺能够增强机体的免疫功能。本实验中低剂量组内有1只恒河猴的淋巴细胞亚群CD3⁺、CD3⁺CD4⁺及CD3⁺CD8⁺；细胞免疫因子白介素-2、肿瘤坏死因子-α及干扰素-γ；免疫细胞白细胞、中性粒细胞绝对数及淋巴细胞绝对数等均出现剂量依赖性的升高，淋巴细胞抑制率出现剂量依赖性的降低，表现为免疫增强。与Winkelstein等的及张云波等人的研究结果一致。

Rapaport等人研究发现，人类在免疫低下状况中，各项免疫指标均出现降低，但肝肾功能基本正常。本试验中中剂量各项免疫指标和肝肾功能的变化与Rapaport等人发现的人类的免疫抑制呈现近似的变化规律，其他剂量组表现出的变化规律均与人类的免疫抑制有一定的不相符合之处，所以本研究中，15mg/kg的剂量适合建立与人类相关性更大，更符合的人类免疫抑制临床特征变化的免疫抑制模型。同时，在30mg/kg的剂量时会出现具有肝肾功能损伤的恒河猴免疫抑制模型；在5mg/kg的剂量的剂量时不会造成免疫抑制，反而可能出现免疫促进的恒河猴个体模型。

高剂量的环磷酰胺能抑制机的体免疫功能，低剂量的环磷酰胺能够促进机体的免疫功能，不同的注射方式和灌胃方式对机体免疫功能的作用也不同，所以环磷酰胺对对机体所引起的双重作用主要取决于其用药的剂量和给药形式的不同。但目前而言环磷酰胺更多的是作为一种免疫抑制剂，并且已有大量研究表明其能抑制动物的细胞和体液免疫应答，造成动物的免疫抑制。本试验就是选用不同剂量的环磷酰胺静脉注射恒河猴，确定恰当的免疫抑制造模剂量，建立与人类免疫抑制状况下的各项免疫指标变化趋势一致的疾病模型。

本试验采用恒河猴模型动物，与小鼠或者禽类相比具有无可比拟的优势。恒河猴在生化代谢、生殖生理特性及组织结构等方面与人类高度相似，并且与人类遗传物质上有98％左右的同源性。并且作为生物医学研究模型已有近百年的历史，如建立帕金森病、结核病、肝移植等疾病模型，数据十分丰富，早已被用作医学和生物学各领域研究的理想实验动物造模。模型的各项免疫指标也与人类有着相似的变化趋势。通过本文的研究，利用恒河猴成功建立了免疫抑制模型，并对其进行生物学相关指标的评价，建立了一套较为系统的评价方法，为以后新药研发、免疫抑制机理研究、病毒感染模型建立等提供更为理想、可靠的实验动物模型及完善评价体系，具有很好的理论与应用创新意义。

实施例2：用本发明模型评价潜在的提高机体免疫力的药物或保健品。

1)按照实施例1方法建立恒河猴免疫抑制模型；

2)将候选药物施用于前述恒河猴免疫抑制模型；

3)观察候选药物对恒河猴免疫抑制模型的各种指标的影响情况，评价潜在的提高机体免疫力的药物或保健品。

其中，步骤3)用于评价潜在的提高机体免疫力的药物或保健品的指标主要是通过血生化、血常规、流式细胞术、淋巴细胞增殖试验、荧光定量PCR技术检测得到的相关指标。

综上所述，本发明公开的建模方法诱导恒河猴出现免疫抑制的临床症状，说明本发明提供的方法可以有效建立恒河猴免疫抑制模型。

Claims (1)

1.一种制备恒河猴免疫抑制模型的方法，其特征在于，将剂量为按体重一日15mg/kg的环磷酰胺施用于恒河猴，施用方式为静脉注射，施用方法为隔日一次，连续4-5次。