CN104673751B - 一种高效cik细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞生物学领域，具体地说是通过单核细胞分离、接种培养瓶、接种培养袋和收取细胞等四个步奏对CIK细胞进行高效培养，在培养过程中添加IL‑1、IL‑2、IL‑24、IFN‑γ、CD3 AK、EGF等诱导因子，诱导外周血单个核细胞成为CIK细胞，并使其在体外高效扩增的高效CIK细胞培养方法。培养10天可以使初始细胞数量为2×的外周血单个核细胞细胞诱导后扩增为1×的CIK细胞，可有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最终获取的细胞数量，除此之外，采用本方法培养出来的CIK细胞可以使子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高凋亡率达到64.2%和54.3%。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体地说是一种通过添加IL-1、IL-2、IFN-γ、CD3AK 、EGF作为诱导因子，有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最终获取的细胞数量、所培育CIK细胞可大幅增加子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高凋亡率的高效CIK细胞培养方法。
背景技术
随着细胞生物学技术、临床医疗技术的研究深入和发展，进一步推动了细胞培养技术迅速发展，然而对自体免疫细胞的培养研究有限，从而限制了免疫细胞治疗各类疾病的技术发展和应用。
细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer，CIK）是一种新型的免疫活性细胞，CIK 细胞增殖能力及细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。作为一种新型的、高效的、非 MHC 限制性的免疫活性细胞得到了广泛应用。CIK细胞的实质和来源是指CD3+、CD56+的淋巴细胞，存在于正常人体中，但含量较少，约占5%以下｡目前国内外用于临床的CIK细胞制品，就是在体外倍增出的以这些细胞为主的细胞群｡
随着生物医学技术的发展，CIK 细胞已在临床大量应用，疗效也得到一定程度的认可，为进一步提高 CIK 细胞的增殖能力及细胞杀伤能力，人们正逐渐寻求和改进 CIK细胞的体外培养和处理办法。有研究者在培养基中加入植物血凝素，刺激 T 细胞增殖。为了使体内 CD3+、CD56+及 CD8+细胞等明显增多，有学者用重组的 MVC-1 病毒疫苗刺激淋巴细胞获得无人白细胞抗原限制性的杀伤性 T 淋巴细胞。还有研究者应用基因工程技术对 CIK 细胞的修饰，即转基因 CIK 细胞，在 CIK 细胞上转染含有 IL-2、I L-7、IL-24、共刺激分子如 B7 分子家族、细胞黏附分子和 LFA23 等基因，可以使 CIK 细胞在体内不断增殖，使血清中某些细胞因子水平增高，而提高效应细胞的作用。
现在很多研究人员和机构采用的CIK培养方法效率较低，从70-100ml新鲜血液中提取的外周血单个核细胞细胞，诱导培养约14天后细胞数量仅达到109数量级。
发明内容
本发明旨在提供一种高效的CIK细胞体外培养的方法，具体地说是一种通过添加IL-1、IL-2、IFN-γ、CD3 AK 、EGF作为诱导因子，有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最终获取的细胞数量、所培育CIK细胞可大幅增加子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高凋亡率的高效CIK细胞培养方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效CIK细胞培养方法，其特征在于培养步骤为：
第一步：单核细胞分离
将定量血样装到离心管中，对血样进行离心，弃去底部剩余；将获得的血细胞用生理盐水稀释，可缓慢加入到装有血样容积20%-30%的淋巴细胞分离液的离心管中，进行离心后，吸弃上清；缓慢吸取白膜层细胞至新的离心管中，向离心管内加入生理盐水，混合均匀，得到白细胞稀释液，最终获得的白细胞稀释液为血样容积的70%-80%，将白细胞稀释液进行离心处理，吸弃上清；用血样容积5%-10%的生理盐水重悬，加入血样容积70%-80%的生理盐水离心后，弃去上清后，得到细胞沉淀；
第二步：接种培养瓶
取血样容积5%-10%的TCM-199培养基重悬细胞沉淀，再次添加血样容积25%-35%的TCM-199培养基，混匀后置于T175培养瓶中；用血样容积30%-60%的TCM-199培养基清洗离心管，清洗后，将洗涤液倒入T175培养瓶中；向T175培养瓶中分别加入HEPES-TL 、IL-2、IL-24、IFN-γ后，将培养瓶放入培养箱中培养；第2天，向培养瓶内添加IL-1、CD3 AK、EGF；第4天，向培养瓶内添加胎牛血清及血样容积75%-80%的TCM-199培养基；第5天，向培养瓶内添加血样容积2-3倍的TCM-199培养基；
第三步：接种培养袋
在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养，将培养瓶内细胞倒入培养袋，用TCM-199培养基洗涤培养瓶后，将洗涤液倒入培养袋，向培养袋中加入TCM-199培养基至终容积为血样容积15-18倍，同时添加EGF和IL-24，用封口热合器热合培养袋进液管远端处；将培养袋放入培养箱中培养；
第四步：收取细胞
在培养袋中培养14天后，将细胞培养袋经70%-75%的酒精消毒后，混匀细胞培养袋内的细胞并放入生物安全柜中，用碘伏对剪刀以及培养袋上的出液管进行消毒，剪开培养袋出液管，将细胞培养液经离心后，弃去上清，获得CIK细胞。
本发明所述培养箱的培养环境均为37℃、7.5%。本发明所述第二步中加入的HEPES-TL 、IL-2、IL-24、IFN-γ、IL-1、CD3 AK、EGF浓度范围均在9-11 ng/ml。本发明所述第二步加入的胎牛血清为血样容积的5%-10%。本发明所述第一步用生理盐水稀释血细胞时，稀释比例为1:1。本发明将培养瓶内细胞倒入培养袋时，可将注射器套筒插入进液管作为漏斗。本发明所使用的生理盐水采用一般医用生理盐水即可。
本发明通过在培养过程中添加IL-1、IL-2、IL-24、IFN-γ、CD3 AK、EGF等，诱导外周血单个核细胞成为CIK细胞，并且在体外高效扩增。培养10天可以使初始细胞数量为的外周血单个核细胞细胞诱导后扩增为的CIK细胞。在很大程度上提高了CIK细胞的扩增数量和速度。不需要额外添加其他试剂和细胞诱导及增殖相关的细胞因子。可有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最终获取的细胞数量同时，所培育CIK细胞与普通CIK细胞相比，可大幅增加子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高凋亡率。
附图说明
图1是诱导后CIK细胞图片。
图2是高效CIK培养方法流式细胞术鉴定结果。
图3是 CIK细胞对子宫颈癌Hela细胞凋亡的影响。
图4 是CIK细胞对骨髓瘤Sp20细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合采用常用CIK细胞培养方法和本发明所使用的高效CIK细胞培养方法所之间的对比实验对本发明作进一步的说明：
一种高效CIK细胞培养方法，其特征在于培养步骤为：
第一步：单核细胞分离
将定量血样装到离心管中，对血样进行离心，弃去底部剩余；将获得的血细胞用生理盐水稀释，生理盐水采用一般医用生理盐水即可，缓慢加入到装有血样容积20%-30%的淋巴细胞分离液的离心管中，进行离心后，吸弃上清；缓慢吸取白膜层细胞至新的离心管中，向离心管内加入生理盐水，混合均匀，得到白细胞稀释液，最终获得的白细胞稀释液为血样容积的70%-80%，将白细胞稀释液进行离心处理，吸弃上清；用血样容积5%-10%的生理盐水重悬，加入血样容积70%-80%的生理盐水离心后，弃去上清后，得到细胞沉淀；
第二步：接种培养瓶
取血样容积5%-10%的TCM-199培养基重悬细胞沉淀，再次添加血样容积25%-35%的TCM-199培养基，混匀后置于T175培养瓶中；用血样容积30%-60%的TCM-199培养基清洗离心管，清洗后，将洗涤液倒入T175培养瓶中；向T175培养瓶中分别加入HEPES-TL 、IL-2、IL-24、IFN-γ后，将培养瓶放入培养箱中培养；第2天，向培养瓶内添加IL-1、CD3 AK、EGF；第4天，向培养瓶内添加胎牛血清及血样容积75%-80%的TCM-199培养基，第5天，向培养瓶内添加血样容积2-3倍的TCM-199培养基；
第三步：接种培养袋
在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养，将培养瓶内细胞倒入培养袋，用TCM-199培养基洗涤培养瓶后，将洗涤液倒入培养袋，向培养袋中加入TCM-199培养基至终容积为血样容积15-18倍，同时添加EGF和IL-24，用封口热合器热合培养袋进液管远端处；将培养袋放入培养箱中培养；
第四步：收取细胞
在培养袋中培养14天后，将细胞培养袋经70%-75%的酒精消毒后，混匀细胞培养袋内的细胞并放入生物安全柜中，用碘伏对剪刀以及培养袋上的出液管进行消毒，剪开培养袋出液管，将细胞培养液经离心后，弃去上清，获得CIK细胞。
下面通过对比实验来进一步说明本发明的效果：
一、单核细胞分离
将采血管用浸润酒精的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜。将60ml血样平均分装到50ml离心管中，2000rpm离心10min；离心后吸至距分界面0.5cm处为止，弃去底部剩余；用生理盐水按1:1的比例稀释血细胞；加入到装有15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管中，添加过程需缓慢，使其分界面呈清晰界面，1600rpm离心20min；离心后，吸弃上清，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀后，1500rpm离心10min；离心后弃去上清，沉淀先用5ml生理盐水重悬，再加生理盐水45ml，混匀后取1ml样本于EP管中，用于计算细胞总量，1300rpm离心10min；离心后弃去上清，沉淀即为所需单核细胞。
二、CIK细胞诱导及培养
1.CIK细胞的诱导培养
用5ml TCM-199培养基重悬外周血单核分离提取中所获得的细胞沉淀，再加入20ml TCM-199培养基，混匀后加到T175培养瓶中；再加25ml的TCM-199培养基清洗50ml离心管，将洗涤液加到T175培养瓶中；向T175培养瓶中加入HEPES-TL 、IL-2、IL-24、IFN-γ均为10 ng/ml。将培养瓶放入37℃、7.5%的培养箱中培养。第2天，向瓶内添加IL-1、CD3 AK、EGF均为10 ng/ml。第4天，添加5ml胎牛血清，加50ml TCM-199培养基。第5天，加140ml TCM-199培养基。在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养。旋开培养袋的进液管，取50ml注射器套筒插入进液管作为漏斗；将培养瓶内细胞倒入培养袋，用250ml TCM-199培养基洗涤培养瓶，洗涤液倒入培养袋；重复洗涤一次；直接向培养袋中加TCM-199培养基，加至终容积为1000ml；并加入浓度为10 ng/ml的EGF和IL-24，用封口热合器热合培养袋进液管远端处，热合两次；将培养袋放入37℃、7.5% 培养箱中培养。
2．CIK细胞的诱导培养对照组试验
用5ml TCM-199培养基重悬外周血单核分离提取中所获得的细胞沉淀，再加入20ml TCM-199培养基，混匀后加到T175培养瓶中；再加25ml的TCM-199培养基清洗50ml离心管，将洗涤液加到T175培养瓶中；向T175培养瓶中加入IL-2、IFN-γ均为10 ng/ml。将培养瓶放入37℃、5.0%的培养箱中培养。第2天，向瓶内添加CD3 AK为10 ng/ml。第4天，添加5ml胎牛血清，加50ml TCM-199培养基。第5天，加140ml TCM-199培养基。在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养。旋开培养袋的进液管，取50ml注射器套筒插入进液管作为漏斗；将培养瓶内细胞倒入培养袋，用250ml TCM-199培养基洗涤培养瓶，洗涤液倒入培养袋；重复洗涤一次；直接向培养袋中加TCM-199培养基，加至终容积为1000ml；用封口热合器热合培养袋进液管远端处，热合两次；将培养袋放入37℃、5.0% 培养箱中培养。培养14天后收获细胞。
3. CIK细胞计数及表面标志物检测
使用BD流式细胞仪对培养的CIK细胞数量进行检测，同时检测CIK细胞表面标志物CD3+、CD4+、CD8+、CD56+。
4.CIK细胞作用于宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞
取收获后的CIK细胞1ml加入到初始数量一致，并且种6孔板培养24h后的宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞。然后放置在37℃、5%培养箱中共培养。分别培养12h、24h、48、72h。使用BD流式细胞仪检测宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞的凋亡情况。
本发明的效果如下：
1.对CIK细胞增殖效率的影响
采用普通方法培养的CIK细胞培养14天后细胞数量为1.7×109，而高效培养方法培养的CIK细胞培养14天后细胞数量为12.1×109，所得到的细胞总数是普通培养方法的7.12倍，由此可见高效培养方法对CIK的增殖效率具有很大的提高作用。
2.对子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞凋亡的影响
普通方法培养的CIK细胞可以使子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高凋亡率达到37.4%和35.7%，而高效方法培养的CIK细胞可以使子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高凋亡率达到64.2%和54.3%。
本发明通过在培养过程中添加IL-1、IL-2、IL-24、IFN-γ、CD3 AK、EGF等，诱导外周血单个核细胞细胞成为CIK细胞，并且在体外高效扩增。培养10天可以使初始细胞数量为的外周血单个核细胞细胞诱导后扩增为的CIK细胞。在很大程度上提高了CIK细胞的扩增数量和速度。不需要额外添加其他试剂和细胞诱导及增殖相关的细胞因子。可有效提高CIK细胞体外扩增培养速度和最终获取的细胞数量同时，所培育CIK细胞与普通CIK细胞相比，可大幅增加子宫颈癌Hela细胞及骨髓瘤Sp20细胞最高凋亡率。
Claims (2)
1.一种高效CIK细胞培养方法，其特征在于培养步骤为：
第一步：单核细胞分离将定量血样装到离心管中，对血样进行离心，弃去底部剩余；将获得的血细胞用生理盐水稀释，生理盐水稀释血细胞时，稀释比例为1:1，缓慢加入到装有血样容积20％-30％的淋巴细胞分离液的离心管中，进行离心后，吸弃上清；缓慢吸取白膜层细胞至新的离心管中，向离心管内加入生理盐水，混合均匀，得到白细胞稀释液，最终获得的白细胞稀释液为血样容积的70％-80％，将白细胞稀释液进行离心处理，吸弃上清；用血样容积5％-10％的生理盐水重悬，加入血样容积70％-80％的生理盐水离心后，弃去上清后，得到细胞沉淀；
第二步：接种培养瓶取血样容积5％-10％的TCM-199培养基重悬细胞沉淀，再次添加血样容积25％-35％的TCM-199培养基，混匀后置于T175培养瓶中；用血样容积30％-60％的TCM-199培养基清洗离心管，清洗后，将洗涤液倒入T175培养瓶中；向T175培养瓶中分别加入HEPES-TL、IL-2、IL-24、IFN-γ后，将培养瓶放入CO2培养箱中培养；第2天，向培养瓶内添加IL-1、CD3AK、EGF；第4天，向培养瓶内添加胎牛血清及血样容积75％-80％的TCM-199培养基，胎牛血清为血样容积的5％-10％；第5天，向培养瓶内添加血样容积2-3倍的TCM-199培养基,其中，HEPES-TL、IL-2、IL-24、IFN-γ、IL-1、CD3AK、EGF浓度范围均在9-11ng/ml；
第三步：接种培养袋在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养，将培养瓶内细胞倒入培养袋，用TCM-199培养基洗涤培养瓶后，将洗涤液倒入培养袋，向培养袋中加入TCM-199培养基至终容积为血样容积15-18倍，同时添加浓度范围均在9-11ng/ml的EGF和IL-24，用封口热合器热合培养袋进液管远端处；将培养袋放入CO2培养箱中培养，CO2培养箱的培养环境均为37℃、7.5％CO2；
第四步：收取细胞在培养袋中培养14天后，将细胞培养袋经70％-75％的酒精消毒后，混匀细胞培养袋内的细胞并放入生物安全柜中，用碘伏对剪刀以及培养袋上的出液管进行消毒，剪开培养袋出液管，将细胞培养液经离心后，弃去上清，获得CIK细胞。
2.根据权利要求1所述的一种高效CIK细胞体养方法，其特征在于将培养瓶内细胞倒入培养袋时，可将注射器套筒插入进液管作为漏斗。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Liu Huiyu Inventor after: Gao Yan Inventor after: Zhang Jiabao Inventor after: Li Chunyu Inventor after: Li Peng Inventor after: Liu Faxian Inventor before: Liu Huiyu Inventor before: Li Chunyu Inventor before: Li Peng Inventor before: Gao Yan Inventor before: Liu Faxian |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200618 Address after: 132011 south of 2nd floor, Block E, high tech Industrial Development Zone, Jilin City, Jilin Province Patentee after: Jilin Huirong Regenerative Medicine Co.,Ltd. Address before: Weihai City, Shandong province area of 264209 Da LAN Si life district 91 Patentee before: Liu Huiyu |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200828 Address after: 132011 south of 2nd floor, Block E, high tech Industrial Development Zone, Jilin City, Jilin Province Patentee after: Zhongke Juyan stem cell Co., Ltd Address before: 132011 south of 2nd floor, Block E, high tech Industrial Development Zone, Jilin City, Jilin Province Patentee before: Jilin Huirong Regenerative Medicine Co.,Ltd. |