CN106591231B - 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用 - Google Patents
促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106591231B CN106591231B CN201611094616.5A CN201611094616A CN106591231B CN 106591231 B CN106591231 B CN 106591231B CN 201611094616 A CN201611094616 A CN 201611094616A CN 106591231 B CN106591231 B CN 106591231B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- polysaccharide nucleic
- bcg polysaccharide
- bcg
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 78
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 78
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- -1 polysaccharide nucleic acid Chemical class 0.000 title claims abstract description 70
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 39
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title abstract description 14
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title abstract description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 17
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 10
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 10
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 10
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000005360 mashing Methods 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- WFJIVOKAWHGMBH-UHFFFAOYSA-N 4-hexylbenzene-1,3-diol Chemical compound CCCCCCC1=CC=C(O)C=C1O WFJIVOKAWHGMBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 7
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 abstract description 6
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 abstract description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 abstract 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 3
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[(3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl)oxymethyl]-3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl]oxy-2-(hydroxymethyl)-6-methyloxane-3,5-diol Chemical compound OC1C(OC)C(O)COC1OCC1C(O)C(OC)C(O)C(OC2C(C(CO)OC(C)C2O)O)O1 SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000189 Arabinogalactan Polymers 0.000 description 1
- 239000001904 Arabinogalactan Substances 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000763579 Homo sapiens Toll-like receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000669406 Homo sapiens Toll-like receptor 6 Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000008235 Toll-Like Receptor 9 Human genes 0.000 description 1
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100027010 Toll-like receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100039387 Toll-like receptor 6 Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 235000019312 arabinogalactan Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N n-[(2s)-3-methyl-1-oxo-1-pyrrolidin-1-ylbutan-2-yl]-3-phenylpropanamide Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCCC1)C(=O)CCC1=CC=CC=C1 DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
Abstract
本发明涉及一种能促进CIK细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、及其培养基、培养方法和应用。所述卡介菌多糖核酸提取液是由卡介菌菌体破碎和热酚处理获得。所述制备制备包括以下步骤：菌种培养，收集菌膜，破碎菌体，热酚处理，沉淀，进一步醇沉精制，静置洗涤后真空干燥箱中干燥，得到卡介菌多糖核酸。卡介菌多糖核酸提取液对CIK细胞有明显的诱导增殖作用，CD3和CD56双阳性明显提高且诱导培养后的CIK细胞对肿瘤生长有较强的杀伤作用，具有临床应用的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及中药应用技术领域，具体的说是涉及提取中药材中的有效成分，并在提高CIK细胞增殖速率、CD3和CD56双阳性和对肿瘤杀伤力的临床的应用。
背景技术
细胞过继免疫治疗是目前的研究热点，它是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，杀灭患者体内的肿瘤细胞，并在此基础上修复、完善机体免疫系统的生物治疗方法。CIK细胞(cytokine-induced-killer cells)是一群在体外经过多种细胞因子共同诱导，能够同时表达两种膜蛋白分子即CD3和CD56的异质细胞，它不仅具有自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性杀瘤特点，还具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，具有重要的免疫治疗临床应用价值。因此，CIK细胞的体外大量增殖，即提高其体外增殖速率和对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用CIK细胞免疫治疗的关键所在。卡介菌的主要成分包括脂类、多糖、蛋白和核酸，其中多糖(包括脂类)和核酸组分发挥着重要的生理功能。卡介菌的细胞壁的主要成分由多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸，)和脂类构成。研究表明：可结合人和动物的Toll受体(TLR)的配体大量存在卡介菌细胞壁和其他细胞器上，而且这些配体至少可结合5种Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，这些配体和Toll受体结合后会促进树突状细胞的成熟，并诱导IL-12的分泌，而IL-12不仅能分泌IFN-γ而且能促进Th0细胞向Th1细胞亚群转化，从而产生Th1占优势的非特异性免疫反应。
发明内容
利用卡介菌多糖核酸有机地结合CIK细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的强大优势，建立卡介菌多糖核酸促进免疫细胞的大量增殖和提高杀伤力的工艺体系，从而间接改善肿瘤患者的生活质量，延长生存期。本发明目的在于提供最优卡介菌多糖核酸提取液浓度在提高CIK细胞增殖速率、CD3和CD56双阳性和对肿瘤杀伤力方面的应用。
本发明提供了一种促进CIK细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸。采用卡介菌菌体破碎和热酚处理获得的卡介菌多糖核酸。
本发明提供了一种CIK细胞培养基，包括基础培养基和卡介菌多糖核酸。
进一步地，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为0.35～35μg/mL。优选的，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为35μg/mL。
进一步地，所述基础培养基选自RPM1640培养基、DMEM培养基或MEM培养基。
进一步地，所述培养基中还包括IFN-γ和CD3单抗。
本发明提供了一种CIK细胞培养的方法，包括
(1)制备CIK细胞的出发细胞；
(2)配制含卡介菌多糖核酸的培养基，并添加入步骤(1)中的出发细胞，经培养获得CIK细胞。
进一步地，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为0.35～35μg/mL。优选的，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为35μg/mL。
进一步地，所述培养基中还包括IFN-γ和CD3单抗。
进一步地，步骤(2)的方法包括37℃，5％CO2培养箱内培养7d，定期更换1/2对应培养液。
本发明还提供了介菌多糖核酸在促CIK细胞增殖分化中的应用。
本发明还提供了利用介菌多糖核酸制备方法制得的CIK细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。
更进一步地，所述卡介菌多糖核酸的制备方法包括以下步骤：
1)菌体培养：将液体低温保藏的菌种于室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37℃下连续培养14-20天。
2)菌体收集：待菌体生长至对数期后，收集培养瓶内的菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后备用。
3)菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按10:1的比例加入去离子蒸馏水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，每次3min，共3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液0.5-2.0倍体积量的热苯酚(30-100℃)，在低速搅拌中保温30分钟-1小时。
4)卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚处理好的混合液自然沉淀1-10天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45μm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物。
5)在所收集的卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为70-75％。自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。
本发明的有益效果是：(1)本发明所述的卡介菌多糖核酸与其他化学诱导增殖因子相比，符合细胞培养要求，即对人体无毒副作用，故诱导增殖后的CIK细胞直接可以用于临床试验。(2)与相应的多糖刺激因子相比，本发明所述的多糖提取方法精练，剂型先进，该多糖提取液功效明显，成分明确，质量可控。(3)本发明所述的卡介菌多糖核酸具有明显提高CIK细胞增殖速率的作用，CD3和CD56双阳性显著提高，激活后的细胞杀伤力明显高于对照CIK细胞处理。
附图说明
图1卡介菌多糖核酸不同浓度诱导细胞增值趋势图。
图2最优浓度卡介菌多糖核酸诱导后CIK细胞对肿瘤的杀伤力评价。
具体实施方式
下面结合具体附图对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案，或者利用已有的临床中药注射剂而产生的其他具体的实施方案。
主要材料的准备。
一种对CIK细胞增殖分化有明显提高作用的卡介菌多糖核酸，其方法步骤如下：
(1)将液体低温保藏的菌种室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，连续培养14-20天。
(2)待菌体生长至对数期后，收集菌膜，洗涤，压干。
(3)以组织捣碎匀浆机破碎收集的菌体，经热苯酚，在低速搅拌中保温处理。
(4)将热酚处理好的混合液自然沉淀，吸取上清液，离心后过滤除菌，即为卡介菌多糖核酸混合物。
(5)将所收集的卡介菌多糖核酸提取液进行醇沉，自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤后，真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。
(6)精密称取经真空干燥的卡介菌多糖核酸加水溶解，定容，所配得的溶液即为卡介菌多糖核酸溶液。
实施例1卡介菌的培养和收获
1.菌体培养：将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37℃：连续培养14-20天。
其中，马铃薯苏通培养基的制备方法可以是：
(1)取洗净新鲜土豆(1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成4公分长斜面；用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时，再用纯化水冲洗土豆斜面块；用苏通培养基冲洗斜面块，取苏通培养基20ml，加入100ml灭菌大管中；
(2)将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；
(3)0.11MPa的大气压121℃，灭菌20分钟。放冷至室温待接种。
苏通培养基配制比例：
每1000ml：
2、菌体收集：待菌体生长至对数期后，收集培养瓶内菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重。
实施例2卡介菌多糖核酸混合物的制备
1.菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按10:1的比例加入去离子蒸馏水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，每次3min，共3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液0.5～2.0倍体积量的热苯酚(30-100℃)，在低速搅拌中保温30～60分钟。
2.卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚处理好的混合液自然沉淀1-10天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45μm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物。
3.在收集的卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为70-75％。自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。
4.精密称取经50℃真空干燥的卡介菌多糖核酸0.1g，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，用移液管移取1mL至25mL容量瓶中，加水定容至25mL。所配得的溶液即为卡介菌多糖核酸溶液。
实施例3利用细胞增殖速率筛选卡介菌多糖核酸的最优浓度
按常规CIK细胞培养方法，即第0天加入IFN-γ(1 000U/mL)，CD3单抗(25ng/mL)，置于CO2培养箱37℃孵育24h后获得的CIK细胞作为出发细胞。
在出发细胞中分别加入含3种浓度梯度的卡介菌多糖核酸(已高温灭菌)的RPMI1640培养基，置于12孔板内培养，其中浓度梯度为35μg/mL、3.5μg/mL、0.35μg/mL(即每1mL培养体系中含有卡介菌多糖的量分别是35μg、3.5μg和0.35μg)，将加入不含卡介菌多糖核酸的RPMI 1640培养基作为对照，37℃，5％CO2培养箱内培养7d，定期更换1/2对应培养液(例如培养3天时)。每天计算细胞浓度，分析每组细胞的增殖趋势。
结果如图1。从对比实验结果可以看出，与不含卡介菌多糖核酸的对照组相比，实验组中加入35μg/mL、3.5μg/mL、0.35μg/mL的卡介菌多糖后，能显著提高CIK细胞增殖分化速率，其中卡介菌多糖核酸的最优浓度为35μg/mL。
实施例4在最优浓度下的进行细胞流式检测细胞表型
将上述方法获得的CIK出发细胞分别进行测试，A、B组代表最优浓度的卡介菌多糖核酸RPMI 1640培养基和不含卡介菌多糖核酸的RPMI 1640培养基(对照)。37℃，5％CO2培养箱内培养，约3d更换1/2对应培养液。培养7d后将细胞液混匀取出置于15mL离心管中，1500rpm离心15min后分别加入CD3FITC-H、CD56PE-H单抗各10μl，室温避光孵育30min。流式细胞仪(Flow cytometry)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞。经35μg/mL卡介菌多糖核酸诱导后的细胞双阳性为73.9％，较对照的CD3﹢CD56﹢双阳性70.1％增加了3.8％。
实施例5在最优浓度诱导下的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力测定。
在卡介菌多糖核酸的最优浓度下，用卡介菌多糖核酸培养细胞，将培养瓶中已培养7d的细胞吸出置于15mL离心管中，离心弃去上清液，用0.9％NaCl洗脱CIK细胞两次后，加0.8mL RPMI 1640培养基，计数，得出细胞浓度。弃去肿瘤细胞培养瓶中的上清液，加1.5mL胰酶漂洗并弃去漂洗液，再加入1mL胰酶，37℃，3min。轻拍后加5mL预热的RPMI 1640终止反应。1200rpm，5min离心收集肿瘤细胞，洗脱两次后，加10mL RPMI 1640培养基，计数，得出细胞浓度。稀释细胞，并按细胞个数比等体积加液(CIK细胞液与肿瘤细胞A549液各100μl，共200μl一孔)。阳性对照：100μl肿瘤细胞稀释液+100μlCIK细胞液，阴性对照：200μlCIK细胞液。加好液后，放于37度，CO2浓度5％培养12小时。2小时后取出孔板，将原各孔中200μl液体吸去并用200μl培养基清洗5次。各孔平均加入100ul含10％CCK8的1640对细胞进行染色，放于37度，CO2浓度5％中培养4小时。取出孔板，拿到酶标仪上检测，得出卡介菌多糖核酸诱导的CIK细胞对肿瘤细胞杀伤力结果。如图2所示结果，在靶效比E：T＝20：1时，卡介菌多糖核酸诱导后的CIK细胞对A549肿瘤细胞的杀伤力达到93.3％，明显高于对照。
Claims (3)
1.卡介菌多糖核酸在体外培养CIK 细胞中的应用，其特征在于， CIK细胞培养过程包括制备CIK细胞的出发细胞，在出发细胞中加入含有卡介菌多糖核酸的RPMI1640培养基，所述卡介菌多糖核酸的制备方法包括如下步骤：
1)将液体低温保藏的菌种室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，连续培养14-20天；
2)待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，洗涤，压干；
3)将收集的菌体以组织捣碎匀浆机破碎菌体，经热苯酚，在低速搅拌中保温处理；
4)将热酚处理好的混合液自然沉淀1至7天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45µm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物；
5)将所收集的卡介菌多糖核酸混合物加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为80%，自然沉淀4天后，收集沉淀物，沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；
所述卡介苗多糖核酸的添加量是1ml培养体系中含35μg的卡介菌多糖核酸。
2.一种CIK细胞体外培养的方法，包括
（1）制备CIK细胞的出发细胞；
（2）配制含有卡介菌多糖核酸的RPMI1640培养基，并添加入步骤（1）中的出发细胞，经培养获得CIK细胞；
所述卡介菌多糖核酸的制备方法包括如下步骤：
1)将液体低温保藏的菌种室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，连续培养14-20天；
2)待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，洗涤，压干；
3)将收集的菌体以组织捣碎匀浆机破碎菌体，经热苯酚，在低速搅拌中保温处理；
4)将热酚处理好的混合液自然沉淀1至7天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45µm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物；
5)将所收集的卡介菌多糖核酸混合物加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为80%，自然沉淀4天后，收集沉淀物，沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；
所述的卡介苗多糖核酸的使用量是1ml培养体系中含35μg的卡介菌多糖核酸。
3.利用权利要求2所述的CIK细胞体外培养的方法制得的CIK细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010509876.4A CN111662870A (zh) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | 卡介菌多糖核酸在cik细胞体外培养及制备肿瘤药物中的应用 |
| CN201611094616.5A CN106591231B (zh) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611094616.5A CN106591231B (zh) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010509876.4A Division CN111662870A (zh) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | 卡介菌多糖核酸在cik细胞体外培养及制备肿瘤药物中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106591231A CN106591231A (zh) | 2017-04-26 |
| CN106591231B true CN106591231B (zh) | 2020-07-03 |
Family
ID=58596249
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611094616.5A Active CN106591231B (zh) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用 |
| CN202010509876.4A Pending CN111662870A (zh) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | 卡介菌多糖核酸在cik细胞体外培养及制备肿瘤药物中的应用 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010509876.4A Pending CN111662870A (zh) | 2016-12-02 | 2016-12-02 | 卡介菌多糖核酸在cik细胞体外培养及制备肿瘤药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN106591231B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107099504A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-08-29 | 东莞市保莱生物科技有限公司 | 一种造血干细胞培养基 |
| CN107142245A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-09-08 | 东莞市保莱生物科技有限公司 | 一种cik细胞培养方法 |
| CN106987558B (zh) * | 2017-05-31 | 2019-12-20 | 东莞市保莱生物科技有限公司 | 一种cik细胞培养基 |
| CN107034189A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-08-11 | 东莞市保莱生物科技有限公司 | 一种造血干细胞培养方法 |
| CN108142412B (zh) * | 2017-12-27 | 2021-06-01 | 重庆斯德姆生物技术有限公司 | 一种免疫细胞冻存液及冻存方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101820891B (zh) * | 2007-12-14 | 2012-05-30 | 湖南九芝堂斯奇生物制药有限公司 | 一种卡介菌多糖核酸提取物及其制备方法 |
| CN107446886A (zh) * | 2016-05-31 | 2017-12-08 | 湖南斯奇生物制药有限公司 | 卡介菌多糖核酸在促进cik细胞增殖和提高cik细胞的杀瘤活性中的应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009086694A1 (zh) * | 2008-01-07 | 2009-07-16 | Hunan Jiuzhitang-Siqi Biopharmaceutical Co., Ltd | 卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法 |
| CN103642752A (zh) * | 2013-12-04 | 2014-03-19 | 深圳市合一康生物科技有限公司 | 人cd3+cd8+cik细胞的制备方法 |
| WO2015081741A1 (zh) * | 2013-12-04 | 2015-06-11 | 深圳市合一康生物科技有限公司 | 免疫细胞制备方法及其制备试剂盒 |
-
2016
- 2016-12-02 CN CN201611094616.5A patent/CN106591231B/zh active Active
- 2016-12-02 CN CN202010509876.4A patent/CN111662870A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101820891B (zh) * | 2007-12-14 | 2012-05-30 | 湖南九芝堂斯奇生物制药有限公司 | 一种卡介菌多糖核酸提取物及其制备方法 |
| CN107446886A (zh) * | 2016-05-31 | 2017-12-08 | 湖南斯奇生物制药有限公司 | 卡介菌多糖核酸在促进cik细胞增殖和提高cik细胞的杀瘤活性中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 卡介苗及卡介菌多糖核酸提取物的免疫调节作用及临床作用;宁云山等;《中国生物制品学杂志》;20080131;第21卷(第1期);第74页-75页的1.1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106591231A (zh) | 2017-04-26 |
| CN111662870A (zh) | 2020-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106591231B (zh) | 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用 | |
| CN1171991C (zh) | 人神经干细胞的培养方法 | |
| CN101519646B (zh) | 一种cik细胞及其制备方法和细胞制剂 | |
| CN102268405B (zh) | 自体nk细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基 | |
| CN103589684A (zh) | 用于诱导未成熟单核细胞的树突细胞的激活的组合物和方法 | |
| CN104498434A (zh) | 一种大量树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞 | |
| CN108220227A (zh) | 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法 | |
| CN103436492B (zh) | 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法 | |
| CN109913404A (zh) | 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法 | |
| CN104480069A (zh) | 一种利用外周血分离培养免疫细胞的方法 | |
| AU2020103625A4 (en) | Applications of bacillus calmette-guerin (bcg) polysaccharide and nucleic acid in in-vitro culture of cytokine-induced-killer (cik) cells and preparation of antitumor drugs | |
| CN106754704A (zh) | 免疫细胞体外诱导扩增的方法 | |
| CN101684140A (zh) | 抗禽流感病毒、新城疫病毒、鸡法氏囊病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法 | |
| CN102690783B (zh) | 体外诱导树突状细胞成熟和增殖的红桂木凝集素 | |
| CN202107707U (zh) | Cik细胞的诱导活化试剂盒 | |
| CN105087489A (zh) | 一种dc细胞培养试剂及其培养方法 | |
| CN105535940A (zh) | 一种治疗多发性骨髓瘤的Vγ9Vδ2T细胞制剂的制备方法 | |
| CN107779435A (zh) | 一种含有自体cik细胞的共培养上清液及其应用 | |
| CN106635986B (zh) | 促进cik细胞增殖分化的人参多糖、培养基、培养方法和应用 | |
| CN101759765A (zh) | 一种体外制备抗鸡法氏囊病毒特异性转移因子的制备方法 | |
| CN106222139B (zh) | 一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性til细胞的方法 | |
| CN1369550A (zh) | 一种金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法 | |
| CN106566802A (zh) | 一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法 | |
| CN104293734A (zh) | 一种人γδT细胞的制备方法 | |
| CN109602900A (zh) | 鸡马立克氏病毒活疫苗的制备方法及其产品 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240419 Address after: Room 802, Building C, Qingwang Science and Technology Park, Baohe Economic Development Zone, Hefei City, Anhui Province, 230041 Patentee after: Hefei xingzhicheng Information Technology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 310018, Zhejiang, Hangzhou Jianggan District Xiasha Higher Education Park learning source street Patentee before: China Jiliang University Country or region before: China |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240428 Address after: Building 1515, Building 10, Shenzhen Biomedical Innovation Industrial Park, No. 14 Jinhui Road, Jinsha Community, Kengzi Street, Pingshan District, Shenzhen City, Guangdong Province, 518118 Patentee after: Shenzhen Pingshan District Seer Health Management Center Country or region after: China Address before: Room 802, Building C, Qingwang Science and Technology Park, Baohe Economic Development Zone, Hefei City, Anhui Province, 230041 Patentee before: Hefei xingzhicheng Information Technology Co.,Ltd. Country or region before: China |