CN106591231B - 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用 - Google Patents
促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种能促进CIK细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、及其培养基、培养方法和应用。所述卡介菌多糖核酸提取液是由卡介菌菌体破碎和热酚处理获得。所述制备制备包括以下步骤：菌种培养，收集菌膜，破碎菌体，热酚处理，沉淀，进一步醇沉精制，静置洗涤后真空干燥箱中干燥，得到卡介菌多糖核酸。卡介菌多糖核酸提取液对CIK细胞有明显的诱导增殖作用，CD3和CD56双阳性明显提高且诱导培养后的CIK细胞对肿瘤生长有较强的杀伤作用，具有临床应用的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及中药应用技术领域，具体的说是涉及提取中药材中的有效成分，并在提高CIK细胞增殖速率、CD3和CD56双阳性和对肿瘤杀伤力的临床的应用。
背景技术
细胞过继免疫治疗是目前的研究热点，它是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，杀灭患者体内的肿瘤细胞，并在此基础上修复、完善机体免疫系统的生物治疗方法。CIK细胞(cytokine-induced-killer cells)是一群在体外经过多种细胞因子共同诱导，能够同时表达两种膜蛋白分子即CD3和CD56的异质细胞，它不仅具有自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性杀瘤特点，还具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，具有重要的免疫治疗临床应用价值。因此，CIK细胞的体外大量增殖，即提高其体外增殖速率和对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用CIK细胞免疫治疗的关键所在。卡介菌的主要成分包括脂类、多糖、蛋白和核酸，其中多糖(包括脂类)和核酸组分发挥着重要的生理功能。卡介菌的细胞壁的主要成分由多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸，)和脂类构成。研究表明：可结合人和动物的Toll受体(TLR)的配体大量存在卡介菌细胞壁和其他细胞器上，而且这些配体至少可结合5种Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，这些配体和Toll受体结合后会促进树突状细胞的成熟，并诱导IL-12的分泌，而IL-12不仅能分泌IFN-γ而且能促进Th0细胞向Th1细胞亚群转化，从而产生Th1占优势的非特异性免疫反应。
发明内容
利用卡介菌多糖核酸有机地结合CIK细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的强大优势，建立卡介菌多糖核酸促进免疫细胞的大量增殖和提高杀伤力的工艺体系，从而间接改善肿瘤患者的生活质量，延长生存期。本发明目的在于提供最优卡介菌多糖核酸提取液浓度在提高CIK细胞增殖速率、CD3和CD56双阳性和对肿瘤杀伤力方面的应用。
本发明提供了一种促进CIK细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸。采用卡介菌菌体破碎和热酚处理获得的卡介菌多糖核酸。
本发明提供了一种CIK细胞培养基，包括基础培养基和卡介菌多糖核酸。
进一步地，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为0.35～35μg/mL。优选的，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为35μg/mL。
进一步地，所述基础培养基选自RPM1640培养基、DMEM培养基或MEM培养基。
进一步地，所述培养基中还包括IFN-γ和CD3单抗。
本发明提供了一种CIK细胞培养的方法，包括
(1)制备CIK细胞的出发细胞；
(2)配制含卡介菌多糖核酸的培养基，并添加入步骤(1)中的出发细胞，经培养获得CIK细胞。
进一步地，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为0.35～35μg/mL。优选的，所述卡介菌多糖核酸在培养基中的含量为35μg/mL。
进一步地，所述培养基中还包括IFN-γ和CD3单抗。
进一步地，步骤(2)的方法包括37℃，5％CO2培养箱内培养7d，定期更换1/2对应培养液。
本发明还提供了介菌多糖核酸在促CIK细胞增殖分化中的应用。
本发明还提供了利用介菌多糖核酸制备方法制得的CIK细胞在制备肿瘤治疗药物中的应用。
更进一步地，所述卡介菌多糖核酸的制备方法包括以下步骤：
1)菌体培养：将液体低温保藏的菌种于室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37℃下连续培养14-20天。
2)菌体收集：待菌体生长至对数期后，收集培养瓶内的菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后备用。
3)菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按10:1的比例加入去离子蒸馏水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，每次3min，共3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液0.5-2.0倍体积量的热苯酚(30-100℃)，在低速搅拌中保温30分钟-1小时。
4)卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚处理好的混合液自然沉淀1-10天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45μm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物。
5)在所收集的卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为70-75％。自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。
本发明的有益效果是：(1)本发明所述的卡介菌多糖核酸与其他化学诱导增殖因子相比，符合细胞培养要求，即对人体无毒副作用，故诱导增殖后的CIK细胞直接可以用于临床试验。(2)与相应的多糖刺激因子相比，本发明所述的多糖提取方法精练，剂型先进，该多糖提取液功效明显，成分明确，质量可控。(3)本发明所述的卡介菌多糖核酸具有明显提高CIK细胞增殖速率的作用，CD3和CD56双阳性显著提高，激活后的细胞杀伤力明显高于对照CIK细胞处理。
附图说明
图1卡介菌多糖核酸不同浓度诱导细胞增值趋势图。
图2最优浓度卡介菌多糖核酸诱导后CIK细胞对肿瘤的杀伤力评价。
具体实施方式
下面结合具体附图对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案，或者利用已有的临床中药注射剂而产生的其他具体的实施方案。
主要材料的准备。
一种对CIK细胞增殖分化有明显提高作用的卡介菌多糖核酸，其方法步骤如下：
(1)将液体低温保藏的菌种室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，连续培养14-20天。
(2)待菌体生长至对数期后，收集菌膜，洗涤，压干。
(3)以组织捣碎匀浆机破碎收集的菌体，经热苯酚，在低速搅拌中保温处理。
(4)将热酚处理好的混合液自然沉淀，吸取上清液，离心后过滤除菌，即为卡介菌多糖核酸混合物。
(5)将所收集的卡介菌多糖核酸提取液进行醇沉，自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤后，真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。
(6)精密称取经真空干燥的卡介菌多糖核酸加水溶解，定容，所配得的溶液即为卡介菌多糖核酸溶液。
实施例1卡介菌的培养和收获
1.菌体培养：将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37℃：连续培养14-20天。
其中，马铃薯苏通培养基的制备方法可以是：
(1)取洗净新鲜土豆(1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成4公分长斜面；用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时，再用纯化水冲洗土豆斜面块；用苏通培养基冲洗斜面块，取苏通培养基20ml，加入100ml灭菌大管中；
(2)将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；
(3)0.11MPa的大气压121℃，灭菌20分钟。放冷至室温待接种。
苏通培养基配制比例：
每1000ml：
2、菌体收集：待菌体生长至对数期后，收集培养瓶内菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重。
实施例2卡介菌多糖核酸混合物的制备
1.菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按10:1的比例加入去离子蒸馏水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，每次3min，共3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液0.5～2.0倍体积量的热苯酚(30-100℃)，在低速搅拌中保温30～60分钟。
2.卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚处理好的混合液自然沉淀1-10天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45μm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物。
3.在收集的卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为70-75％。自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。
4.精密称取经50℃真空干燥的卡介菌多糖核酸0.1g，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，用移液管移取1mL至25mL容量瓶中，加水定容至25mL。所配得的溶液即为卡介菌多糖核酸溶液。
实施例3利用细胞增殖速率筛选卡介菌多糖核酸的最优浓度
按常规CIK细胞培养方法，即第0天加入IFN-γ(1 000U/mL)，CD3单抗(25ng/mL)，置于CO2培养箱37℃孵育24h后获得的CIK细胞作为出发细胞。
在出发细胞中分别加入含3种浓度梯度的卡介菌多糖核酸(已高温灭菌)的RPMI1640培养基，置于12孔板内培养，其中浓度梯度为35μg/mL、3.5μg/mL、0.35μg/mL(即每1mL培养体系中含有卡介菌多糖的量分别是35μg、3.5μg和0.35μg)，将加入不含卡介菌多糖核酸的RPMI 1640培养基作为对照，37℃，5％CO2培养箱内培养7d，定期更换1/2对应培养液(例如培养3天时)。每天计算细胞浓度，分析每组细胞的增殖趋势。
结果如图1。从对比实验结果可以看出，与不含卡介菌多糖核酸的对照组相比，实验组中加入35μg/mL、3.5μg/mL、0.35μg/mL的卡介菌多糖后，能显著提高CIK细胞增殖分化速率，其中卡介菌多糖核酸的最优浓度为35μg/mL。
实施例4在最优浓度下的进行细胞流式检测细胞表型
将上述方法获得的CIK出发细胞分别进行测试，A、B组代表最优浓度的卡介菌多糖核酸RPMI 1640培养基和不含卡介菌多糖核酸的RPMI 1640培养基(对照)。37℃，5％CO2培养箱内培养，约3d更换1/2对应培养液。培养7d后将细胞液混匀取出置于15mL离心管中，1500rpm离心15min后分别加入CD3FITC-H、CD56PE-H单抗各10μl，室温避光孵育30min。流式细胞仪(Flow cytometry)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞。经35μg/mL卡介菌多糖核酸诱导后的细胞双阳性为73.9％，较对照的CD3﹢CD56﹢双阳性70.1％增加了3.8％。
实施例5在最优浓度诱导下的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力测定。
在卡介菌多糖核酸的最优浓度下，用卡介菌多糖核酸培养细胞，将培养瓶中已培养7d的细胞吸出置于15mL离心管中，离心弃去上清液，用0.9％NaCl洗脱CIK细胞两次后，加0.8mL RPMI 1640培养基，计数，得出细胞浓度。弃去肿瘤细胞培养瓶中的上清液，加1.5mL胰酶漂洗并弃去漂洗液，再加入1mL胰酶，37℃，3min。轻拍后加5mL预热的RPMI 1640终止反应。1200rpm，5min离心收集肿瘤细胞，洗脱两次后，加10mL RPMI 1640培养基，计数，得出细胞浓度。稀释细胞，并按细胞个数比等体积加液(CIK细胞液与肿瘤细胞A549液各100μl，共200μl一孔)。阳性对照：100μl肿瘤细胞稀释液+100μlCIK细胞液，阴性对照：200μlCIK细胞液。加好液后，放于37度，CO2浓度5％培养12小时。2小时后取出孔板，将原各孔中200μl液体吸去并用200μl培养基清洗5次。各孔平均加入100ul含10％CCK8的1640对细胞进行染色，放于37度，CO2浓度5％中培养4小时。取出孔板，拿到酶标仪上检测，得出卡介菌多糖核酸诱导的CIK细胞对肿瘤细胞杀伤力结果。如图2所示结果，在靶效比E：T＝20：1时，卡介菌多糖核酸诱导后的CIK细胞对A549肿瘤细胞的杀伤力达到93.3％，明显高于对照。
Claims (3)
1.卡介菌多糖核酸在体外培养CIK 细胞中的应用，其特征在于， CIK细胞培养过程包括制备CIK细胞的出发细胞，在出发细胞中加入含有卡介菌多糖核酸的RPMI1640培养基，所述卡介菌多糖核酸的制备方法包括如下步骤：
1)将液体低温保藏的菌种室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，连续培养14-20天；
2)待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，洗涤，压干；
3)将收集的菌体以组织捣碎匀浆机破碎菌体，经热苯酚，在低速搅拌中保温处理；
4)将热酚处理好的混合液自然沉淀1至7天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45µm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物；
5)将所收集的卡介菌多糖核酸混合物加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为80%，自然沉淀4天后，收集沉淀物，沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；
所述卡介苗多糖核酸的添加量是1ml培养体系中含35μg的卡介菌多糖核酸。
2.一种CIK细胞体外培养的方法，包括
（1）制备CIK细胞的出发细胞；
（2）配制含有卡介菌多糖核酸的RPMI1640培养基，并添加入步骤（1）中的出发细胞，经培养获得CIK细胞；
所述卡介菌多糖核酸的制备方法包括如下步骤：
1)将液体低温保藏的菌种室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，连续培养14-20天；
2)待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，洗涤，压干；
3)将收集的菌体以组织捣碎匀浆机破碎菌体，经热苯酚，在低速搅拌中保温处理；
4)将热酚处理好的混合液自然沉淀1至7天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45µm无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物；
5)将所收集的卡介菌多糖核酸混合物加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为80%，自然沉淀4天后，收集沉淀物，沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至50℃真空干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；
所述的卡介苗多糖核酸的使用量是1ml培养体系中含35μg的卡介菌多糖核酸。
3.利用权利要求2所述的CIK细胞体外培养的方法制得的CIK细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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