CN107099504A - 一种造血干细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种造血干细胞培养基，包括基础培养基和添加于基础培养基中的添加剂，按终浓度计，所述添加剂包括以下含量的组分：FBS100‑200mg/mL、亚硒酸钠0.02‑0.03μmol/mL、卡介菌多糖核酸5‑10mg/mL、千金藤素50‑100μmol/mL、海藻糖50‑100ng/mL、维生素C40‑80ng/mL、第一细胞因子缓释微囊1.5‑2.5mg/mL、第二细胞因子缓释微囊25‑50mg/mL。本发明的造血干细胞培养基可显著提高造血干细胞的扩增率和细胞活性，使造血干细胞能长久处于增殖不分化状态，保持其干细胞特性。

Description

一种造血干细胞培养基
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种造血干细胞培养基。
背景技术
造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。由于造血干细胞具有多向分化的潜能，将造血干细胞移植到体内是治疗白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤、代谢性疾病、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等严重危害人类健康疾病的有效方法，可以有效的减轻患者的痛苦。但是，由于造血干细胞在体内的数量极少，大大的限制了造血干细胞在临床中的应用。
骨髓、外周血和脐血是造血干细胞的重要来源。与骨髓和外周血造血干细胞相比，脐带血造血干细胞更为原始，自我增殖能力最强，且脐带血具有富含更早期的造血干细胞、采集方便，造血干细胞免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、移植过程中不需要严格配型、成熟性T 细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34+CD38- 与CD34+CD33- 的比例较高等优点，因而脐带血造血干细胞具有极大的临床应用价值。但是，单份脐血的造血干细胞含量低，在临床中很难用于正常体重成人患者的移植。因此，造血干细胞在移植前需要进行体外扩增。
目前，造血干细胞的体外增殖途径主要有两种，一种是通过基质的灌注进行体外培养，但是，基质含有各种细胞和各种蛋白成分，成分复杂且不明确，对后期造血干细胞的分离造成较大难度，且成本较高，大大限制了在造血干细胞体外扩增的应用；第二种是将造血干细胞接种于造血干细胞培养基进行体外培养。然而，采用现有造血干细胞培养基培养的造血干细胞大多存在活性和增殖能力较差的问题，且造血干细胞易分化。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种造血干细胞培养基，采用该培养基可显著提高造血干细胞的扩增率和细胞活性，使造血干细胞能长久处于增殖不分化状态，保持其干细胞特性。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种造血干细胞培养基，所述造血干细胞培养基包括基础培养基和添加于基础培养基中的添加剂，按终浓度计，所述添加剂包括以下含量的组分：FBS 100-200mg/mL、亚硒酸钠0.02-0.03μmol/mL、卡介菌多糖核酸5-10mg/mL、千金藤素50-100μmol/mL、海藻糖50-100ng/mL、维生素 C40-80ng/mL、第一细胞因子缓释微囊1.5-2.5mg / mL、第二细胞因子缓释微囊25-50mg/mL。
本发明将千金藤素添加到造血干细胞培养基中，和卡介菌多糖核酸相合，相对于普通培养基，其能够显著提高造血干细胞增殖率，使造血干细胞具有干性强、活性高的特点；维生素C和海藻糖不仅能够具有抗氧化作用，而且能够降低造血干细胞的氧分压，使造血干细胞在增殖的过程中处于低氧环境中，有利于造血干细胞的增殖。
优选地，所述第一细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
A、将IL-3、IL-6、GM-CSF、聚乙二醇加入预先添加有甘露醇和硫酸锌的水溶液中，搅拌均匀后，得到混合物A，所述混合物A中IL-3、IL-6、GM-CSF的浓度均为1-2wt％，聚乙二醇的浓度为6-10 wt％；
B、将聚羟基乙酸- 聚乳酸- 聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物B， 所述混合物B中聚羟基乙酸- 聚乳酸- 聚乙二醇的浓度为12-18wt％；
C、将混合物A 加入到混合物B 中，搅拌均匀后，得到混合物C，所述混合物A和混合物B的体积比为1:1-2；
D、将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物D；所述混合物D中聚乙烯醇的浓度为1-2 wt %，壳聚糖的浓度为0.5-1 wt %，氯化钠的浓度为1-2 wt %；
E、将混合物C加入混合物D中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得第一细胞因子缓释微囊。
优选地，所述第一细胞因子缓释微囊的粒径为50-90μm。
优选地，所述聚乙烯醇由质量比为1:0.5-2的无规聚乙烯醇和间规聚乙烯组成。
优选地，所述无规聚乙烯醇的聚合度为600-1000，所述间规聚乙烯的聚合度为1800-2500。
优选地，所述混合物A中，甘露醇的浓度为2-4 wt％，碳酸锌的浓度为1-3 wt％。
优选地，所述第二细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
S1、将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶-3配体、聚乙二醇加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液，搅拌均匀后，得到混合物Ⅰ，所述混合物A中干细胞因子的浓度为2-4wt％，FMS样酪氨酸激酶-3配体的浓度为2-4wt％、聚乙二醇的浓度为4-8wt％；
S2、将聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物Ⅱ， 所述混合物Ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的浓度为13-20wt％；
S3、将混合物Ⅰ加入到混合物Ⅱ 中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅲ ，所述混合物Ⅰ和混合物Ⅱ的体积比为1:1-2；
S4、将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅳ；所述混合物Ⅳ中聚乙烯醇的浓度为1-2 wt %，壳聚糖的浓度为0.5-1 wt %，海藻酸钠的浓度为2-4wt%；
S5、将混合物Ⅲ加入混合物Ⅳ中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得第二细胞因子缓释微囊。
优选地，所述第二细胞因子缓释微囊的粒径为60-100μm。
优选地，所述第二细胞因子缓释微囊采用的聚乙烯醇与第一细胞因子缓释微囊相同。
优选地，所述混合物Ⅰ中，所述葡聚糖的浓度为4-6wt％，季戊四醇锌盐的浓度为2-4 wt％。
本发明将间规聚乙烯醇、无规聚乙烯醇和壳聚糖复合，作为凝胶的原料，提高了凝胶的热学性能和机械性能，同时为细胞提供充足的生长空间和支持细胞间联系的空间结构，获得的细胞的活性更强。聚乙烯醇、壳聚糖以及氯化钠相配合，可增强聚乙烯醇分子间和分子链的交联，优化凝胶的性能，提高制备缓释微球的效率，从而更有利于CD34+细胞的生长，增加CD34+细胞 的扩增倍数，避免各细胞因子浓度减少过快，浓度差异大，影响细胞增殖速率和细胞性状的稳定性。
本发明的第二细胞因子缓释微囊和第一细胞因子缓释微囊具有长效缓释、无毒副作用等优点。
优选地，所述基础培养基为DMEM培养基。
优选地，所述步骤（1）中，红细胞裂解液与收集到的下层的单个核细胞的体积比为1：0.5-2，在室温下裂解3-5min。分离的单个核细胞中，存在一定量的红细胞。由于红细胞会使CD34+ 免疫磁珠与单个核细胞孵育时细胞聚集成团，从而影响CD34+ 免疫磁珠与CD34+细胞，本发明很好地解决了上述问题。
本发明的有益效果在于：本发明的造血干细胞培养基各成分相互协调，共同作用，性能稳定，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，显著提高免疫细胞的扩增速度，在造血干细胞培养基中添加第二细胞因子缓释微囊和第一细胞因子缓释微囊，利用其缓释特性使生长因子在培养基中能够持续平稳、释放，可防止培养基中各细胞因子浓度变化快给细胞带来损害，可提高工作效率，使免疫细胞平稳扩增，与卡介菌多糖核酸、千金藤素和其他组分相配合，不仅能够降低大剂量细胞因子带来的毒副作用，而且能够提高造血干细胞的增殖率，能较好的保持干细胞的干性，培养后培养液中未检测未检出真菌、细菌、支原体，微生物检测指标符合要求。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例中，一种造血干细胞培养基，包括DMEM培养基和添加于DMEM培养基中的添加剂，按终浓度计，所述添加剂包括以下含量的组分：FBS 150mg/mL、亚硒酸钠0.025μmol/mL、卡介菌多糖核酸7mg/mL、千金藤素70μmol/mL、海藻糖60ng/mL、维生素 C50ng/mL、第一细胞因子缓释微囊2mg / mL、第二细胞因子缓释微囊35mg/mL。
优选地，所述第一细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
A、将IL-3、IL-6、GM-CSF、聚乙二醇加入预先添加有甘露醇和硫酸锌的水溶液中，搅拌均匀后，得到混合物A，所述混合物A中IL-3、IL-6、GM-CSF的浓度均为1.5wt％，聚乙二醇的浓度为8wt％；所述甘露醇的浓度为3wt％，碳酸锌的浓度为2wt％；
B、将聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物B，所述混合物B中聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇的浓度为12-18wt％；
C、将混合物A加入到混合物B中，搅拌均匀后，得到混合物C，所述混合物A和混合物B的体积比为1:1.5；
D、将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物D；所述混合物D中聚乙烯醇的浓度为1.5 wt %，壳聚糖的浓度为0.8 wt %，氯化钠的浓度为1.5 wt %；
E、将混合物C加入混合物D中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得粒径为50-90μm的第一细胞因子缓释微囊。
优选地，所述聚乙烯醇由质量比为1:1的无规聚乙烯醇和间规聚乙烯组成。所述无规聚乙烯醇的聚合度为600-1000，所述间规聚乙烯的聚合度为1800-2500。
优选地，所述第二细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
S1、将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶-3配体、聚乙二醇加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液，搅拌均匀后，得到混合物Ⅰ，所述混合物A中干细胞因子的浓度为3wt％，FMS样酪氨酸激酶-3配体的浓度为3wt％、聚乙二醇的浓度为6wt％；所述葡聚糖的浓度为5wt％，季戊四醇锌盐的浓度为3wt％。
S2、将聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物Ⅱ， 所述混合物Ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的浓度为16wt％；
S3、将混合物Ⅰ加入到混合物Ⅱ 中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅲ ，所述混合物Ⅰ和混合物Ⅱ的体积比为1:1.5；
S4、将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅳ；所述混合物Ⅳ中聚乙烯醇的浓度为1.5 wt %，壳聚糖的浓度为0.7 wt %，海藻酸钠的浓度为3wt %；
S5、将混合物Ⅲ加入混合物Ⅳ中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得粒径为60-100μm的第二细胞因子缓释微囊。
本实施例中，一种造血干细胞培养方法，包括以下步骤：
（1）采集脐带血，加入等体积的PBS稀释后，得到脐带血稀释液；往脐带血稀释液中加入浓度为0.5%的甲基纤维素溶液，脐带血稀释液与甲基纤维素溶液的体积比为1:0.3混匀后，沉降脐带血中的红细胞，并吸出上清液；将上清液离心后弃掉所得的上清液，加入PBS重悬细胞，得细胞悬液；往细胞悬液加入淋巴细胞分离液，静置，离心，弃掉上清液后，将红细胞裂解液添加于收集到的下层的单个核细胞中，红细胞裂解液与收集到的下层的单个核细胞的体积比为1:0.5，在室温下裂解5min；加入PBS洗涤并再次重悬细胞，得细胞重悬液；
（2）调整单个核细胞密度为1- 2×108个/mL，往细胞重悬液加入CD34+ 抗体，所述CD34+抗体的添加量为100μL/mL细胞重悬液，混匀，室温下孵育20min，加入CD34+ 免疫磁珠混匀，所述CD34+ 免疫磁珠的添加量为50μL/mL细胞重悬液，室温孵育下20 min，用细胞洗涤液洗涤后置于磁场中，静置后弃掉上清液，得到造血干细胞CD34+细胞；优选地，所述细胞洗涤液为添加有1％FBS和0.01％ EDTA的PBS溶液；
（3）将造血干细胞CD34+细胞，将细胞接种于造血干细胞培养基，调整造血干细胞CD34+细胞密度为1×105 -2×105/mL，置于37℃，5%CO2 饱和湿度培养箱中培养6天后，收获细胞；
实施例2
优选地，所述造血干细胞培养基包括DMEM培养基和添加于DMEM培养基中的添加剂，按终浓度计，所述添加剂包括以下含量的组分：FBS 100mg/mL、亚硒酸钠0.03μmol/mL、卡介菌多糖核酸5mg/mL、千金藤素100μmol/mL、海藻糖50ng/mL、维生素 C80ng/mL、第一细胞因子缓释微囊1.5mg/mL、第二细胞因子缓释微囊50mg/mL。
优选地，所述第一细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
A、将IL-3、IL-6、GM-CSF、聚乙二醇加入预先添加有甘露醇和硫酸锌的水溶液中，搅拌均匀后，得到混合物A，所述混合物A中IL-3、IL-6、GM-CSF的浓度均为1wt％，聚乙二醇的浓度为10 wt％；所述甘露醇的浓度为2wt％，碳酸锌的浓度为3 wt％。
B、将聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物B， 所述混合物B中聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇的浓度为12wt％；
C、将混合物A 加入到混合物B 中，搅拌均匀后，得到混合物C，所述混合物A和混合物B的体积比为1:1；
D、将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物D；所述混合物D中聚乙烯醇的浓度为1 wt %，壳聚糖的浓度为1 wt %，氯化钠的浓度为1wt %；
E、将混合物C加入混合物D中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得粒径为50-90μm的第一细胞因子缓释微囊。
优选地，所述聚乙烯醇由质量比为1:0.5的无规聚乙烯醇和间规聚乙烯组成。所述无规聚乙烯醇的聚合度为600-1000，所述间规聚乙烯的聚合度为1800-2500。
优选地，所述第二细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
S1、将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶-3配体、聚乙二醇加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液，搅拌均匀后，得到混合物Ⅰ，所述混合物A中干细胞因子的浓度为2wt％，FMS样酪氨酸激酶-3配体的浓度为4wt％、聚乙二醇的浓度为4wt％；所述葡聚糖的浓度为4wt％，季戊四醇锌盐的浓度为4 wt％；
S2、将聚乳酸- 聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物Ⅱ， 所述混合物Ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的浓度为13wt％；
S3、将混合物Ⅰ加入到混合物Ⅱ 中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅲ ，所述混合物Ⅰ和混合物Ⅱ的体积比为1:1；
S4、将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅳ；所述混合物Ⅳ中聚乙烯醇的浓度为1 wt %，壳聚糖的浓度为1 wt %，海藻酸钠的浓度为2wt %；
S5、将混合物Ⅲ加入混合物Ⅳ中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得粒径为60-100μm的第一细胞因子缓释微囊。
本实施例中，一种造血干细胞培养方法，包括以下步骤：
（1）采集脐带血，加入等体积的PBS稀释后，得到脐带血稀释液；往脐带血稀释液中加入浓度为0.4%的甲基纤维素溶液，脐带血稀释液与甲基纤维素溶液的体积比为1:0.2混匀后，沉降脐带血中的红细胞，并吸出上清液；将上清液离心后弃掉所得的上清液，加入PBS重悬细胞，得细胞悬液；往细胞悬液加入淋巴细胞分离液，静置，离心，弃掉上清液后，将红细胞裂解液添加于收集到的下层的单个核细胞中，红细胞裂解液与收集到的下层的单个核细胞的体积比为1:1，在室温下裂解4min；加入PBS洗涤并再次重悬细胞，得细胞重悬液；
（2）调整单个核细胞密度为1-2×108个/mL，往细胞重悬液加入CD34+ 抗体，所述CD34+抗体的添加量为100μL/mL细胞重悬液，混匀，室温下孵育15min，加入CD34+ 免疫磁珠混匀，所述CD34+ 免疫磁珠的添加量为50μL/mL细胞重悬液，室温孵育下25 min，用细胞洗涤液洗涤后置于磁场中，静置后弃掉上清液，得到造血干细胞CD34+细胞；优选地，所述细胞洗涤液为添加有1.1％FBS和0.08％ EDTA的PBS溶液。
（3）：将造血干细胞CD34+细胞，将细胞接种于造血干细胞培养基，调整造血干细胞CD34+细胞密度为1×105 -2×105/mL，置于37℃，5%CO2 饱和湿度培养箱中培养6天后，收获细胞。
实施例3
本实施例中，一种造血干细胞培养方法，包括以下步骤：
（1）采集脐带血，加入等体积的PBS稀释后，得到脐带血稀释液；往脐带血稀释液中加入浓度为0.3%的甲基纤维素溶液，脐带血稀释液与甲基纤维素溶液的体积比为1:0.15混匀后，沉降脐带血中的红细胞，并吸出上清液；将上清液离心后弃掉所得的上清液，加入PBS重悬细胞，得细胞悬液；往细胞悬液加入淋巴细胞分离液，静置，离心，弃掉上清液后，将红细胞裂解液添加于收集到的下层的单个核细胞中，红细胞裂解液与收集到的下层的单个核细胞的体积比为1:0.5，在室温下裂解5min；加入PBS洗涤并再次重悬细胞，得细胞重悬液；
（2）调整单个核细胞密度为1- 2×108个/mL，往细胞重悬液加入CD34+ 抗体，所述CD34+抗体的添加量为90μL/mL细胞重悬液，混匀，室温下孵育25min，加入CD34+ 免疫磁珠混匀，所述CD34+ 免疫磁珠的添加量为52μL/mL细胞重悬液，室温孵育下15min，用细胞洗涤液洗涤后置于磁场中，静置后弃掉上清液，得到造血干细胞CD34+细胞；优选地，所述细胞洗涤液为添加有0.9％FBS和0.12％EDTA的PBS溶液。
（3）：将造血干细胞CD34+细胞，将细胞接种于造血干细胞培养基，调整造血干细胞CD34+细胞密度为1×105 -2×105/mL，置于37℃，5%CO2 饱和湿度培养箱中培养6天后，收获细胞。
优选地，所述造血干细胞培养基包括DMEM培养基和添加于DMEM培养基中的添加剂，按终浓度计，所述添加剂包括以下含量的组分：FBS 200mg/mL、亚硒酸钠0.02μmol/mL、卡介菌多糖核酸10mg/mL、千金藤素50μmol/mL、海藻糖100ng/mL、维生素 C40ng/mL、第一细胞因子缓释微囊2.5mg/mL、第二细胞因子缓释微囊25mg/mL。
优选地，所述第一细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
A、将IL-3、IL-6、GM-CSF、聚乙二醇加入预先添加有甘露醇和硫酸锌的水溶液中，搅拌均匀后，得到混合物A，所述混合物A中IL-3、IL-6、GM-CSF的浓度均为2wt％，聚乙二醇的浓度为6 wt％；所述甘露醇的浓度为4 wt％，碳酸锌的浓度为1wt％，所述葡聚糖的浓度为6wt％，季戊四醇锌盐的浓度为2wt％。
B、将聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物B， 所述混合物B中聚羟基乙酸-聚乳酸-聚乙二醇的浓度为12-18wt％；
C、将混合物A 加入到混合物B 中，搅拌均匀后，得到混合物C，所述混合物A和混合物B的体积比为1: 2；
D、将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物D；所述混合物D中聚乙烯醇的浓度为2 wt %，壳聚糖的浓度为0.5wt %，氯化钠的浓度为2 wt %；
E、将混合物C加入混合物D中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得粒径为50-90μm的第一细胞因子缓释微囊。
优选地，所述聚乙烯醇由质量比为1: 2的无规聚乙烯醇和间规聚乙烯组成。所述无规聚乙烯醇的聚合度为600-1000，所述间规聚乙烯的聚合度为1800-2500。
优选地，所述第二细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
S1、将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶-3配体、聚乙二醇加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液，搅拌均匀后，得到混合物Ⅰ，所述混合物A中干细胞因子的浓度为4wt％，FMS样酪氨酸激酶-3配体的浓度为2wt％、聚乙二醇的浓度为8wt％；
S2、将聚乳酸-聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物Ⅱ， 所述混合物Ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的浓度为20wt％；
S3、将混合物Ⅰ加入到混合物Ⅱ中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅲ ，所述混合物Ⅰ和混合物Ⅱ的体积比为1: 2；
S4、将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅳ；所述混合物Ⅳ中聚乙烯醇的浓度为2 wt %，壳聚糖的浓度为0.5 wt %，海藻酸钠的浓度为4 wt %；
S5、将混合物Ⅲ加入混合物Ⅳ中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得粒径为60-100μm的第一细胞因子缓释微囊。
对比例
以对照例培养基作为对比例，对照例培养基与实施例1的造血干细胞培养基相比，添加有干细胞生长因子75ng/mL、人FMS样酪氨酸激酶1配体35ng/mL、IL-3 4ng/mL、IL-6 4ng/mL、白介素-6、GM-CSF4 ng/mL，未添加卡介菌多糖核酸、千金藤素、第一细胞因子缓释微囊和第二细胞因子缓释微囊。
利用对照例培养基培养造血干细胞的方法，操作过程与实施例1相同。
分别取实施例1-4和对照例培养最终获得的细胞，采用用Becton Dickinson 型流式细胞仪对收获后的细胞进行计数，并对扩增前后的细胞进行CD34-FITC 抗体检测，细胞标记方法为：细胞用PBS 缓冲盐溶液洗涤一次，加入CD34-FITC 抗体10μL，4℃避光孵育30min；孵育结束后用PBS 缓冲盐溶液再洗涤一次，使用流式细胞仪分析CD34+细胞的含量，检测结果如表1所示：
表1 CD34+细胞的流式细胞仪检测结果
项目 实施例1 实施例2 实施例3 对比例
细胞总数(个/mL) 1.14×108 0.98×108 1.05×108 0.74×108
CD34+细胞比例% 94.8 92.4 93.5 80.2
由表1可知，采用本发明的造血干细胞基培养所获得的细胞数量及CD34+细胞比例均显著提高。
分别取实施例1-3和对照例培养最终获得的细胞，经流式细胞术分析G0/G1期、G2/M期细胞百分比，检测结果如表2所示：
项目 实施例1 实施例2 实施例3 对比例
G0/G1期细胞百分比% 73.3 70.2 72.1 58.7
G2/M期细胞百分比% 7.8 11.8 8.9 20.8
由表2可知，实施例1-3中处于G0/G1期细胞百分比均大于对照组，表明采用本发明的造血干细胞基所获得的活细胞数量多于对比例；同时实施例1-3处于G0/G1期的细胞百分比远大于G2/M 期，表明采用本发明的造血干细胞培养基能够延长造血干细胞的G0/G1期，使其能够长期处于增殖状态而不分化，从而保持造血干细胞的干细胞特性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种造血干细胞培养基，其特征在于：包括基础培养基和添加于基础培养基中的添加剂，按终浓度计，所述添加剂包括以下含量的组分：FBS 100-200mg/mL、亚硒酸钠0.02-0.03μmol/mL、卡介菌多糖核酸5-10mg/mL、千金藤素50-100μmol/mL、海藻糖50-100ng/mL、维生素 C 40-80ng/mL、第一细胞因子缓释微囊1.5-2.5mg / mL、第二细胞因子缓释微囊25-50mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种造血干细胞培养基，其特征在于：所述第一细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
A、将IL-3、IL-6、GM-CSF、聚乙二醇加入预先添加有甘露醇和硫酸锌的水溶液中，搅拌均匀后，得到混合物A，所述混合物A中IL-3、IL-6、GM-CSF的浓度均为1-2wt％，聚乙二醇的浓度为6-10 wt％；
B、将聚羟基乙酸- 聚乳酸- 聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物B， 所述混合物B中聚羟基乙酸- 聚乳酸- 聚乙二醇的浓度为12-18wt％；
C、将混合物A 加入到混合物B 中，搅拌均匀后，得到混合物C，所述混合物A和混合物B的体积比为1:1-2；
D、将聚乙烯醇、壳聚糖和氯化钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物D；所述混合物D中聚乙烯醇的浓度为1-2 wt %，壳聚糖的浓度为0.5-1 wt %，氯化钠的浓度为1-2 wt %；
E、将混合物C加入混合物D中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得第一细胞因子缓释微囊。
3.根据权利要求2所述的一种造血干细胞培养基，其特征在于：所述第一细胞因子缓释微囊的粒径为50-90μm。
4.根据权利要求3所述的一种造血干细胞培养基，其特征在于：所述聚乙烯醇由质量比为1:0.5-2的无规聚乙烯醇和间规聚乙烯组成。
5.根据权利要求5所述的一种造血干细胞培养基，其特征在于：所述无规聚乙烯醇的聚合度为600-1000，所述间规聚乙烯的聚合度为1800-2500。
6.根据权利要求2所述的一种造血干细胞培养基，其特征在于：所述混合物A中，所述甘露醇的浓度为2-4 wt％，碳酸锌的浓度为1-3 wt％。
7.根据权利要求1所述的一种造血干细胞培养基，其特征在于：所述第二细胞因子缓释微囊的制备方法包括以下步骤：
S1、将干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶-3配体、聚乙二醇加入预先添加有葡聚糖和季戊四醇锌盐的水溶液，搅拌均匀后，得到混合物Ⅰ，所述混合物A中干细胞因子的浓度为2-4wt％，FMS样酪氨酸激酶-3配体的浓度为2-4wt％、聚乙二醇的浓度为4-8wt％；
S2、将聚乳酸- 聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，搅拌均匀后，得到混合物Ⅱ， 所述混合物Ⅱ中聚乳酸-聚乙二醇的浓度为13-20wt％；
S3、将混合物Ⅰ加入到混合物Ⅱ 中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅲ ，所述混合物Ⅰ和混合物Ⅱ的体积比为1:1-2；
S4、将聚乙烯醇、壳聚糖和海藻酸钠加入水中，搅拌均匀后，得到混合物Ⅳ；所述混合物Ⅳ中聚乙烯醇的浓度为1-2 wt %，壳聚糖的浓度为0.5-1 wt %，海藻酸钠的浓度为2-4 wt%；
S5、将混合物Ⅲ加入混合物Ⅳ中，搅拌进行溶剂挥发，经洗涤、离心分离、真空冷冻干燥，制得第二细胞因子缓释微囊。
8.根据权利要求7所述的一种造血干细胞培养基，其特征在于：所述第二细胞因子缓释微囊的粒径为60-100μm。
9.根据权利要求7所述的一种造血干细胞培养基，其特征在于：优选地，所述混合物Ⅰ中，所述葡聚糖的浓度为4-6 wt％，季戊四醇锌盐的浓度为2-4 wt％。
10.根据权利要求1所述的一种造血干细胞培养基，其特征在于：所述基础培养基为DMEM培养基。
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