CN106434559A - 千金藤碱的应用以及一种扩增造血干细胞的培养基和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了千金藤碱在制备造血干细胞体外扩增培养基和/或在体外扩增造血干细胞中的应用以及一种包含千金藤碱扩增脐血造血干细胞的培养基和方法。本发明通过多种适宜组分与千金藤碱组成体外扩增培养基，在造血干细胞体外扩增时，可显著提高其扩增效果，使其具有干性强、活性高的特点。

Description

千金藤碱的应用以及一种扩增造血干细胞的培养基和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及千金藤碱的应用以及一种扩增造血干细胞的培养基和方法。
背景技术
造血干细胞是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。造血干细胞是治疗白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等严重危害人类健康疾病的有效方法，可以有效的减轻患者的痛苦。
自1989年Gluckman等首次对1例5岁Fanconi贫血男孩进行了HLA匹配脐血移植治疗获得成功以来，脐血移植在造血干细胞移植领域中越来越突显其优势。然而，单份脐血造血干细胞含量有限，不能满足50kg以上成人的使用，因此，脐血造血干细胞的扩增研究是国内外研究的热点。
目前体外扩增造血干细胞的途径主要采用加入血清和多种细胞因子的液体培养基、或与基质细胞共培养或在生物反应器中培养等方法，但是上述方法仍不能获得充足的、具有移植活性的造血干细胞用于临床治疗，而且容易造成造血干细胞的干性丢失、造成移植的失败。
中国专利CN105112374A公开了一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基及其应用，所述体外扩增培养基以IMEM基础培养基为基础，添加血清、血小板生成素、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、白介素-1、白介素-6、干细胞生长因子和小檗碱。用于脐血造血干细胞体外扩增时，具有造血干细胞增殖率高的优点，而且能显著提高造血干细胞移植到受体内的植入能力和造血系统的重建能力，能较好的保持造血干细胞的特性。但是，经过研究发现，上述培养基对于造血干细胞数量和含量的增殖仍有所欠缺，有待于进一步提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供千金藤碱在培养扩增造血干细胞中的应用，使其能够促进造血干细胞，特别是脐血造血干细胞的增殖能力，显著提高在数量和含量方面的增殖效果。
本发明的另外一个目的在于提供包含千金藤碱的培养基，使得所述培养基能够促进造血干细胞，特别是脐血造血干细胞数量和含量的增殖。
本发明的另外一个目的在于提供一种运用包含千金藤碱的培养基体外扩增脐血造血干细胞的方法，使得所述方法最终结果显著提高了脐血造血干细胞数量和含量的增殖效果。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
千金藤碱在制备造血干细胞体外扩增培养基和/或在体外扩增造血干细胞中的应用。作为优选，所述造血干细胞为脐血造血干细胞。
千金藤碱，又名千金藤素，是一种从传统中草药防己科千金藤属植物中提取分离出来的双苄基异喹啉类生物碱，其具有多种生物功能，如抗炎、抑菌、增强免疫功能等，被广泛地用于治疗各种急慢性疾病，而且毒副作用低。在临床上千金藤碱可使外周血白细胞增多，用于因肿瘤化疗、放疗引起的粒细胞缺乏症和其他原因引起的白细胞减少症。目前未见报道千金藤碱对脐血造血干细胞的体外增值作用。
本发明将千金藤碱作为新的组分，添加到脐血造血干细胞扩增培养基中，相对于普通扩增培养基，其能够显著提高脐血造血干细胞在数量和含量上的增殖效果，使造血干细胞具有干性强、活性高的特点。基于此，本发明提供了一种包含千金藤碱的脐血造血干细胞体外扩增培养基
根据本发明研究发现，千金藤碱在50-100μmol/mL范围内，不仅表现出对脐血造血干细胞低毒的优点，而且还最大程度表现出其优异的增殖促进效果。同时，本发明针对千金藤碱的优势，还选择其它适宜的组分共同作组成脐血造血干细胞的体外扩增培养基，这些适宜的组分包括：
DMEM/F12培养基、FBS、血小板生成素、干细胞生长因子、人FMS样酪氨酸激酶1配体、白介素-1、白介素-6。
在具体的实施方式中，上述各组分以DMEM/F12培养基为基础培养基，添加如下浓度的各成分：
5％-10％的FBS、15-30ng/ml血小板生成素、100-200ng/ml干细胞生长因子、33-56ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体、0.2-0.5ng/ml白介素-1、0.2-0.5ng/ml白介素-6、50-100μmol/ml千金藤碱。
作为优选地的方案，各成分浓度为8％的FBS、20ng/ml血小板生成素、150ng/ml干细胞生长因子、45ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体、0.4ng/ml白介素-1、0.4ng/ml白介素-6、75μmol/ml千金藤碱。
在本发明的一些具体实施方式中，各成分浓度还可选择如下：
(1)5％的FBS、15ng/ml血小板生成素、100ng/ml干细胞生长因子、33ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体、0.2ng/ml白介素-1、0.2ng/ml白介素-6、50μmol/ml千金藤碱。
(2)10％的FBS、30ng/ml血小板生成素、200ng/ml干细胞生长因子、56ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体、0.5ng/ml白介素-1、0.5ng/ml白介素-6、100μmol/ml千金藤碱。
此外，本发明还提供了一种体外扩增脐血造血干细胞的方法，将脐血造血干细胞接种到本发明上述任意一种技术方案提到的培养基中培养。
其中，所述脐血造血干细胞可按照本领域常规方法进行提取获得，在本发明具体实施过程中是通过免疫磁珠细胞分选技术获得的。具体方法可参照如下：
步骤1、将脐血按1:1的体积比与PBS混匀，再按照4:1的体积比加入6％羟乙基淀粉溶液混匀，室温静置20-30分钟，待红细胞自然沉降至界限分明时，吸出上层溶液至50ml离心管中；
步骤2、1500rpm离心5min，离心结束后取出离心管，收集下层单个核细胞，用3-5ml的PBS洗涤，重悬细胞备用；
步骤3、将细胞用countstar计数后调整密度为2×108/ml的细胞悬液，按照每毫升细胞悬液加入100μlCD34抗体的比例加入混合物，室温孵育15-20分钟；
步骤4、按照每毫升细胞悬液中加入50μl磁珠的比例，加入CD34+磁珠充分吹打混匀，室温孵育10-20分钟。严格按照免疫磁珠细胞分选试剂盒的步骤分选出CD34+造血干细胞细胞，备用。
作为优选，所述脐血造血干细胞接种的密度为1×105/mL，所述培养为在37℃、5％CO2条件下培养，一般为3-7d。
本发明选取包括CN105112374A实施例3扩增培养基在内的多组对照培养基为对比对象，在相同的脐血干细胞来源和培养环境下进行培养，在培养的第3天和第7天收集细胞进行细胞数量和CD34细胞含量测定。结果显示，经过本发明所述体外扩增培养基培养的造血干细胞，在第7天时扩增倍数达到60倍左右，细胞含量达到98％左右，具有明显的扩增效果。
由以上技术效果可知，本发明提供了千金藤碱在造血干细胞扩增中的相关应用，通过多种适宜组分与千金藤碱组成的培养基的作用，可显著提高造血干细胞的扩增效果，使其具有干性强、活性高的特点。
附图说明
图1所示为不同浓度的千金藤碱对脐血造血干细胞的活性影响曲线；其中，1为培养48h时的结果；2为培养72h时的结果。
具体实施方式
本发明实施例公开了千金藤碱的应用以及一种扩增脐血造血干细胞的培养基和方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用、培养基和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用、培养基和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的千金藤碱的应用以及一种扩增脐血造血干细胞的培养基和方法进行详细说明。
实施例1：脐血造血干细胞的提取分离
事先征得华侨医院妇产科产妇同意，以自愿捐赠方式，通过华侨医院正规采集方法采集脐血。
将脐血按1:1的体积比与PBS混匀，再按照4:1的体积比加入6％羟乙基淀粉溶液混匀，室温静置20-30分钟，待红细胞自然沉降至界限分明时，吸出上层溶液至50ml离心管中；
1500rpm离心5min，离心结束后取出离心管，收集下层单个核细胞，用3-5ml的PBS洗涤，重悬细胞备用；
将细胞用countstar计数后调整密度为2×108/ml的细胞悬液，按照每毫升细胞悬液加入100μlCD34抗体的比例加入混合物，室温孵育15-20分钟；
按照每毫升细胞悬液中加入50μl磁珠的比例，加入CD34+磁珠充分吹打混匀，室温孵育10-20分钟。严格按照免疫磁珠细胞分选试剂盒的步骤分选出CD34+造血干细胞细胞，备用。
实施例2：千金藤碱对脐血造血干细胞的安全性试验
用DMEM/F12基础培养基将千金藤碱稀释成0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/ml的药物浓度。
将实施例1中分离的细胞以1×104/mL的密度接种于96孔板中，分别加入不同浓度千金藤碱，每孔100ul，以不加千金藤碱的脐血造血干细胞的基础培养基为正常细胞组，置于37℃、5％CO2条件下培养48h和72h。
按照MTT试剂盒说明书利用酶标仪检测OD值，计算细胞的存活率，结果见图1。
由图1可以看出，无论是培养48h还是72h，当千金藤碱的浓度50-100μmol/ml时，造血干细胞的存活率最高，因此以50-100μmol/ml作为本发明中千金藤碱的安全浓度。
实施例3：不同扩增培养基的扩增效果对比试验
1、培养基
对照培养基1：DMEM/F12+10％FBS；
对照培养基2：CN105112374A实施例3扩增培养基；
阳性对照培养基：DMEM/F12+10％FBS+15ng/ml血小板生成素+100ng/ml干细胞生长因子+33ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体+0.2ng/ml白介素-1+0.2ng/ml白介素-6+1uMSR-1(注：SR-1是已经通过筛选技术得到的一种嘌呤霉素衍生物，是目前为止已经证实的能促进人CD34+造血干细胞大量扩增和自我更新的小分子，一般可使细胞数量增加50倍，因此可选作为阳性对照药，但其成本相对较高，并且不易采购)；
本发明培养基1：DMEM/F12培养基+8％FBS+20ng/ml血小板生成素+150ng/ml干细胞生长因子+45ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体+0.4ng/ml白介素-1+0.4ng/ml白介素-6+75μmol/ml千金藤碱。
本发明培养基2：DMEM/F12培养基+5％FBS+15ng/ml血小板生成素+100ng/ml干细胞生长因子+33ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体+0.2ng/ml白介素-1+0.2ng/ml白介素-6+50μmol/ml千金藤碱。
本发明培养基3：DMEM/F12培养基+10％FBS+30ng/ml血小板生成素、200ng/ml干细胞生长因子+56ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体+0.5ng/ml白介素-1+0.5ng/ml白介素-6+100μmol/ml千金藤碱。
2、试验方法
将实施例1中分离的造血干细胞以1×105/ml的密度接种于6孔板中，2ml/孔，分别加入各组扩增培养基，分别培养3天、7天后收获细胞，进行细胞数量和CD34细胞含量测定。利用countstar自动细胞计数仪计算细胞数量，结果见表1，利用流式细胞仪分析CD34+细胞的含量，结果见表2。
表1造血干细胞数量增殖情况
培养天数 对照培养基1 对照培养基2 阳性对照组培养基
0d 2*105 2*105 2*105
3d 2.3*105 4.5*106 7.2*106
7d 2.1*105 6.3*106 1.1*107
培养天数 本发明培养基1 本发明培养基2 本发明培养基3
0d 2*105 2*105 2*105
3d 7.12*106 6.42*107 7.05*107
7d 1.23*107 1.19*107 1.21*107
由表1可知，对照培养基1的造血干细胞数量没有明显变化；而阳性对照组培养基和本发明培养基对造血干细胞都具有明显的扩增效果。在第7d时，阳性对照组培养基的扩增倍数达到55倍，本发明培养基的扩增倍数达到60倍；而现有专利的对照培养基2明显低于本发明培养基和阳性对照培养基的扩增倍数，说明千金藤碱和阳性药SR-1的对造血干细胞增殖效果无明显差异，扩增倍数甚至高于阳性药，可以在体外快速扩增脐血造血干细胞。
表2造血干细胞含量增殖情况
培养天数 对照培养基1 对照培养基2 阳性对照组培养基
0d 62.3％ 62.3％ 62.3％
3d 63.4％ 71.2％ 83.2％
7d 62.1％ 80.1％ 98.1％
培养天数 本发明培养基1 本发明培养基2 本发明培养基3
0d 62.3％ 62.3％ 62.3％
3d 85.1％ 84.2％ 85.0％
7d 97.8％ 98.2％ 97.6％
由表2可知，对照组培养基1的造血干细胞含量没有明显变化；而阳性对照组培养基和本发明培养基对造血干细胞的含量都具有明显提高。在第7d时，阳性对照组培养基的CD34+细胞含量达到98.1％，本发明培养基的细胞含量达到98％左右，现有专利的对照培养基2明显低于本发明培养基和阳性对照培养基的细胞含量，说明千金藤碱和阳性药SR-1对造血干细胞的含量影响无明显差异，可以在体外很好的保持造血干细胞的干性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.千金藤碱在制备造血干细胞体外扩增培养基和/或在体外扩增造血干细胞中的应用。
2.一种脐血造血干细胞体外扩增培养基，其特征在于，包括千金藤碱。
3.根据权利要求2所述培养基，其特征在于，所述千金藤碱的浓度为50-100μmol/mL。
4.根据权利要求2或3所述培养基，其特征在于，还包括：
DMEM/F12培养基、FBS、血小板生成素、干细胞生长因子、人FMS样酪氨酸激酶1配体、白介素-1、白介素-6。
5.根据权利要求4所述培养基，其特征在于，包括：
DMEM/F12培养基，5％-10％的FBS、15-30ng/ml血小板生成素、100-200ng/ml干细胞生长因子、33-56ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体、0.2-0.5ng/ml白介素-1、0.2-0.5ng/ml白介素-6、50-100μmol/ml千金藤碱。
6.根据权利要求5所述培养基，其特征在于，包括：
DMEM/F12培养基，8％的FBS、20ng/ml血小板生成素、150ng/ml干细胞生长因子、45ng/ml人FMS样酪氨酸激酶1配体、0.4ng/ml白介素-1、0.4ng/ml白介素-6、75μmol/ml千金藤碱。
7.一种体外扩增脐血造血干细胞的方法，其特征在于，将脐血造血干细胞接种到权利要求2-6任意一项所述培养基中培养。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述脐血造血干细胞通过免疫磁珠细胞分选技术获得。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述脐血造血干细胞接种的密度为1×105/mL。
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述培养为在37℃、5％CO2条件下培养。
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