CN109735491A - 一种可扩增造血干细胞的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药检测领域，具体涉及一种可扩增造血干细胞的无血清培养基及其制备方法。本发明提供的可扩增造血干细胞的无血清培养基，包括千金藤碱、小檗碱、bFGF、aFGF、IGF1、IGF2、转铁蛋白、胰岛素生长因子、EGF、白介素1、白介素2、白介素6、干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体和DMEM/F12培养基。添加千金藤碱和小檗碱，使该无血清培养基不仅具备体外扩增来源于胎盘、骨髓、外周血造血干细胞的能力、增加造血干细胞贴壁能力和细胞增殖速率，还可保持干细胞自我更新以及多向分化能力，通过本无血清培养基扩增的造血干细胞具有良好的促进患者体内造血系统重建的效果。
Description
技术领域
本发明属于中药组合物的检测方法领域，具体涉及一种可扩增造血干细胞的无血清培养基及其制备方法。
背景技术
造血干细胞是血细胞的来源，具有自我更新以及多向分化的能力，也是治疗恶性血液性疾病的重要成分，对治疗恶性白血病以及肿瘤性疾病等有重要的临床价值与商业价值。造血干细胞的来源有胎盘、脐带血、外周血和骨髓，外周血和骨髓是目前临床移植造血干细胞的主要来源，但在采集过程中容易对健康捐献者带来痛苦等问题，在血型配型过程中也不一定顺利。另外，骨髓与外周血造血干细胞增殖以及分化能力下降，在造血干细胞的数量以及多向分化能力有所下降，而来自于胎盘的造血干细胞数量相对降低，不一般不能满足成人使用；在多分化性质上其处于幼稚阶段，多向分化能力不够强，在后期患者造血干细胞性质以及数量恢复方面往往达不到效果。
目前造血干细胞的体外扩增主要有向培养基加入一定量的动物来源成分，如胎牛血清。但是动物来源成分往往含有一定量的免疫原成分或者病原微生物，这些外源物会引起病人严重的免疫排斥反应，影响造血干细胞移植效果，最终造成造血干细胞移植的失败。
当前造血干细胞的体外扩增主要依赖细胞因子的组合，如干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体刺激造血干细胞的体外增殖，专利文献CN104877963A公开了一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基及其制备方法，该干细胞培养基包括IMDM基础培养基，还包括重组人胰岛素、重组转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、纤维连接蛋白、胎球蛋白和β细胞素。该发明提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基无需进行培养瓶包被，细胞贴壁性和形态良好，细胞增殖速率高，但是血小板衍生生长因子在体外增殖过程中会使干细胞多向分化能力随着扩增的过程有所丢失。通过研究无血清培养基以及细胞因子组合保持其增殖能力以及多向分化能力解决造血干细胞体外扩增遇到的难题。
发明内容
本发明旨在提供一种无动物来源成分的可扩增造血干细胞的无血清培养基，增加铁壁率和细胞存活率，使骨髓、胎盘、脐带血造血干细胞在体外扩增时保持细胞多分化性质。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种扩增造血干细胞的无血清培养基，包括以下组分及其浓度：
进一步地，以DMEM/F12培养基为溶剂，所述扩增造血干细胞的无血清培养基包括以下组分及其浓度：
进一步地，以DMEM/F12培养基为溶剂，所述扩增造血干细胞的无血清培养基包括以下组分及其浓度：
进一步地，所述可扩增造血干细胞的无血清培养基还包括以下组分及其浓度：千金藤碱0.1-1.5ng/mL，小檗碱0.05-0.15ng/mL。
更进一步地，所述千金藤碱的浓度还可以为0.1-1.0ng/mL，所述小檗碱的浓度还可以为0.05-0.1ng/mL。
更进一步地，所述千金藤碱的浓度为0.5ng/mL，所述小檗碱的浓度为0.05ng/mL。
进一步地，所述扩增造血干细胞的无血清培养基用于扩增脐带血、胎盘和骨髓干细胞。
本发明还提供了一种可扩增造血干细胞无血清培养基的制备方法，制备步骤如下：将千金藤碱、小檗碱、bFGF、aFGF、IGF1、IGF2、转铁蛋白、胰岛素生长因子、EGF、白介素1、白介素2、白介素6和干细胞因子加入DMEM/F12培养基中，溶解均匀，调节pH值为7.2-7.4，常温下过0.22μm滤膜，即得。
本发明提供的扩增造血干细胞的无血清培养基中，干细胞因子具有保持造血干细胞体外多向分化能力；血小板生成素调节造血干细胞体外增殖，具有明显促进其体外增殖的效果；FMS样酪氨酸激酶3配体、白介素1、白介素2和白介素6能够激活造血干细胞的增殖活性；bFGF、aFGF和EGF能够促进造血干细胞自我更新能力。
千金藤碱属于双苄基异喹啉累生物碱，具有多种生物功能活性，如抗炎、增强免疫功能，本发明首次将其用于造血干细胞培养基，发现其可改善干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体刺激造血干细胞的体外增殖使干细胞多向分化能力扩增导致的多向分化性能丢失现象，保证离体干细胞的多分化稳定性。
小檗碱是异喹啉生物碱，本发明的实验表明，小檗碱具有促进造血干细胞体外增殖效果，并能有效的维持造血干细胞自我更新以及多向分化能力，千金藤碱和小檗碱联合作用，确保使用本发明的扩增造血干细胞的无血清培养基在具备高效扩增能力、增强细胞贴壁性以及细胞增殖速率的同时，保证干细胞的形态和细胞多向分化的性能，最大限度维持胎盘、骨髓、外周血造血干细胞的性能。
与现有技术相比，本发明的干细胞培养及具有以下优点：
(1)本发明提供的扩增造血干细胞的无血清培养基钟添加了千金藤碱和小檗碱，可保持干细胞自我更新以及多向分化能力，通过本无血清培养基扩增的造血干细胞具有良好的促进患者体内造血系统重建的效果。
(2)本发明提供的扩增造血干细胞的无血清培养基不含有动物组织来源成份，具备体外扩增来源于胎盘、骨髓、外周血造血干细胞的能力，使用本发明的无血清培养基可增加细胞贴壁性能，增加细胞增殖速率，维持细胞形态。
市售普通干细胞培养基和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基
附图说明
图1为本发明可扩增造血干细胞的无血清培养基与市售普通干细胞培养基体外扩增造血干细胞曲线图，其中曲线A为本发明培养基培养造血干细胞增殖曲线图，曲线B为市售普通干细胞培养基培养造血干细胞增殖曲线图；
图2为本发明可扩增造血干细胞的无血清培养基与市售普通干细胞培养基对CD34+CD38-Lin-细胞体外扩增图，A为本发明可扩增造血干细胞的无血清培养基对CD34+CD38-Lin-表型细胞影响柱状图，B为市售普通干细胞培养基对CD34+CD38-Lin-表型细胞影响柱状图；
图3为本发明可扩增造血干细胞的无血清培养基与市售普通干细胞培养基对造血干细胞扩增后，干性因子Nanog、Oct4、Sox2、STAT3基因表达水平变化，A为本发明可扩增造血干细胞的无血清培养基培养造血干细胞对上述干性基因表达变化柱状图，B为市售普通干细胞培养基培养造血干细胞对上述干性基因表达变化柱状图；
图4为本发明可扩增造血干细胞的无血清培养基与市售普通干细胞培养基经扩增CD34+CD38-Lin-表型细胞后尾静脉注射免疫缺陷小鼠体内后，造血系统重建能力图，图A为经本发明可扩增造血干细胞的无血清培养基扩增CD34+CD38-Lin-细胞，图B为经市售普通干细胞培养基扩增CD34+CD38-Lin-细胞。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
本发明所使用的干细胞因子、白介素1、白介素2、白介素6、bFGF、aFGF购于R&D公司；本发明所使用的IGF1、IGF2、转铁蛋白、胰岛素生长因子、EGF、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体购于Prprotech公司；本发明所使用的千金藤碱和小檗碱购于Sigma公司。
实施例1、一种可扩增造血干细胞的无血清培养基
所述可扩增造血干细胞的无血清培养基以DMEM/F12培养基为溶剂，由以下成份及其浓度组成：
制备方法为：
取一包DMEM/F12培养基粉末，加入900ml去离子水，再加入3g NaHCO3，加入3gHepes，搅拌1h，调pH7.2-7.4，加入以下成份千金藤碱、小檗碱、bFGF、aFGF、IGF1、IGF2、转铁蛋白、胰岛素生长因子、EGF、白介素1、白介素2、白介素6、干细胞因子、血小板生成素和FMS样酪氨酸激酶3配体，溶解均匀，去离子水定容至1L，调节pH值为7.2-7.4，常温下过0.22μm滤膜，即得。
实施例2、一种可扩增造血干细胞的无血清培养基
所述可扩增造血干细胞的无血清培养基以DMEM/F12培养基为溶剂，由以下成份及其浓度组成：
制备方法与实施例1类似。
实施例3、一种可扩增造血干细胞的无血清培养基
所述可扩增造血干细胞的无血清培养基以DMEM/F12培养基为溶剂，由以下成份及其浓度组成：
制备方法与实施例1类似。
试验例一、促造血干细胞体外促增殖效果
1.实验对象：市售通干细胞培养基(购于赛默飞世尔科技有限公司)和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基。
2.实验方法：
2.1收集脐带血、骨髓血与胎盘血，通过单个核细胞分离试剂盒，获取单个核细胞，再通过免疫磁珠分选的方法获得脐带血造血干细胞CD34+CD38-Lin-表型细胞(流式细胞仪鉴定所获细胞纯度)。
2.2将2.1中获得的脐带血造血干细胞CD34+CD38-Lin-表型细胞分别用市售普通干细胞培养基和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基进行培养。
接种于96孔板中，设3个复孔，放于培养箱孵育，置于37℃，5％CO2条件下培养，7天后，收集全部细胞，加入CCK-8溶液，继续培养1-4h，酶标仪测定各孔450nm处的OD值(光密度值)，测得吸光度A值。生长抑制率的计算公式为：生长抑制率(％)＝(1-OD实验组/OD对照组)×100％。经计算，从而比较传统培养基与本发明培养基对脐血造血干细胞体外促增殖情况，
3.实验结果：
结果如图1本发明培养基培养与传统造血干细胞培养基体外扩增造血干细胞曲线图所示。曲线A为本发明培养基培养造血干细胞增殖曲线图，曲线B为传统干细胞培养基培养造血干细胞增殖曲线图。
图中数据曲线显示，在1-25天内，A曲线的细胞增殖率一直高于B曲线，即本发明培养基培养对造血干细胞增殖效果高于传统干细胞培养基，本发明的可扩增造血干细胞的无血清培养基培养的干细胞增值快速。
试验例二、克隆形成情况
1.实验对象：市售普通干细胞培养基(购于赛默飞世尔科技有限公司)和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基。
2.实验方法：
2.1去离子水配制1.0％与0.5％的低熔点琼脂糖，高温高压灭菌，置于40℃水浴保温使之不凝固；分别用市售普通干细胞培养基和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基把试验例一分离获取的脐带血造血干细胞CD34+CD38-Lin-表型细胞调整至密度300个/mL和混合细胞液A和B。
2.2取0.5％的低熔点琼脂糖，分别加入等体积的2.1项中配好的混合细胞液A和B混合配成0.25％的上层琼脂糖液A和B。
2.3另分别用市售普通干细胞培养基和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基把1.0％的低熔点琼脂糖液稀释成0.5％的底层琼脂糖，均匀铺于6孔板上；。
2.4把上述2.2中混匀后含脐血造血干细胞的0.25％的上层琼脂糖液A和B对应加入2.3中含脐带血造血干细胞6孔板底层琼脂上，使其形成双琼脂层；将6孔板继续培养15天；6孔板加入0.25mL/孔的0.05％结晶紫溶液，37℃孵育30min后观察细胞克隆数，并计算克隆形成率。
3.实验结果：
实验结果如图2本发明培养基与市售普通干细胞培养基对CD34+CD38-Lin-细胞体外扩增图所示，A为本发明的可扩增造血干细胞的无血清培养基对CD34+CD38-Lin-表型细胞影响柱状图，B为市售普通干细胞培养基对CD34+CD38-Lin-表型细胞影响柱状图。
图2说明在21天内，本发明培养基与市售普通干细胞培养基培养后21天时脐带血造血干细胞CD34+CD38-Lin-表型细胞的增长率是市售普通干细胞培养基培养增长率的2倍，说明本发明的可扩增造血干细胞的无血清培养基对脐带血造血干细胞CD34+CD38-Lin-表型细胞的增长有明显促进作用。
试验例三、造血干细胞干性基因Nanog、Oct4、Sox2、STAT3基因表达水平变化
1.实验对象：市售普通干细胞培养基(购于赛默飞世尔科技有限公司)和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基。
2.实验方法：
2.1总RNA获取
(1)使用市售普通干细胞培养基和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基培养试验例一分离获取的脐带血造血干细胞CD34+CD38-Lin-表型细胞，在37℃，5％CO2条件下培养7天，1000r/min离心收集药物作用后的细胞，弃去废液，加1mL的Trizol裂解细胞，室温下静置5min；
(2)加入0.2mL的氯仿，涡旋震荡使得细胞充分裂解，然后12000r/min，4℃离心，离心15min，之后使用移液枪轻轻吸取上层液相400μL，避免扰动下层杂蛋白；
(3)加入400μL的异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃条件下，转速为12000r/min，离心5min，沉淀，弃去上层液，加入1mL的75％无水乙醇洗涤总RNA沉淀；
(4)将步骤(3)中乙醇洗涤总RNA沉淀在转速12000r/min，4℃条件下，离心5min，移液枪弃去液体，留下白色沉淀RNA；
(5)室温打开EP管盖子，待乙醇挥发晾干总RNA。
2.2反转录
反转录反应条件：温度37℃，时间15min；温度85℃，时间5s；得cDNA。
2.3获取qPCR
反应条件为：95℃，5s，60℃，5s，1个循环；95℃，15s，60℃，1min，42个循环；使用2-ΔΔCt法处理qPCR数据。
3.实验结果：
实验结果如图3可扩增造血干细胞的无血清培养基与普通干细胞培养基对造血干细胞扩增后，干性因子Nanog、Oct4、Sox2、STAT3基因表达水平变化，A为可扩增造血干细胞的无血清培养基培养造血干细胞对上述干性基因表达变化柱状图，B为普通干细胞培养基造血干细胞对上述干性基因表达变化柱状图。
图3显示，本发明的可扩增造血干细胞的无血清培养基培养后的脐带血造血干细胞CD34+CD38-Lin-表型细胞的Nanog、Oct4、Sox2、STAT3表达均高于普通干细胞培养基后的脐带血造血干细胞CD34+CD38-Lin-表型细胞表达，说明本发明的可扩增造血干细胞的无血清培养基培养扩增效果更好。
试验例四、造血系统重建能力
1.实验对象：市售普通干细胞培养基(购于赛默飞世尔科技有限公司)和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基。
2.实验方法：
(1)取20只免疫缺陷小鼠，平均分为两组，每组10只，分别注射50万个使用市售普通干细胞培养基和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基培养试验例一分离获取的脐带血造血干细胞CD34+CD38-Lin-表型细胞，正常喂养15天后，测定CD34+CD38-Lin-表型细胞在小鼠体内增值率。
3.实验结果：
实验结果如图4本发明的可扩增造血干细胞的无血清培养基与市售普通干细胞培养基经扩增CD34+CD38-Lin-表型细胞后尾静脉注射免疫缺陷小鼠体内后，造血系统重建能力图，A为经本发明的可扩增造血干细胞的无血清培养基扩增CD34+CD38-Lin-细胞，B为经市售普通干细胞培养基扩增CD34+CD38-Lin-细胞，图中结果说明经本发明的可扩增造血干细胞的无血清培养基扩增CD34+CD38-Lin-细胞的效果高于市售普通干细胞培养基的扩增效果(2倍扩增率)。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，以DMEM/F12培养基为溶剂，包括以下组分及其浓度：
2.根据权利要求1所述的可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，以DMEM/F12培养基为溶剂，包括以下组分及其浓度：
3.根据权利要求2所述的可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，以DMEM/F12培养基为溶剂，包括以下组分及其浓度：
4.如权利要求1所述的可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，还包括以下组分及其浓度：千金藤碱0.1-1.5ng/mL，小檗碱0.05-0.15ng/mL。
5.如权利要求4所述的可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述千金藤碱的浓度还可以为0.1-1.0ng/mL，所述小檗碱的浓度还可以为0.05-0.1ng/mL。
6.如权利要求5所述的可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述千金藤碱的浓度为0.5ng/mL，所述小檗碱的浓度为0.05ng/mL。
7.一种如权利要求1任一所述的可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述扩增造血干细胞的无血清培养基用于扩增脐带血、胎盘和骨髓干细胞。
8.一种如权利要求1-7任一所述的可扩增造血干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：将bFGF、aFGF、IGF1、IGF2、转铁蛋白、胰岛素生长因子、EGF、白介素1、白介素2、白介素6和干细胞因子加入DMEM/F12培养基中，溶解均匀，调节pH值为7.2-7.4，常温下过0.22μm滤膜，即得。
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