CN105062952A - 间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，取间充质干细胞进行培养，在培养的过程中用诱导液进行诱导培养；其中，所述诱导液为尼克酰胺和/或β-细胞调节素。通过本发明所获得胰岛细胞不仅数量较多，活性和成熟度较强，且胰岛细胞质量较好，能够分泌较多的胰岛素，对于临床移植间充质干细胞治疗1型糖尿病具有重要意义。

Description

间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及利用间充质干细胞诱导转化为胰岛细胞的方法。

背景技术

糖尿病是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。临床上，Ⅰ型及部分Ⅱ型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。而细胞治疗是糖尿病尤其是Ⅰ型糖尿病的理想治疗策略，尤其对于已经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的胰岛细胞或其替代物是最理想的治疗方法。目前，胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难极大的限制了这种疗法的应用。

干细胞具有极强的自我更新能力及多向分化潜能，是基因治疗的理想靶细胞。干细胞分为全能干细胞(如胚胎干细胞，可以分化为机体所有组织细胞)、多能干细胞胞(具有多向分化潜能，可以分化为多种组织细胞，如间充质干细胞等)和专能干细胞(维持某一特定组织细胞的单一方向自我更新，如肠上皮干细胞等)。干细胞技术的不断突破及干细胞本身所具有的特性使人类有可能在体外培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织工程以供临床所需，以此为目的的干细胞工程涉及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的大多数医学难题，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于人羊水、脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的作用。

对干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌胰岛素的细胞，是治疗Ⅰ型糖尿病的理想策略之一。目前将间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞团多采用贴壁诱导的方式。因间充质干细胞有较强的贴壁性，在诱导过程中阻碍了细胞聚集成团，因此诱导率普遍较低，且诱导后获得的胰岛样细胞的细胞活性较低、活细胞比率低、胰岛细胞不够成熟等问题。而二步法或者三步法，诱导因子使用较多，诱导周期一般为14-21天，诱导周期长、残留因子种类繁多，间充质干细胞诱导率低，获得的胰岛细胞数量较少，且不够成熟，增加了临床应用的风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中诱导间充质干细胞转化成胰岛细胞存在诱导率低、胰岛细胞活性低，不成熟等缺陷，提供一种能够提高间充质干细胞转化为胰岛细胞的转化率以及提高胰岛细胞活性的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

取间充质干细胞进行培养；

在培养的过程中用诱导液进行诱导；

其中，所述诱导液为尼克酰胺和/或β-细胞调节素。

在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，在培养的过程中用诱导液进行诱导中，尼克酰胺的浓度为5-20ng/ml；

和/或β-细胞调节素的浓度为5-40ng/mL。

在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述诱导液中还包括HGF，且HGF的浓度为5-20ng/ml。

在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，在培养的过程中用所述诱导液进行诱导处理步骤之前，还需将间充质干细胞用预诱导剂进行预诱导；

所述预诱导处理过程中，预诱导剂包括EGF、bFGF、银杏提取液和FCS。

在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述预诱导剂中EGF的浓度为5-20ng/ml、bFGF的浓度为5-20ng/ml、银杏提取液的浓度为5-20ng/ml和FCS的质量分数为2-10％。

在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述预诱导时间为2-4天。

在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，在培养的过程中用所述诱导液进行诱导处理步骤中，诱导时间为4-7天。

在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，取所述间充质干细胞进行培养过程中，采用的培养基为基础培养基。

在本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述基础培养基为IMDM培养基或DMEM培养基。

实施本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，可以达到以下有益效果：该方法不仅易操作，而且所获得胰岛细胞数量较多，活性和成熟度较强，能够分泌较多的胰岛素。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为通过本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法得到的胰岛细胞，用PCR进行mRNA检测的电泳条带示意图。

具体实施方式

为解决现有技术中利用间充质干细胞转化的胰岛细胞较少，且胰岛细胞活性低，不成熟等缺陷，本发明的创新点在于提供一种诱导间充质干细胞转化成胰岛细胞的方法，在该方法中加入能够促进干细胞增殖转化，以及提高细胞活性促进胰岛细胞成熟的尼克酰胺和HGF等物质，从而实现了提高间充质干细胞转化率以及提高转化后胰岛细胞的活性和成熟度，提高胰岛细胞质量的目的。

具体地，本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法为：

1、取间充质干细胞于基础培养基中，并用预诱导剂进行预诱导培养2-4天；

2、再加入诱导液，对间充质干细胞继续诱导4-7天，直至转化成胰岛细胞；

其中，诱导液为尼克酰胺和/或β-细胞调节素。

步骤1中，基础培养基可以是IMDM或DMEM培养基，并在基础培养基中加入预诱导剂，预诱导剂包括EGF(表皮生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、银杏提取液和FCS(fetalcalfserum，胎小牛血清)。其中，EGF的浓度为5-20ng/ml、bFGF的浓度为5-20ng/ml、银杏提取液的浓度为5-20ng/ml和FCS的质量分数为2-10％。

EGF能够促进间充质干细胞的增殖，以及胰岛细胞团的形成。bFGF不仅能促进间充质干细胞的增殖以及细胞体积的增大，还有助于间充质干细胞转化成胰岛细胞。银杏提取液是根据国际标准提取工艺提取的，也可购于德国舒培大药厂，商品名金纳多，其中含有黄酮类及银杏内酯等，能够中和掉细胞培养过程中积累的氧自由基,这样可以使得细胞分裂到很高的密度而不死亡,从而有利于间充质干细胞的增殖，降低细胞的氧化作用,提高细胞内谷胱甘肽的水平，清除氧自由基，防止细胞在诱导或扩增的过程中过早的凋亡，有利于间充质干细胞的转化；还会影响动物细胞胆固醇的代谢。FCS含有丰富的细胞生长必须的营养成份，提供对维持细胞指数生长的激素，是细胞贴壁、铺展在培养基质上所需因子来源，并提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害，同时，起酸碱度缓冲液作用。

该步骤主要是为间充质干细胞转化作准备，包括间充质干细胞的增殖、细胞体积增大，增强间充质干细胞活性等，因此，在该步骤中，基础培养基中添加的物质也并不局限于上述本发明所提供的物质。

在步骤2中，诱导液为尼克酰胺和/或β-细胞调节素；其中，尼克酰胺的主要作用是参与呼吸链，参与细胞增殖转化的呼吸过程及电子传递过程，促进细胞的增殖转化,尼克酰胺是组成NAD+和NADP+的一个部分，组成的NAD+和NADP+通过电子传递链，传递H+，合成ATP；同时尼克酰胺能够调节细胞内的ATP/ADP的比例，从而引起细胞膜上ATP敏感性钾通道的关闭，膜发生去极化，继而导致电压依赖性钙通道开放，钙离子内流，触发了胰岛β细胞分泌胰岛素，可以促进间充质干细胞向胰岛样细胞分化，同时，促进胰岛细胞成熟；优选地，尼克酰胺的浓度为5-20ng/ml。

与尼克酰胺作用机理类似，β-细胞调节素具有诱导nestin阳性细胞分化为胰岛素分泌细胞的能力，促进MSC向胰岛样细胞分化，并且能够促进胰岛细胞成熟，β-细胞调节素的浓度为5-40ng/mL。

由于尼克酰胺可以参与呼吸链，协助合成ATP，并且能够触发胰岛β细胞分泌胰岛素，促进间充质干细胞向胰岛样细胞分化，且成本较低，因此，在发明中，优先采用尼克酰胺，当然也可根据不同的诱导需求选择尼克酰胺和/或β-细胞调节素。

因此，本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，不仅能够促进间充质干细胞转化成胰岛细胞，提高间充质干细胞的转化率，而且可促进胰岛细胞的成熟，提高细胞活性，同时，促进间充质干细胞细胞和胰岛细胞的增殖及细胞体积的增大。

进一步地，本发明所采用的诱导液中，还包括HGF(hepatocytegrowthfactor，肝细胞生长因子)，且HGF的浓度为5-20ng/ml，在间充质干细胞细胞分化为胰岛样细胞的过程中，对于细胞起到保护作用的同时对细胞的扩增有着重要作用,能够促进胰岛细胞的发育和分化，进一步提高胰岛细胞的活性及成熟度。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

在本实施例中，间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，包括以下步骤：

1、获取间充质干细胞于加入预诱导剂的IMDM培养基中培养4天；

2、再加入诱导液继续进行诱导培养4天，至间充质干细胞转化成胰岛细胞。

步骤1中，获取间充质干细胞的过程为：

1)获取人脐带；

取足月剖宫产胎儿的脐带约4～6cm长，在无菌条件下抽净脐带血，置于PBS缓冲液中4℃保存，4h内进行处理。

2)分离纯化间充质干细胞

将约4～6cm长脐带放入超净台中，去除动静脉及外膜，PH＝7.4的PBS缓冲液进行初次漂洗2-3次，剪成1cm小段，再用PBS缓冲液多次漂洗以尽可能去除血液，最后剪成肉糜状。

将肉糜状的脐带移入50ml离心管，加入5ml经37℃预热的、质量分数为0.1％的胶原酶Ⅱ，放入37℃水浴摇床中振荡消化180min。其中，胶原酶Ⅱ是由0.1g胶原酶溶解于100ml的PBS缓冲液所获得的。

然后，再加入30ml的DMEM/F12，反复吹打，细胞筛过滤，收集滤液；滤液用1000转/min离心10min，弃上清，即获得间充质干细胞。

3)传代培养

将步骤2)中离心沉淀下来的间充质干细胞按1×10⁶个/ml的密度用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养。次日首次半量换液，以后每3d换液1次。

当细胞达融合后，用胰蛋白酶(胰蛋白酶溶液配制：PBS缓冲液200ml，胰蛋白酶0.5g，EDTA(乙二胺四乙酸)0.04g)不完全消化进行传代培养。

由于P3代所得到的间充质干细胞增殖较旺盛，得到的细胞较多，且新陈代谢较旺盛，活性较强，因此，在本实施例中优先选用P3代间充质干细胞进行诱导转化成胰岛细胞。

4)预诱导间充质干细胞

取步骤3)中获得的P3代间充质干细胞用胰蛋白酶消化细胞，按1∶2的比例接种于培养瓶中，待间充质干细胞融合度达到80％以上时，补加5ml的含有预诱导剂的IMDM培养基，置于5％CO₂,37℃的培养箱中，持续诱导4天，每两天半量换液一次。

其中，IMDM培养基中加入的预诱导剂为：l0ng/ml的EGF，l0ng/ml的bFGF，10ug/ml银杏提取液以及2％FCS。

步骤2中，加入10ng/ml尼克酰胺，继续诱导4天，每两天半量换液1次；最后收获细胞。

实施例2

与实施例1不同的是，在本实施例中，步骤2为：

加入10ng/mlβ-细胞调节素继续诱导4天，每两天半量换液1次；最后收获细胞。

实施例3

与实施例1不同的是，在本实施例中，步骤2为：

加5ng/mL尼克酰胺和20ng/mL的β-细胞调节素继续诱导4天，每两天半量换液1次；最后收获细胞。

实施例4

与实施例1不同的是，在本实施例中，步骤2为：

加入20ng/mL尼克酰胺和5ng/mL的HGF继续诱导4天，每两天半量换液1次；最后收获细胞。

实施例5

与实施例1不同的是，在本实施例中，步骤2为：

在步骤4)中，加入15ng/mL的β-细胞调节素和10ng/mL的HGF继续诱导4天，每两天半量换液1次；最后收获细胞。

实施例6

与实施例1不同的是，在本实施例中，步骤3为：

加入5ng/mL尼克酰胺和15ng/mL的β-细胞调节素和10ng/mL的HGF继续诱导4天，每两天半量换液1次；最后收获细胞。

为进一步验证本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法的有益效果，本发明通过以下测试实验来具体说明：

对照组：将P3代间充质干细胞置于IMDM培养基中培养8天；IMDM培养基中含有l0ng/mlEGF，l0ng/mlbFGF，10ug/ml银杏提取液以及2％FCS，然后收获细胞作为对照组进行如下细胞检测。

实验组：实施例1-6所制备获取的细胞作为本发明实验组进行如下细胞检测。

检测实验一、采用MTT法检测细胞活性

MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，配制方法为：

PBS缓冲液(pH7.4)50ml溶解MTT粉末250mg混匀后经微孔滤膜过滤除菌，保存于-20℃冰箱备用。

检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

检测结果,见下表1：

表1

检测实验二、检测间充质干细胞诱导后胰岛发育相关基因的表达

步骤1)常规提取对照组和实验组诱导后的胰岛细胞的总RNA并逆转录合成cDNA。

步骤2)从GeneBank中获得人胰岛发育相关的基因的mRNA序列，其中包括nestin、nanog和oct4、pdx1、ngn3、nkx6.1等，然后用primerpremier5.0软件进行设计。各引物序列、退火温度及扩增片段大小如表2。

表2

步骤3)聚合酶链锁反应(PCR)

A、将检测实验二步骤1)中合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

B、将检测实验二步骤2)和步骤A扩增后的基因采用购于TOYOBO(东洋纺)公司的TOYOBOQuickTaqHSDyeMixPCR试剂盒，进行荧光定量检测。

检测结果：如图1所示，检测多种参与胰岛β细胞的发育相关基因在对照组和实验组诱导方案的表达情况，图1中，1代表人体胰岛，2代表间充质干细胞，3代表对照组获得的胰岛细胞，4代表实验组-本发明实施例1所获得的胰岛细胞，5代表实验组-本发明实施例2所获得的胰岛细胞；由图1可知，实验组所获得的胰岛细胞均可表达胰岛发育相关基因glut-2、mafa、nkx6.1、pc1、pc2、ngn3、pdx1、pc1和insulin优于对照组现有的二维培养方法，由此说明，本发明所获得的胰岛细胞的质量要明显由于对照组。

综上所述，相对于现有技术中诱导间充质干细胞转化成胰岛细胞的方法，通过本发明提供的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，所获得的胰岛细胞不仅细胞活性较好，数量较多，且胰岛细胞质量较好，能够分泌较多的胰岛素，对于临床移植间充质干细胞治疗1型糖尿病具有重要意义；除此之外，本发明提供的诱导方法过程较简单，便于操作。

以上结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

取间充质干细胞进行培养；

在培养的过程中用诱导液进行诱导；

其中，所述诱导液为尼克酰胺和/或β-细胞调节素。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，在培养的过程中用诱导液进行诱导中，尼克酰胺的浓度为5-20ng/ml；和/或β-细胞调节素的浓度为5-40ng/mL。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述诱导液中还包括HGF，且HGF的浓度为5-20ng/ml。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，在培养的过程中用所述诱导液进行诱导处理步骤之前，还需将间充质干细胞用预诱导剂进行预诱导；

所述预诱导处理过程中，预诱导剂包括EGF、bFGF、银杏提取液和FCS。

5.根据权利要求4所述的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述预诱导剂中EGF的浓度为5-20ng/ml、bFGF的浓度为5-20ng/ml、银杏提取液的浓度为5-20ng/ml和FCS的质量分数为2-10％。

6.根据权利要求4所述的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述预诱导时间为2-4天。

7.根据权利要求4所述的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，在培养的过程中用所述诱导液进行诱导处理步骤中，诱导时间为4-7天。

8.根据权利要求1至7任一项所述的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，取所述间充质干细胞进行培养过程中，采用的培养基为基础培养基。

9.根据权利要求8所述的间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述基础培养基为IMDM培养基或DMEM培养基。