CN105112366A - 一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱5-110mg/L、碱性成纤维细胞生长因子3-20mg/ml、表皮细胞生长因子3-20mg/ml、谷胱甘肽1-10μg/mL、重组人胰岛素1-10mg/ml、人血清白蛋白5-15mg/ml、转铁蛋白1-10μg/mL、纤粘连蛋白5-15mg/L、腐胺5-30mg/L、氨基乙醇0.37-4mg/L、氢化可的松10-50μg/L和丙酮酸钠0.02-0.2mg/ml。本发明属于干细胞技术领域，本发明培养基细胞贴壁性良好，细胞增殖速率高，可以延迟MSCs进入衰亡期，延长细胞的生长周期。

Description

一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，涉及一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基。

背景技术

间充质干细胞 (mesenchymal stem cell，MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、造血细胞、神经细胞、胰岛细胞等多种细胞的能力。MSC来源广泛，易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性低，无道德伦理问题的限制、所以在组织工程、基因治疗和免疫治疗方面有着巨大的应用前景。

传统的含动物血清的干细胞培养基给干细胞的生产与科研带来许多不利。血清能为干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。

市场上商品化的MSCs无血清培养基如美国GIBICO公司的STEMPRO® MSC SFM CTS™，加拿大STEMCELL公司的MesenCult™-XF Medium等基本都从国外进口，不仅价格昂贵，培养效果不理想，与血清培养体系相比生长速度慢，而且容易出现老化特征，减弱MSCs的分化能力。同时，这些培养基大多需要辅助产品如明胶等基质胶预先包被培养器皿，增加了扩增细胞的工作量和传代过程污染的机会。

小檗碱，又名黄连素，是一种季铵型异喹啉生物碱，近年来研究发现其在抗菌、抗肿瘤、降血糖、调血脂、抗氧化等方面具有良好功效。刘旭晶发表的题目为“黄连生物碱对线粒体复合物III蛋白表达影响”的论文中指出小檗碱能提高线粒体复合物III的表达，有效的清除自由基；张志辉等人发表的题目为“黄连碱药理活性研究进展”的文章中指出小檗碱可作为单胺氧化酶抑制剂，而单胺氧化酶是细胞衰老的标志之一；杨玮等人发表的题目为“小檗碱对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响”的文章中指出小檗碱在1×10^-7~1×10^-5 mol· L^-1浓度范围内能够明显促进骨髓间充质干细胞骨钙素合成和分泌，在1×10^-6~1×10^-5mol· L^-1浓度范围内钙盐沉积量和钙化结节形成增加，可见，小檗碱可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，增强骨钙化。

中国专利201210350602.0公开了一种间充质干细胞无血清培养基，该培养基以IMDM为基础培养基，添加了L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、Hepes和重组人胰岛素等组分，但存在组分复杂，细胞贴壁性差的缺陷。

中国专利201110420539.9公开了一种间充质干细胞无血清培养基，该培养基以MEM/F12为基础培养基，添加了纤连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子和人表皮细胞生长因子等组分，但是存在细胞生长周期短，细胞增殖效果不够理想的缺陷。

因此，现存技术中存在细胞贴壁性差，细胞生长周期短，细胞增殖效果不够理想等缺陷。

发明内容

为解决现有技术中存在的细胞贴壁性差，细胞生长周期短，细胞增殖效果不够理想等缺陷，发明人通过大量试验筛选，得到一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，该培养基的使用不需要预先包被培养器皿，并且细胞贴壁性良好，细胞增殖速率高，可以延迟MSCs进入衰亡期，延长细胞的生长周期，降低了成本。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

本发明提供一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱5-110mg/L、碱性成纤维细胞生长因子3-20mg/ml、表皮细胞生长因子3-20mg/ml、谷胱甘肽1-10μg/mL、重组人胰岛素1-10mg/ml、人血清白蛋白5-15mg/ml、转铁蛋白1-10μg/mL、纤粘连蛋白5-15mg/L、腐胺5-30mg/L、氨基乙醇0.37-4mg/L、氢化可的松10-50μg/L和丙酮酸钠0.02-0.2mg/ml。

上述组分及其浓度是发明人经大量试验筛选确定的。上述组分中，小檗碱有延缓细胞衰老的功效，能够显著促进间充质干细胞增殖，延迟MSCs进入衰亡期，且能够保证MSCs生物学特性保持不变，细胞表型和分泌细胞因子均正常；碱性成纤维细胞生长因子能够刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性；表皮细胞生长因子能够促进细胞的分裂和生长，抑制衰老基因的表达；谷胱甘肽具有抗氧化作用，有利于维持细胞生物功能；重组人胰岛素可提高合成代谢能力，刺激细胞生长并调节葡萄糖的摄取量；人血清白蛋白能提供细胞生长所需的营养物质，还可调节渗透压，保护细胞免受机械损伤；转铁蛋白是血浆中主要的含铁蛋白质，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁；纤粘连蛋白是细胞外基质的粘着糖蛋白，能够使细胞和细胞外基质互相粘连，使细胞的贴壁效果更好；腐胺的含量水平高低与细胞的PH值相关，通过控制腐胺的含量能够调节细胞的PH值；氨基乙醇能够有效清除自由基，提高抗氧化能力；氢化可的松作为一种糖皮质激素，能够防止或抑制细胞中介的免疫反应；丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。

优选地，本发明提供的一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱20-70mg/L、碱性成纤维细胞生长因子5-15mg/ml、表皮细胞生长因子5-15mg/ml、谷胱甘肽2-10μg/mL、重组人胰岛素1-6mg/ml、人血清白蛋白7-13mg/ml、转铁蛋白1-6μg/mL、纤粘连蛋白8-12mg/L、腐胺5-20mg/L、氨基乙醇0.8-2mg/L、氢化可的松10-30μg/L和丙酮酸钠0.05-0.1mg/ml。

优选地，本发明提供的一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱40mg/L、碱性成纤维细胞生长因子10mg/ml、表皮细胞生长因子12mg/ml、谷胱甘肽10μg/mL、重组人胰岛素2mg/ml、人血清白蛋白10mg/ml、转铁蛋白6μg/mL、纤粘连蛋白10mg/L、腐胺5mg/L、氨基乙醇1mg/L、氢化可的松30μg/L和丙酮酸钠0.07mg/ml。

优选地，所述DMEM基础培养基为低糖型DMEM基础培养基。

优选地，所述的间充质干细胞从骨髓、脂肪、肌肉、脐带、胎盘、羊水或脐血中分离获得。

优选地，本发明提供的一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，还包括碳酸氢钠，碳酸氢钠的浓度为3.7g/L。

优选地，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。

相应地，本发明还提供含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入小檗碱、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、纤粘连蛋白、腐胺、氨基乙醇、氢化可的松和丙酮酸钠，混匀，过膜除菌即得。

此外，本发明还提供含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基在间充质干细胞无血清培养中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，与传统的含血清培养基相比，本发明提供的培养基不含动物来源血清，批次间稳定无干扰，有利于产物的分离纯化；本发明提供的培养基还添加了特定的组分小檗碱，小檗碱具有抗氧化和清除自由基的功效，可以延迟MSCs进入衰亡期，延长细胞的生长周期，获得更多目的细胞或产物，并且保证细胞原有的生物学特性；此外，本发明提供的培养基不需要预先包被培养器皿，与市售品牌无血清培养基和常规血清培养基相比能够更快的贴壁，缩短适应期，具有更好的细胞增殖速率；培养基所含组分均来自重组蛋白或化学合成，不会引起免疫排斥。本发明提供的制备方法简单，制得的间充质干细胞无血清培养基用于间充质干细胞的培养，培养出来的间充质干细胞具有优异的细胞性能。

附图说明

图1 培养基A和培养基B培养的脂肪间充质干细胞至汇合的对比图。

图2含不同浓度小檗碱的培养基对细胞增殖的影响。

图3 培养基A、培养基B和培养基C培养的脂肪间充质干细胞生长曲线的对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中的各组分均为常规市售产品，例如：低糖型DMEM基础培养基购自Gibco公司，货号31600-034。本发明中，培养基A：本发明实施例1提供的间充质干细胞无血清培养基；培养基B：低糖型DMEM基础培养基+10%体积百分比的胎牛血清；培养基C：美国Gibco公司的无血清培养基STEMPRO® MSC SFM CTS™。

实施例 1 本发明培养基的制备

发明人进行大量试验筛选得到本发明提供的含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基的最优配方。本发明培养基的制备包括以下步骤：

（1）制备基础培养基：取1小袋低糖DMEM干粉，溶解于800ml超纯水中，搅拌，得到低糖型DMEM基础培养基；

（2）往基础培养基中加入以下浓度的组分：小檗碱40mg/L、碱性成纤维细胞生长因子10mg/ml、表皮细胞生长因子12mg/ml、谷胱甘肽10μg/mL、重组人胰岛素2mg/ml、人血清白蛋白10mg/ml、转铁蛋白6μg/mL、纤粘连蛋白10mg/L、腐胺5mg/L、氨基乙醇1mg/L、氢化可的松30μg/L、丙酮酸钠0.07mg/ml和碳酸氢钠3.7g/L，混匀，搅拌溶解；

（3）调节培养基PH至7.2-7.4，加超纯水定容至1L，用0.22μm的滤膜过滤，除菌，在4℃下存放。

实施例 2 本发明培养基的制备

本发明实施例2培养基的制备方法同实施例1，具体往基础培养基中加入以下浓度的组分：小檗碱5mg/L、碱性成纤维细胞生长因子3mg/ml、表皮细胞生长因子3mg/ml、谷胱甘肽1μg/mL、重组人胰岛素1mg/ml、人血清白蛋白5mg/ml、转铁蛋白1μg/mL、纤粘连蛋白5mg/L、腐胺5mg/L、氨基乙醇0.37mg/L、氢化可的松10μg/L、丙酮酸钠0.02mg/ml和碳酸氢钠3.7g/L。

实施例 3 本发明培养基的制备

本发明实施例3培养基的制备方法同实施例1，具体往基础培养基中加入以下浓度的组分：小檗碱110mg/L、碱性成纤维细胞生长因子20mg/ml、表皮细胞生长因子20mg/ml、谷胱甘肽10μg/mL、重组人胰岛素10mg/ml、人血清白蛋白15mg/ml、转铁蛋白10μg/mL、纤粘连蛋白15mg/L、腐胺30mg/L、氨基乙醇4mg/L、氢化可的松50μg/L、丙酮酸钠0.2mg/ml和碳酸氢钠3.7g/L。

实施例 4 脂肪间充质干细胞的分离

取吸脂来源的脂肪组织，用PBS清洗3次，去除血细胞和组织碎片，加入0.1% 的I型胶原酶，放入在37℃的恒温摇床中1小时，然后在1500r/min下离心10min，去掉上清液，下层沉淀加入PBS重悬，再加入16 mmol/L NH₄Cl，在37℃水浴中裂解红细胞10 min，低速离心10 min后再用PBS冲洗3次，然后分别用培养基A和培养基B培养，48h后首次换液，随后每3天换液一次，经10~14天细胞融合度达80%以上即可传代，记为P0代，以此类推重复传代即得大量的脂肪间充质干细胞。图1是两种不同培养基培养的P10代脂肪间充质干细胞至汇合的对比图，从图中可以看出，两者均为梭形，显著的成纤维样，细胞呈旋涡状生长。

实施例 5 流式细胞术鉴定表面标志的表达水平

取实施例4中用培养基A和培养基B培养的P10代脂肪间充质干细胞，待细胞融合至90%时，消化收集细胞，用PBS洗涤2次，分别加入带有荧光标记的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14和HLA-DR等表面抗体孵育30min，再用PBS洗涤2次，采用上流式细胞仪检测细胞表面标记的表达水平，具体结果如表1所示。

表1 细胞表面标记的表达水平

从表1可知，由培养基A和培养基B培养的P10代细胞表面标记蛋白均符合MSCs的生物学特性。

实施例 6 含不同浓度小檗碱的培养基对细胞增殖的影响

分别取以下浓度的小檗碱溶液：2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L、100 mg/L和110 mg/L。

取实施例4中用培养基B培养的P10代脂肪间充质干细胞，待细胞融合至80%时，消化细胞计数，将P10代脂肪间充质干细胞以每孔4×10³的密度接种在96孔板中，接种100μl，隔夜贴壁后，给予不同浓度的小檗碱孵育细胞48h，再加入10μl0.5%的四甲基偶氮唑盐（MTT），避光继续孵育4h，去掉培养基，加入100μl二甲基亚砜，振荡混匀10min，用酶标仪在570nm处测吸光值，具体结果如图2所示。由图2可知，小檗碱在5~110mg/L浓度范围内均对MSCs有促进增殖的作用，从5mg/L开始，存活率呈现升高的趋势，并随着浓度的增加而升高，在40mg/L时存活率达到峰值，并随着浓度的增加而降低。

实施例 7 各培养基对间充质干细胞增殖能力的影响

取实施例4中用培养基B培养的P10代脂肪间充质干细胞，用胰酶消化后进行离心，然后用PBS洗两遍，再分别用培养基A、培养基B、和培养基C、重悬计数，按1×10⁴个/ml接种到24孔板，每孔1ml，每24h分别计算3个孔消化每孔细胞总量的平均值，每隔48h对未计数的孔进行换液，连续计数八天，根据计数结果，绘制细胞生长曲线，具体结果如图3所示。由图3可知，本发明培养基与另两种培养基相比适应期更短，贴壁更快，增值速度更高，培养效果更优；培养基B和培养基C第六天生长达到高峰，第八天开始衰亡，而培养基A第七天到达高峰，第十天才开始衰亡，可见，本发明培养基可以延迟MSCs进入衰亡期，延长细胞生长的周期。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱5-110mg/L、碱性成纤维细胞生长因子3-20mg/ml、表皮细胞生长因子3-20mg/ml、谷胱甘肽1-10μg/mL、重组人胰岛素1-10mg/ml、人血清白蛋白5-15mg/ml、转铁蛋白1-10μg/mL、纤粘连蛋白5-15mg/L、腐胺5-30mg/L、氨基乙醇0.37-4mg/L、氢化可的松10-50μg/L和丙酮酸钠0.02-0.2mg/ml。

2.根据权利要求1所述的含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱20-70mg/L、碱性成纤维细胞生长因子5-15mg/ml、表皮细胞生长因子5-15mg/ml、谷胱甘肽2-10μg/mL、重组人胰岛素1-6mg/ml、人血清白蛋白7-13mg/ml、转铁蛋白1-6μg/mL、纤粘连蛋白8-12mg/L、腐胺5-20mg/L、氨基乙醇0.8-2mg/L、氢化可的松10-30μg/L和丙酮酸钠0.05-0.1mg/ml。

3.根据权利要求1所述的含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：小檗碱40mg/L、碱性成纤维细胞生长因子10mg/ml、表皮细胞生长因子12mg/ml、谷胱甘肽10μg/mL、重组人胰岛素2mg/ml、人血清白蛋白10mg/ml、转铁蛋白6μg/mL、纤粘连蛋白10mg/L、腐胺5mg/L、氨基乙醇1mg/L、氢化可的松30μg/L和丙酮酸钠0.07mg/ml。

4.根据权利要求1所述的含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述DMEM基础培养基为低糖型DMEM基础培养基。

5.根据权利要求1所述的含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述的间充质干细胞从骨髓、脂肪、肌肉、脐带、胎盘、羊水或脐血中分离获得。

6.根据权利要求1所述的含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：还包括碳酸氢钠，碳酸氢钠的浓度为3.7g/L。

7.根据权利要求1所述的含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。

8.根据权利要求1所述的含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入小檗碱、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、纤粘连蛋白、腐胺、氨基乙醇、氢化可的松和丙酮酸钠，混匀，过膜除菌即得。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基在间充质干细胞无血清培养中的用途。