CN111593019A - 胎盘间充质干细胞无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种胎盘间充质干细胞无血清培养基，其包括包括DMEM低糖培养基和补充剂，补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白1～5mg/mL、转铁蛋白5～10μg/mL、表皮细胞生长因子5～10ng/mL、转化生长因子10～30ng/mL、血小板衍生生长因子10～25ng/mL、谷胱甘肽1～5μg/mL、普鲁兰尼克F68 10～20μg/mL和木脂素5～10μg/mL。本发明制备的无血清培养基可以显著提高胎盘间充质干细胞的扩增能力，胎盘间充质干细胞存活率高，培养成本低，且缩短了细胞的培养时间，适用范围广，可用于工业化生产。

Description

胎盘间充质干细胞无血清培养基
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种胎盘间充质干细胞无血清培养基。
背景技术
胎盘间充质干细胞(MSC)，是一种多功能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能的多潜能细胞。MSC在适宜的体内或体外环境下具有分化为：上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。MSC具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。MSC是人体微环境的重要组成部分，移植间充质干细胞可以改变造血微环境，重建免疫系统，促进造血功能恢复，与造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等的治疗效果。近年来，胎盘间充质干细胞具有取材方便和数量多的优点，有利于间充质干细胞在科学研究和临床中的应用。
传统的间充质干细胞的培养方法是使用含有动物血清的培养基培养，主要是为了给间充质干细胞的生长繁殖提供养分如激素、生长因子、转运蛋白等，但是，血清是一种非常复杂的混合物，成分可能多达几百种，目前对其准确的成分、含量及其作用机制仍不清楚，血清各批次之间的质量差别较大，受到生产商原料来源地的影响较大，要保证每批的一致性很困难，不利于实验室研究或产品生产的标准化，血清中可能含有一些未知的或未检测出的支原体、病毒等有害微生物，对细胞产生潜在的影响，并且血清中存在的一些抗体、补体及细菌毒素等物质，也对细胞的生长产生不利影响，甚至造成细胞的死亡。
中国专利申请CN201911219419.5公开了一种无血清培养基及其制备方法，培养基包括了非必需氨基酸、谷氨酰胺、氢化可的松、地塞米松，聚乙烯醇、重组人胰岛素，重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组碱性成纤维细胞生长因子等，该培养基包括了20多种组分，成本昂贵，并且该无血清培养基仅仅适合某一类的细胞培养，适用范围小，因此，还有改进的空间。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供一种胎盘间充质干细胞无血清培养基，显著提高胎盘间充质干细胞的扩增能力，胎盘间充质干细胞存活率高，培养成本低，且缩短了细胞的培养时间，适用范围广，可用于工业化生产。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种胎盘间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基和补充剂，所述补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白1～5mg/mL、转铁蛋白5～10μg/mL、表皮细胞生长因子5～10ng/mL、转化生长因子10～30ng/mL、血小板衍生生长因子10～25ng/mL、谷胱甘肽1～5μg/mL、普鲁兰尼克F68 10～20μg/mL和木脂素5～10μg/mL。
进一步地，所述DMEM低糖培养基和补充剂的质量比为5～8:1。
进一步地，所述补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白1～4mg/mL、转铁蛋白5～8μg/mL、表皮细胞生长因子5～9ng/mL、转化生长因子10～25ng/mL、血小板衍生生长因子10～20ng/mL、谷胱甘肽1～4μg/mL、普鲁兰尼克F68 15～20μg/mL和木脂素5～8μg/mL。
更进一步地，所述补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白3.5mg/mL、转铁蛋白6μg/mL、表皮细胞生长因子8ng/mL、转化生长因子14ng/mL、血小板衍生生长因子10ng/mL、谷胱甘肽2μg/mL、普鲁兰尼克F68 18μg/mL和木脂素6μg/mL。
进一步地，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。
进一步地，所述血小板衍生生长因子为血小板生长因子。
进一步地，所述转化生长因子为转化生长因子-β。
本发明目的之二是提供一种胎盘间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：在DMEM低糖培养基中添加人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、血小板衍生生长因子、谷胱甘肽、普鲁兰尼克F68和木脂素，混匀，经滤膜过滤除菌，得到胎盘间充质干细胞无血清培养基。
进一步地，所述滤膜滤径为0.1～0.2μm。
上述组分及其浓度是本发明人经过大量的试验筛选得到，本发明以DMEM低糖培养基为基础，然后以DMEM低糖培养基和补充剂的质量比为5～8:1添加补充剂至DMEM低糖培养基，其中DMEM低糖培养基提供氨基酸、无机盐、糖类等基本营养物质；人血清白蛋白能够提供细胞生长所需的营养物质，还可以调节渗透压，保护细胞免受机械损伤；转铁蛋白是血浆中主要的铁传递蛋白，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁；表皮细胞生长因子是一种多功能的生长因子，可以促进细胞的生长；转化生长因子-β和血小板生长因子则起到间充质干细胞生存维持和增殖刺激的作用，还原型谷胱甘肽是一种细胞内重要的调节代谢物质，在维持细胞生物功能起重要作用。
普鲁兰尼克F68，属于非穿透性低温冻存剂，具有无毒，无抗原性，无溶血性，可静脉注射等优点，可用于红细胞的低温保存，木脂素属于一种植物雌激素，分子式为C7H23O15，具有清除体内自由基、抗氧化的效果，本发明采用普鲁兰尼克F68和木脂素复配，不仅可以促进细胞的快速增殖，提高细胞的增殖能力，细胞的活力高，减少细胞在培养过程的损伤，还可以缩短细胞的培养时间，提高工作效率。
本发明还提供了一种胎盘间充质干细胞无血清培养基在胎盘间充质干细胞培养中的用途。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1.本发明提供一种胎盘间充质干细胞无血清培养基，组分清晰，排除了动物来源的病原体污染，重现性和可控性与血清培养基效果更佳，显著提高了胎盘间充质干细胞的扩增能力，胎盘间充质干细胞存活率高，细胞培养过程中损伤小；
2.本发明提供一种胎盘间充质干细胞无血清培养基，培养成本低，且缩短了细胞的培养时间，提高了工作效率，培养基适用范围广；
3.本发明提供一种胎盘间充质干细胞无血清培养基的制备方法，制备方法简单，安全性较佳，可用于工业化生产。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
以下部分原料：普鲁兰尼克F68购于sigma公司，木脂素购于陕西斯诺特生物技术有限公司。所涉及的组分、试剂均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。DMEM低糖培养基来源于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
实施例1、含有不同浓度普鲁兰尼克F68的培养基对细胞增殖的影响
取普鲁兰尼克F68加入至生理盐水中得100mM的普鲁兰尼克F68母液，分别用DMEM低糖培养基将普鲁兰尼克F68母液稀释成5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、18μg/mL、20μg/mL的药物溶液，再向药物溶液其中添加等量等浓度(6μg/mL)的木脂素。
将P1代胎盘间充质干细胞以104个/mL的密度接种于96孔板中，分别用含不同浓度普鲁兰尼克F68的培养基，每孔100μL，以不加普鲁兰尼克F68和木脂素的胎盘间充质干细胞的无血清培养基为空白组，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养，分别于6h、8h和12h之后，用MTT检测方法，测定每孔的吸光值，将加有普鲁兰尼克F68和木脂素的处理组的吸光值与不加普鲁兰尼克F68和木脂素的空白组的吸光值相比，计算每孔的细胞存活率，见表1。
表1
时间 5μg/mL 10μg/mL 15μg/mL 18μg/mL 20μg/mL
6h 100.59％ 115.47％ 128.41％ 158.41％ 139.45％
8h 99.84％ 117.27％ 129.88％ 162.24％ 139.97％
12h 102.36％ 112.56％ 117.76％ 165.89％ 140.18％
在12h，以浓度为18μg/mL普鲁兰尼克F68+6μg/mL木脂素的胎盘间充质干细胞的无血清培养基为试验A组，以含有(6μg/mL木脂素)不加普鲁兰尼克F68的胎盘间充质干细胞的无血清培养基为试验B组，以含有(18μg/mL普鲁兰尼克F68)不加木脂素的胎盘间充质干细胞的无血清培养基为试验C组，试验A、B、C组吸光值相比，计算每孔的细胞存活率。见表2。
表2
组别 存活率
试验A组 165.89％
试验B组 100.57％
试验C组 108.46％
结果如下：当普鲁兰尼克F68的浓度为10～18μg/mL时，存活率呈现升高的趋势，并随着浓度的增加而升高，当浓度为18μg/mL，存活率达到峰值，并随着浓度的增加而降低，并且本发明仅需要培养6～12h，便可达到胎盘间充质干细胞的高存活率，缩短了细胞的培养时间，提高了工作效率，并且普鲁兰尼克F68和木脂素复配还可以提高细胞的活力，减少细胞在培养过程的损伤。
实施例2、本发明的胎盘间充质干细胞无血清培养基
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基包括DMEM低糖培养基和补充剂，补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白1mg/mL、转铁蛋白5μg/mL、表皮细胞生长因子5ng/mL、转化生长因子-β10ng/mL、血小板生长因子10ng/mL、还原型谷胱甘肽1μg/mL、普鲁兰尼克F6810μg/mL和木脂素5μg/mL。
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：在DMEM低糖培养基中添加人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子-β、血小板生长因子、还原型谷胱甘肽、普鲁兰尼克F68和木脂素，搅拌均匀，搅拌速度为800rpm/min，搅拌时间为20min，经滤径为0.1μm滤膜过滤除菌，得到胎盘间充质干细胞无血清培养基。
在本实施例中，DMEM低糖培养基和补充剂的质量比为5:1。
实施例3、本发明的胎盘间充质干细胞无血清培养基
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基包括DMEM低糖培养基和补充剂，补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白3mg/mL、转铁蛋白6μg/mL、表皮细胞生长因子7ng/mL、转化生长因子-β20ng/mL、血小板生长因子15ng/mL、还原型谷胱甘肽2μg/mL、普鲁兰尼克F6815μg/mL和木脂素6μg/mL。
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：在DMEM低糖培养基中添加人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子-β、血小板生长因子、还原型谷胱甘肽、普鲁兰尼克F68和木脂素，搅拌均匀，搅拌速度为900rpm/min，搅拌时间为25min，经滤径为0.15μm滤膜过滤除菌，得到胎盘间充质干细胞无血清培养基。
在本实施例中，DMEM低糖培养基和补充剂的质量比为6:1。
实施例4、本发明的胎盘间充质干细胞无血清培养基
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基包括DMEM低糖培养基和补充剂，补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白4mg/mL、转铁蛋白8μg/mL、表皮细胞生长因子9ng/mL、转化生长因子-β25ng/mL、血小板生长因子20ng/mL、还原型谷胱甘肽4μg/mL、普鲁兰尼克F6815μg/mL和木脂素8μg/mL。
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：在DMEM低糖培养基中添加人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子-β、血小板生长因子、还原型谷胱甘肽、普鲁兰尼克F68和木脂素，搅拌均匀，搅拌速度为900rpm/min，搅拌时间为30min，经滤径为0.15μm滤膜过滤除菌，得到胎盘间充质干细胞无血清培养基。
在本实施例中，DMEM低糖培养基和补充剂的质量比为7:1。
实施例5、本发明的胎盘间充质干细胞无血清培养基
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基包括DMEM低糖培养基和补充剂，补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白5mg/mL、转铁蛋白10μg/mL、表皮细胞生长因子10ng/mL、转化生长因子-β30ng/mL、血小板生长因子25ng/mL、还原型谷胱甘肽5μg/mL、普鲁兰尼克F68 20μg/mL和木脂素10μg/mL。
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：在DMEM低糖培养基中添加人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子-β、血小板生长因子、还原型谷胱甘肽、普鲁兰尼克F68和木脂素，搅拌均匀，搅拌速度为1000rpm/min，搅拌时间为40min，经滤径为0.2μm滤膜过滤除菌，得到胎盘间充质干细胞无血清培养基。
在本实施例中，DMEM低糖培养基和补充剂的质量比为8:1。
实施例6、本发明的胎盘间充质干细胞无血清培养基
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基包括DMEM低糖培养基和补充剂，补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白3.5mg/mL、转铁蛋白6μg/mL、表皮细胞生长因子8ng/mL、转化生长因子-β14ng/mL、血小板生长因子10ng/mL、还原型谷胱甘肽2μg/mL、普鲁兰尼克F68 18μg/mL和木脂素6μg/mL。
本发明胎盘间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：在DMEM低糖培养基中添加人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子-β、血小板生长因子、还原型谷胱甘肽、普鲁兰尼克F68和木脂素，搅拌均匀，搅拌速度为900rpm/min，搅拌时间为35min，经滤径为0.1μm滤膜过滤除菌，得到胎盘间充质干细胞无血清培养基。
在本实施例中，DMEM低糖培养基和补充剂的质量比为6.5:1。
对比例1、本发明的胎盘间充质干细胞无血清培养基
与实施例6相似，区别仅在于，培养基不含有普鲁兰尼克F68和木脂素，其余步骤和参数与实施例6相同。
对比例2、本发明的胎盘间充质干细胞无血清培养基
与实施例6相似，区别仅在于，培养基不含有普鲁兰尼克F68，其余步骤和参数与实施例6相同。
对比例3、本发明的胎盘间充质干细胞无血清培养基
与实施例6相似，区别仅在于，培养基不含有木脂素，其余步骤和参数与实施例6相同。
对比例4、本发明的胎盘间充质干细胞无血清培养基
采用中国专利申请CN201911219419.5制备的无血清培养基。
试验例一、胎盘间充质干细胞增殖情况
将P1代胎盘间充质干细胞分别用实施例2～6及对比例1～4制备的培养基进行培养，将细胞制成浓度为2×108/L的细胞悬液，以100μL/孔接种于无菌的96培养板中，使用BrdU掺入到DNA合成期，在A450nm条件下，检测P5代细胞的增殖能力。
表3
组别 吸光度
实施例2 0.26
实施例3 0.25
实施例4 0.27
实施例5 0.26
实施例6 0.28
对比例1 0.09
对比例2 0.12
对比例3 0.14
对比例4 0.16
根据表3的数据可知，本发明实施例2～6制备的胎盘间充质干细胞无血清培养基可以显著提高P5代胎盘间充质干细胞的增殖能力，对比例1(未添加普鲁兰尼克F68和木脂素)制备的胎盘间充质干细胞无血清培养基提高P5代胎盘间充质干细胞的增殖能力较差，对比例2或对比例3制备的胎盘间充质干细胞无血清培养基只添加普鲁兰尼克F68和木脂素其中的一种，其提高胎盘间充质干细胞的增殖能力效果也不佳，说明普鲁兰尼克F68和木脂素复配时，可以促进胎盘间充质干细胞的快速增殖。
试验例二、胎盘间充质干细胞的细胞表面标志物的表达情况
将P1代胎盘间充质干细胞分别用实施例2～6制备的培养基和市场上现有的血清培养基进行培养，其中用血清培养基培养细胞作为对照组，取第5代的胎盘间充质干细胞，加入胰酶消化后制成单细胞悬液，在4℃孵育30min，用PBS洗2次后用流式细胞仪检测。
表4
组别 CD90<sup>+</sup> CD73<sup>+</sup> CD105<sup>+</sup>
实施例2 99.85％±0.16 99.94％±0.02 99.10％±0.01
实施例3 99.78％±0.12 99.94％±0.01 99.13％±0.01
实施例4 99.84％±0.15 99.95％±0.02 99.89％±0.02
实施例5 99.85％±0.14 99.92％±0.03 99.15％±0.02
实施例6 99.88％±0.16 99.99％±0.01 99.20％±0.03
对照组 50.51％±6.12 87.63％±0.02 74.22％±2.05
结果表4所示，采用本发明实施例2～6制备的胎盘间充质干细胞培养基经过5代培养得到的胎盘间充质干细胞，其CD90+、CD73+、CD105+细胞较多，仍然以较高的比例存在，细胞的生物学特性不变，具有间充质干细胞表面抗原特征。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.胎盘间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，包括DMEM低糖培养基和补充剂，所述补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白1～5mg/mL、转铁蛋白5～10μg/mL、表皮细胞生长因子5～10ng/mL、转化生长因子10～30ng/mL、血小板衍生生长因子10～25ng/mL、谷胱甘肽1～5μg/mL、普鲁兰尼克F68 10～20μg/mL和木脂素5～10μg/mL。
2.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述DMEM低糖培养基和补充剂的质量比为5～8:1。
3.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白1～4mg/mL、转铁蛋白5～8μg/mL、表皮细胞生长因子5～9ng/mL、转化生长因子10～25ng/mL、血小板衍生生长因子10～20ng/mL、谷胱甘肽1～4μg/mL、普鲁兰尼克F68 15～20μg/mL和木脂素5～8μg/mL。
4.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述补充剂包括以下浓度的组分：人血清白蛋白3.5mg/mL、转铁蛋白6μg/mL、表皮细胞生长因子8ng/mL、转化生长因子14ng/mL、血小板衍生生长因子10ng/mL、谷胱甘肽2μg/mL、普鲁兰尼克F68 18μg/mL和木脂素6μg/mL。
5.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。
6.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述血小板衍生生长因子为血小板生长因子。
7.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述转化生长因子为转化生长因子-β。
8.根据权利要求1～7任一所述的胎盘间充质干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在DMEM低糖培养基中添加人血清白蛋白、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、转化生长因子、血小板衍生生长因子、谷胱甘肽、普鲁兰尼克F68和木脂素，混匀，经滤膜过滤除菌，得到胎盘间充质干细胞无血清培养基。
9.根据权利要求8所述的胎盘间充质干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述滤膜滤径为0.1～0.2μm。
10.根据权利要求1～7任一所述的胎盘间充质干细胞无血清培养基在胎盘间充质干细胞培养中的用途。
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