CN117916360A - 用于角膜细胞培养和皮肤细胞培养的细胞培养基和补充剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于无血清细胞培养基或低血清细胞培养基的新的细胞培养基和补充剂。也提供了相应的方法和用途。当用于组织工程时，例如在角膜细胞和/或皮肤细胞的体外细胞培养期间，新的细胞培养基和补充剂尤其有益。
Description
技术领域
本发明提供用于无血清细胞培养基或低血清细胞培养基的新的细胞培养基和补充剂。也提供相应的方法和用途。当用于组织工程时，例如在角膜细胞和/或皮肤细胞的体外细胞培养期间，新的细胞培养基和补充剂尤其有益。
背景技术
组织工程的领域在过去十年中已经取得了巨大进步并且仍不断发展。现在不仅仅可更精确地控制细胞和其环境，还可组织越来越复杂的活的组织和器官以用于潜在的临床和商业用途。正在探索该领域中的数个商业和临床途径，包括用于疗法或其他工业应用(比如实验室生长皮革)的组织(比如角膜或皮肤替代物)的创建。
角膜基质等同物的创建，特别是使用天然组分时，代表了组织工程中的许多挑战。适当的角膜基质替代物需要是生物相容的、机械稳定的和光学透明的，以及能够在组织移植之前和之后抵抗收缩和蛋白水解的降解。近期，已经通过自下而上策略的方式在体外工程化角膜基质组织，使用细胞来生成细胞外基质，以便重建天然角膜的轮廓清晰的3D微结构。
皮肤负责几种重要的生理功能并且在伤口愈合中具有极大的临床意义。组织工程的替代物可用于遭受皮肤损伤的患者以支持表皮、真皮或二者的再生。作为用于产品测试的动物模型的替换物，皮肤替代物在化妆品和制药行业也越来越受到关注。最近的在细胞水平疗法(比如，间质干细胞或生长因子递送)到大规模生物制造技术(包括3D打印)的范围的生物医学进展，已经确保独特的策略和新的生物材料的实施，以再现天然皮肤的生物、结构和功能复杂性。另外，使用皮肤组织工程(例如从实验室生长皮革)生成商业收入也越来越受到关注。
当前该领域面临的挑战之一为可用在商业规模上和/或临床环境中的细胞培养资源的可用性有限。
需要用于组织工程(包括角膜和皮肤组织的工程化)的改善的细胞培养基和补充剂。
发明内容
本发明基于令人吃惊的发现，即具体的大分子拥挤(MMC)试剂在角膜细胞和/或皮肤细胞的培养期间为有用的补充剂。即使当不使用血清或减少血清时，这些试剂也可令人吃惊地促进细胞增殖。这些试剂可因此有利地用作角膜细胞和/或皮肤细胞培养过程期间的血清的可选的补充剂。它们因此提供新的、有效的、有成本效益的和符合伦理的用于角膜细胞和/或皮肤细胞生产(例如用于组织工程或细胞结构的生长)方式。
MMC试剂为具体类的食品级、无毒、非成瘾性、惰性的物质。它们通常作为常见的农业、海洋、发酵和生物燃料生产过程中的副产物生成，使它们成为用于高产率组织工程/细胞制造的便宜细胞培养基的便宜和理想补充剂。MMC试剂也是化学限定的，因此，它们在细胞培养基中作为血清替代物的用途减少了目前观察到的依赖于血清的过程的可变性。这为组织工程或细胞作为工业工具或产品的用途提供了明显的优势。MMC试剂在细胞培养基中的用途代表用于增加组织工程/细胞制造的效率的新的无动物/无异生素方法、可减少(或甚至消除)血清补充的需要的策略，使得产品真正无动物。本发明因此解决了该行业中的几种挑战。
在一个方面中，本发明因此提供用于体外细胞培养的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基，其中该细胞培养基包括基础培养基和选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂：PEG8、角叉藻聚糖、PVP40、PVP360和PEG35；或其组合。
适当地，大分子拥挤试剂可为下述的组合：PVP40和PVP360；或PEG8和PEG35。
也提供了用于体外细胞培养的包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基的用途，其中：
a)细胞为角膜细胞并且大分子拥挤试剂选自由下述组成的组中：PEG8、角叉藻聚糖、PVP40、PVP360、PEG35、70和400；或其组合；或者
b)细胞为皮肤细胞并且大分子拥挤试剂选自由下述组成的组中：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360、70和400；或其组合。
也提供了体外无血清细胞培养方法或低血清细胞培养方法，其包括在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养细胞，其中：
a)细胞为角膜细胞并且大分子拥挤试剂选自由下述组成的组中：PEG8、角叉藻聚糖、PVP40、PVP360、PEG35、70和400；或其组合；
b)细胞为皮肤细胞并且大分子拥挤试剂选自由下述组成的组中：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360、70和400；或其组合。
适当地，细胞可为角膜细胞并且大分子拥挤试剂可为下述的组合：PEG8和PEG35；70和400；或PVP40和PVP360。
适当地，细胞可be皮肤细胞并且大分子拥挤试剂可为下述的组合：PEG8和PEG35；70和400；或PVP40和PVP360。
适当地，基础培养基可为DMEM/F12。
适当地，细胞培养基可为无血清细胞培养基，任选地其中细胞培养基不含从动物获得的材料。
适当地，无血清细胞培养基可为化学限定的细胞培养基。
适当地，细胞培养基可进一步包括谷氨酰胺，任选地其中细胞培养基进一步包括抗坏血酸、胰岛素、运铁蛋白、硒和乙醇胺。
适当地，细胞培养基可包括大于约1mM，但是小于约10mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽；和任选地：
a)大于约0.1mM，但是小于约10mM的抗坏血酸；和
b)大于约1mg/L，但是小于约100mg/L的胰岛素；和
c)大于约0.5mg/L，但是小于约10mg/L的运铁蛋白；和
d)大于约0.5μg/L，但是小于约10μg/L的硒；和
e)大于约0.2mg/L，但是小于约20mg/L的乙醇胺。
适当地，细胞培养基可进一步包括青霉素和链霉素。
也提供了用于体外无血清细胞培养或低血清细胞培养的细胞培养基补充剂，其包括选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂：PVP40、角叉藻聚糖、PEG8、PVP360和PEG35、70和400；或其组合，其中补充剂进一步包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和/或谷氨酰胺。
适当地，补充剂可包括：
a)胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素在所得细胞培养基中的终浓度大于约1mg/L，但是小于约100mg/L；
b)运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.5mg/L，但是小于约10mg/L；
c)硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.5μg/L，但是小于约10μg/L；
d)乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.2mg/L，但是小于约20mg/L；
e)抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.1mM，但是小于约10mM；
f)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，在所得细胞培养基中，培养基中可用的谷氨酰胺的量的终浓度大于约1mM，但是小于约10mM；并且
g)选自下述的大分子拥挤试剂：
(i)PEG8，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG8在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.25g/L，但是小于约25g/L；或
(ii)PEG35，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG35在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.5g/L，但是小于约50g/L；或
(iii)PVP40，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP40在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.05g/L，但是小于约50g/L；或
(iv)PVP360，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP360在所得细胞培养基中的终浓度大于约50mg/L，但是小于约15g/L。
(v)角叉藻聚糖，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，角叉藻聚糖在所得细胞培养基中的终浓度大于约1mg/L，但是小于约10g/L；或
(vi)70，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，70在所得细胞培养基中的终浓度大于约300mg/L，但是小于约300g/L；或
(vii)400，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，400在所得细胞培养基中的终浓度大于约300mg/L，但是小于约300g/L。
适当地，补充剂可包括：
a)胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素的终浓度为约10mg/L；
b)运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白的终浓度为约5.5mg/L；
c)硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒的终浓度为约6.7μg/L；
d)乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺的终浓度为约2mg/L；
e)抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸的终浓度为约1mM；
f)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的终浓度为约4mM；和
g)选自由下述组成的组中的大分子拥挤试剂：角叉藻聚糖，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，角叉藻聚糖的终浓度为约10mg/L；PEG8，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG8的终浓度为约1.1g/L；PEG35，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG35的终浓度为约2g/L；PVP40，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP40的终浓度为约4.5g/L；PVP360，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP360的终浓度为约10g/L；和70和400，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时70和400的终浓度分别为约1g/L和0.75g/L。
适当地，补充剂可为液体溶液或干燥粉末或粒状干燥粉末。
适当地，补充剂可为50倍(50×)浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和分别选自由0.5g/L的角叉藻聚糖、55g/L的PEG8、225g/L的PVP40、100g/L的PEG35、500g/L的PVP360以及50g/L和37.5g/L的70和400组成的组大分子拥挤试剂。
也提供含有在本文中描述的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基或者细胞培养基补充剂的气密密封容器。
遍及本说明书的描述和权利要求，词语“包括”和“含有”以及它们的变型意指“包括但不限于”，并且它们不旨在排除(并且不排除)其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。
遍及本说明书的描述和权利要求，除非上下文以其他方式要求，否则单数也囊括复数。尤其，除非上下文以其他方式要求，否则在使用不定冠词的情况下，说明书应理解为考虑复数以及单数。
结合本发明的特别的方面、实施方式或实施例描述的特征、整数、特点、化合物、化学部分或基团应理解为适用于在本文中描述的任何其他方面、实施方式或实施例，除非与之不相容。
下面进一步详细描述本发明的各个方面。
附图说明
在下文中参考所附附图进一步描述本发明的实施方式，其中：
图1示出了利用补充MMC的培养基的人角膜基质细胞增殖。在培养7天之后使用AlamarBlueTM活力试验来确定细胞数量。柱表示三次独立重复的平均值并且误差棒示出了标准差。通过双因素方差分析和随后的Bonferroni多重比较检验来进行统计分析，<0.05、<0.01和<0.001的p值分别由*、**和***表示。
图2示出了利用补充MMC的培养基的人角膜基质细胞增殖。细胞数量在培养的第2周、第4周和第6周时使用AlamarBlueTM活力试验来确定。柱表示三次独立重复的平均值并且误差棒示出了标准差。通过双因素方差分析和随后的Bonferroni多重比较检验(GraphpadPrism)来进行统计分析，<0.05的p值由*表示。
图3示出了用对照、+PEG和+PEG+PA培养基生物制造6周的组织的物理特性。A)组织的湿重(左图)和干重(右图)。B)组织水合。C)组织厚度。统计分析表明+PEG和+PEG+PA条件促进生物制造，补充剂显著增加组织密度和厚度，同时减少总水合。表示了三次独立重复的平均值和对应的标准差。通过单因素方差分析和随后的Bonferroni多重比较检验(Graphpad Prism)来进行统计分析，<0.05和<0.01的p值分别由*和**表示。
图4示出了组织组分的分析。培养基补充+PEG和+PEG+PA促进角膜特异性基质胶原蛋白(I型和V型)和蛋白聚糖的沉积。表示了三次独立重复的平均值和对应的标准差。通过单因素方差分析和随后的Bonferroni多重比较检验(Graphpad Prism)来进行统计分析，<0.05、<0.01和<0.001的p值分别由*、**和***表示。
图5示出了皮肤成纤维细胞在DMEM/F12培养基(SFM)、补充血清的培养基(+1％FBS)或补充MMC的培养基中生长3天。柱表示三次独立重复的平均值并且误差棒示出了标准差。利用双因素方差分析和随后的Dunnet多重比较检验来进行统计分析，<0.05、<0.01和<0.001的p分别由*、**和***表示。
图6示出了皮肤成纤维细胞在DMEM/F12培养基(SFM)、补充血清的培养基(+1％FBS)或补充MMC的培养基中生长7天。柱表示三次独立重复的平均值并且误差棒示出了标准差。利用双因素方差分析和随后的Dunnet多重比较检验来进行统计分析，<0.05、<0.01和<0.001的p分别由*、**和***表示。
在本文中引用的专利、科学和技术文献建立了提交时本领域技术人员可获得的知识。在本文中引用的公布的专利、公开和待决的专利申请和其他出版物的全部公开通过引用并入本文，其程度与具体地和单独指示每项通过引用并入的相同。在任何不一致的情况下，本公开将优先。
下面进一步详细描述本发明的各个方面。
具体实施方式
在真核细胞培养中，MMC试剂先前已经与高水平的血清补充剂(例如，2％-20％v/v)组合以增强和加速细胞外基质(ECM)沉积(见例如参考文献[1]和[10])。它们对细胞培养的效果取决于使用的具体MMC试剂。这可能是由于每种MMC试剂的具体的特性(例如，电荷、尺寸、流体动力学半径等-见参考文献[8])所造成的。
发明人现在已经研究了不同MMC试剂在无血清情况下或在低(例如，0.1％-2％)血清条件下对细胞培养的效果。他们已经惊奇地发现具体的MMC试剂在无血清情况下用作细胞培养补充剂时，增加了细胞增殖，和/或减少了细胞分化，和/或促进了组织产生。这些MMC可因此有利地用于无血清培养条件或低血清培养条件以改善细胞培养过程。这些效果似乎取决于使用的具体的MMC以及细胞类型(见参考文献[7]，其示出了在脂肪干细胞的培养期间向无血清培养基添加 400混合物的有害的效果)。
因此在本文中提供用于体外细胞培养的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基，其中细胞培养基包括基础培养基和选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360、角叉藻聚糖、70和400；或其组合。
如在本文中使用的术语“细胞培养”指在有利于细胞的生长、分化和/或持续活力的条件下将细胞保持在人工环境中。例如，当与适当的对照比较时，细胞数量和/或细胞活力增加，则可促进细胞生长。细胞培养通过有活力细胞/ml培养基的数量来评估。术语“细胞培养”和“体外细胞培养”在本文中互换使用。
本领域技术人员应知，细胞可培养不同时间段。在本发明的上下文中，细胞可在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养至少一天。例如，细胞可在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养至少2天。
在一个示例中，细胞可在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养至少3天或至少4天。在另一示例中，细胞可在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养至少5天或至少6天。
在一个示例中，细胞可在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养至少7天(即至少一周)。在另一示例中，细胞可在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养至少2周或至少3周。在另一示例中，细胞可在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养至少4周或至少5周。在另一示例中，细胞可在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养至少6周。
细胞培养可以本领域已知的任何方式进行。例如，细胞可在细胞培养容器(比如细胞培养瓶或细胞培养板)中培养。可选地，细胞可在生物反应器中培养。
细胞可为贴壁细胞，或它们可为悬浮的。对于贴壁细胞，细胞可附接至任何适当的表面。例如，细胞可附接至细胞培养板的表面或细胞培养瓶的表面。可选地，细胞可附接至微载体(比如，明胶珠、葡聚糖珠、纤维素珠、塑料珠或玻璃珠)。
术语“细胞培养基”和“培养基”(在每种情况下，复数为“培养基(media)”)指用于培养活细胞的营养溶液并且可互换使用。典型地，细胞培养基可为完全的制剂，即，不需要进一步补充以培养细胞的细胞培养基。各种细胞培养基将是本领域技术人员已知的，本领域技术人员也将理解待培养的细胞的类型可决定待使用的培养基的类型。
细胞培养基的特点和制剂取决于特别的细胞要求而改变。重要参数包括渗透性、pH和营养组分。细胞培养基制剂已经在文献中充分记录并且许多培养基为商业上可得到的。在早期细胞培养工作中，培养基制剂基于血液的化学组合物和物理化学特性(例如，重量克分子渗透浓度、pH等)并且称为“生理学溶液”。然而，就氧气/二氧化碳分压以及营养物、维生素和痕量元素的浓度而言，哺乳动物身体的不同组织中的细胞暴露于不同微环境；相应地，成功的不同细胞类型的体外培养可需要使用不同培养基制剂。细胞培养基的典型组分包括氨基酸、有机盐和无机盐、维生素、痕量金属、糖、脂质和核酸，其类型和量可取决于给定细胞或组织类型的特别的要求而改变。细胞培养基由在溶液中保持在一起并且形成“稳定”组合的相容组分组成。当成分在溶液的标准货架期内基本上不沉淀、劣化、降解或分解时，含有“相容成分”或“相容组分”的溶液称为“稳定的”。
在本文中描述的细胞培养基通常包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤(MMC)试剂。“基础培养基”(复数为“培养基”)为用作初始(开始)培养基的细胞培养试剂，向其中添加补充剂(比如生长因子等)以生成适合支持细胞生长的细胞培养基，而无需进一步补充。基础培养基为通常仅用于细胞营养，但是不用于细胞活力、生长或产品生产的维持的培养基。其通常包括许多成分(包括氨基酸、糖、脂质、维生素、有机盐和无机盐以及缓冲液)，每种成分以支持哺乳动物细胞体外维持的量存在。仅仅通过示例，但是不是限制，基础培养基的示例包括：达尔伯克(Dulbecco)改良伊格尔培养基(DMEM)、哈姆(Ham)F-12、最低必需培养基(MEM)、基础伊格尔培养基(BME)、RPMI-1640、哈姆F-10、α最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥(Glasgow)最低必需培养基(G-MEM)和伊思柯夫(Iscove)改良达尔伯克(Dulbecco)培养基(IMDM)或其任何组合。
在特别的示例中，基础培养基可为DMEM或F-12或其组合(例如DMEM/F12)。
商业上(例如，从英杰公司(Invitrogen Corporation)，卡尔斯巴德，加利福尼亚)可得到的或以其他方式本领域已知的其他培养基可等同地用作基础培养基，包括但不限于，293SFM、CD-CHO培养基、VP SFM、BGJb培养基、布林斯特(Brinster)BMOC-3培养基、细胞培养冷冻培养基、CMRL培养基、EHAA培养基、eRDF培养基、费希尔(Fischer)培养基、甘博格(Gamborg)B-5培养基、GLUTAMAXTM补充培养基、格雷斯(Grace)昆虫细胞培养基、HEPES缓冲培养基、里希特(Richter)改良MEM、IPL-41昆虫细胞培养基、莱博维茨(Leibovitz)L-15培养基、麦考伊(McCoy)5A培养基、MCDB 131培养基、培养基199、改良伊格尔培养基(MEM)、培养基NCTC-109、施耐德(Schneider)果蝇培养基、TC-100昆虫培养基、韦茅斯(Waymouth)MB752/1培养基、威廉(William)培养基E、无蛋白杂交瘤培养基II(PFHMII)、AIM V培养基、角质细胞SFM、限定角质细胞SFM、SFM、完全的甲基纤维素培养基、HepatoZYME-SFM、NeurobasalTM培养基、Neurobasal-A培养基、HibernateTM A培养基、Hibernate E培养基、内皮SFM、人内皮SFM、杂交瘤SFM、PFHMII、Sf 900培养基、Sf 900IISFM、EXPRESS培养基、CHO-S-SFM、AMINOMAX-II完全培养基、AMINOMAX-C100完全培养基、AMINOMAX-C140基础培养基、PUB-MAXTM染色体核型分析培养基、KARYOMAX骨髓染色体核型分析培养基、KNOCKOUT D-MEM和CO2独立培养基。上述培养基从本领域普通技术人员已知的制造商(比如JRH、Sigma、HyClone和BioWhittaker)获得。
血清通常作为补充剂添加至细胞培养基以支持培养中的细胞的生长。在本文中使用的术语“血清”指血液的血清组分，即，已经去除凝血蛋白的血浆。其也囊括“重构的”血清(例如已经进一步处理以去除非期望的(例如有害的)组分并且任选地浓缩有益组分的血清)。
典型地，血清来自牛来源(胎牛血清，FBS；小牛血清，BCS)、山羊来源(山羊血清，GS)或马来源(马血清，HS)。尽管FBS为动物细胞培养基中最常用的补充剂，但是也经常使用其他血清来源(包括新生小牛、马和人)。这些类型的化学上未限定的补充剂在细胞培养基中提供几种有用的功能。例如，血清为细胞提供另外营养物(包括在溶液中的营养物以及结合至蛋白质的营养物)。其也提供参与生长促进和专用的细胞功能的几种生长因子和激素。此外，其提供可携带其他分子至细胞中的几种结合蛋白质(如白蛋白、运铁蛋白)。例如：携带脂质、维生素、激素等至细胞中的白蛋白。其也供应促进细胞附接至基质的蛋白质(纤连蛋白)。其也提供有助于细胞在细胞开始分裂之前展开的铺展因子。血清也提供保护细胞免受蛋白水解的蛋白酶抑制剂。其也提供矿物质，如Na+、K+、Zn2+、Fe2+等。其增加培养基的粘度并且因此，保护细胞在悬浮培养的搅拌期间免受机械损伤。其也起缓冲液的作用。
尽管在细胞培养期间将血清用作补充剂有几种优势，但是在细胞培养期间也存在期望从细胞培养基中减少或省略血清的几种情况。例如，因为血清就其本质而言在其组成上是可变的，所以血清在细胞培养基的存在培养基的组合物中引入了可变性。在使用血清之前，也需要进行测试以保持每个批次的血清的质量。另外，血清可含有一些生长抑制因子并且其在细胞培养基中的存在可干扰成体干细胞或祖细胞的分化，以及干扰细胞培养产物的纯化和分离。最后，其不是来自可持续来源并且因此为用于商业规模上的细胞培养的相对昂贵补充剂。
血清补充剂也可被可严重损害培养细胞的健康和终产物的质量的致病因子(例如，支原体和病毒)污染。未限定的组分(比如血清或动物提取物)的使用也防止了对培养细胞的营养和激素要求的真正限定和阐明，从而消除了以受控方式研究具体的生长因子或营养物对培养中的细胞生长和分化的效果的能力。而且，由于血清或提取物蛋白质的非特异性共纯化，因此培养基的血清补充剂可使期望的物质从培养基中的纯化复杂化并且成本增加。
血清的组成的可变性、污染的风险和其可持续来源的缺乏为商业规模和全球规模上的组织工程和工业细胞制造的问题。
虽然细胞培养的无血清方法是可获得的，但是通常导致较低水平的细胞增殖和/或细胞维持，或针对每种细胞类型而要求添加重组蛋白、生长因子和其他昂贵成分的混合物。
本发明基于令人吃惊的发现，即用MMC(比如选自由下述组成的组中的一种或多种MMC试剂)补充细胞培养基：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360、角叉藻聚糖、70和400；或其组合，对于某些细胞，可缓解细胞培养基中对血清的需要。
在本文中描述的细胞培养基因此通常为无血清细胞培养基或低血清细胞培养基。
术语“低血清”细胞培养基用于描述用于细胞培养的细胞培养基，其中细胞培养基已经补充了血清，但是其水平低于通常用于感兴趣的细胞的最佳培养的水平。例如，在本领域中公认的是，角膜细胞或皮肤细胞通常在包括至少5％(v/v)血清的细胞培养基中培养以进行细胞生长和组织形成。在角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养的上下文中，具有不大于约2％(v/v)血清的培养基可因此视为“低血清”细胞培养基。换句话说，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的低血清细胞培养基可具有约2％(v/v)血清的最大血清浓度。例如，在角膜细胞或皮肤细胞的上下文中，低血清细胞培养基可具有在(基本上)无血清至不大于约2％(v/v)血清的范围内的血清浓度。换句话说，在本文中描述的低血清细胞培养基可具有在(基本上)无血清至最大约2％(v/v)血清的范围内的血清浓度。
在一些实施例中，低血清细胞培养基可具有在(基本上)无血清至最大约1.5％(v/v)血清的范围内的血清浓度。
在另一示例中，低血清细胞培养基可具有在(基本上)无血清至最大约1％(v/v)血清的范围内的血清浓度。在进一步的示例中，低血清细胞培养基可具有在(基本上)无血清至最大约0.5％(v/v)血清的范围内的血清浓度。
低血清细胞培养基可具有约2％(v/v)血清的最大血清浓度。可选地，其可具有约1.5％(v/v)血清的最大血清浓度。
例如，其可具有约1％(v/v)血清的最大血清浓度。作为进一步示例，其可具有约0.5％(v/v)血清的最大血清浓度。
低血清细胞培养基可(基本上)不含血清。在该上下文中，“基本上无血清”意指细胞培养基可具有不大于痕量的血清。痕量可限定为细胞培养基中最大0.1％(v/v)血清。
例如，低血清细胞培养基可具有零至约2％(v/v)血清。例如，低血清细胞培养基可具有零至约1.5％(v/v)血清。例如，低血清细胞培养基可具有零至约1％(v/v)血清。例如，低血清细胞培养基可具有零至约0.5％(v/v)血清。例如，低血清细胞培养基可具有约0.1％(v/v)至约2％(v/v)血清。例如，低血清细胞培养基可具有约0.1％(v/v)至约1.5％(v/v)血清。例如，低血清细胞培养基可具有约0.1％(v/v)至约1％(v/v)血清。作为另一示例，低血清细胞培养基可具有约0.1％(v/v)至约0.5％(v/v)血清。
其中不存在可检测的血清的细胞培养基在本文中称为“无血清”细胞培养基(SFM)。典型地，对于含有血清的培养基，血清在细胞培养开始时或在细胞培养期间作为补充剂添加。术语“无血清”细胞培养基因此包括未补充血清的细胞培养基。术语“无血清”为本领域非常熟知的。
本领域技术人员清楚的是，“无血清”培养基可包括许多添加剂和补充剂，条件是培养基不含可检测的水平的血清。在下面的实施例部分中测试了两种不同无血清培养基，这两种无血清培养基中的二者由术语“无血清”培养基囊括；“SFM”(其中“SFM”用于描述包括具有谷氨酰胺(例如GlutaMAX)作为(具有抗生素)主补充剂的基础培养基(例如DMEM/F12)的培养基)；并且“SFM*”(其中“SFM*”用于描述包括具有谷氨酰胺(例如GlutaMAX)、抗坏血酸、胰岛素、运铁蛋白、硒和乙醇胺作为(具有抗生素)主补充剂的基础培养基(例如DMEM/F12)的培养基)。SFM和SFM*均为可用于本发明的上下文的无血清培养基的示例。
在本文中描述的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基是特别有利的，因为它们使用更可持续的试剂来提供用于细胞培养的更加化学限定的培养基，并且与依赖血清的等同物相比具有更低的污染的风险。
无血清培养基仍可含有一种或多种的各种动物来源组分(包括白蛋白、胎球蛋白、各种激素和其他蛋白质)。
在一个示例中，无血清细胞培养基不含从动物获得的材料。换句话说，在该示例中，培养基不含动物来源的材料。在本文中使用的术语“动物来源的”材料指整体或部分来源于动物来源的材料(包括重组体动物DNA或重组体动物蛋白)。换句话说，该材料是从动物来源获得的或从动物来源分离的。为了避免疑问，模拟动物中天然存在的材料(例如蛋白质)的合成材料(例如蛋白质)不是“动物来源的”，因为它们是合成制成的并且为化学限定的。
例如，无血清细胞培养基可为化学限定的细胞培养基。“化学限定”培养基为在其用于培养细胞之前每种化学物质和每种化学物质的各自量已知的一种培养基。化学限定培养基不使用化学物质未知的和/或非量化的裂解物或水解产物而制成。
化学限定培养基通常具体地配制为支持单个细胞类型的培养，不含未限定的补充剂而是掺入限定量的纯化的通常由血清提供的生长因子、蛋白质、脂蛋白和其他物质。因为这种培养基中的组分(以及其浓度)是精确地已知的，这些培养基一般称为“限定培养基”。无血清培养基和限定培养基之间的区别在于无血清培养基没有血清和蛋白质部分(例如，血清白蛋白)，但是不必含有其他未限定的组分(比如器官提取物/腺体提取物)。因此，无血清培养基不能视为该术语的真正定义中的限定培养基。
限定培养基一般为使用者提供几种明显优势。例如，限定培养基的使用利于研究具体的生长因子或其他培养基组分对细胞生理的效果，当细胞在含血清或提取物的培养基中培养时，这种效果可被掩盖。另外，限定培养基通常比含有血清或提取物的培养基含有量低的多的蛋白质(的确，限定培养基通常称为“低蛋白质培养基”)，使得由在限定培养基中培养的细胞产生的生物物质的纯化容易的多并且更便宜。
大多数限定培养基在基础培养基中掺入了另外的组分以使培养基在营养上更复杂，同时保持培养基的不含血清和低蛋白含量。这种组分的示例包括牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)；某些来源于天然(动物)或重组来源的生长因子(比如表皮生长因子(EGF)或成纤维细胞生长因子(FGF))；脂质(比如脂肪酸、甾醇和磷脂)；脂质衍生物和复合物(比如磷酸乙醇胺、乙醇胺和脂蛋白)；蛋白质和类固醇激素(比如胰岛素、氢化可的松和孕酮)；核苷酸前体；以及某些痕量元素。
在本文中描述的细胞培养基为无血清细胞培养基或低血清细胞培养基，任选地其中无血清细胞培养基不含从动物获得的材料(例如为化学限定的细胞培养基)。
在本文中描述的细胞培养基可包括一种或多种另外的组分。这种组分的示例包括合成的组分，比如但不限于下述中的一种或多种：合成的血清白蛋白、Lonza HL-1TM补充剂、合成的成纤维细胞生长因子(FGF)、合成的表皮生长因子(EGF)、合成的血小板来源的生长因子(PDGF)、人生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素类生长因子(IGF)、角质细胞生长因子(KGF)、胰岛素、运铁蛋白、N-2MAX培养基和N21-MAX培养基补充剂(R&D)、B-27TM补充剂(ThermoScientific)、杂交瘤补充剂(Grisp)、panexin basic、panexin CD、panexinNTA、panexin NTS、panexin BMM(Pan Biotech)、α-1-抗胰蛋白酶、α-1-酸糖蛋白、α-2-巨球蛋白、β-2-微球蛋白、触珠蛋白、纤溶酶原、碳酸酐酶I、碳酸酐酶II、铁蛋白、C-反应蛋白、血纤维蛋白原、血红蛋白A、血红蛋白βA2、血红蛋白βC、血红蛋白βF、血红蛋白βS、甲状腺球蛋白、胆红素、肌酸酐、皮质醇、生长激素、甲状旁腺素、三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)、睾酮、孕酮(P4)、催乳素、促黄体激素、前列腺素E、前列腺素F、胆固醇、乳酸脱氢酶和/或碱性磷酸酶。
如在本文其他地方叙述的，细胞培养基通常包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤(MMC)试剂。尤其，在本文中描述的细胞培养基包括选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360、角叉藻聚糖、70和400；或其组合。
大分子拥挤(MMC)为基于排斥体积效应的原理的生物物理现象。其涉及向反应介质或培养基添加大分子。遵循排斥体积效应的原理(两个分子不能同时占据同一空间)，MMC显著增加生物化学反应和生物过程的速率和动力学。根据排斥体积效应理论，被特别的分子排除的溶液的体积取决于背景分子之间的非特异性阻碍(由尺寸和形状决定)和静电排斥(由电荷决定)的和。聚集为通过大分子(可为移动的或固定的)减少可获得的溶剂体积的结果。聚集阻碍溶质扩散，从而增加有效溶质浓度。这反过来增加了溶质的化学势。聚集可因此偏移反应平衡和改变化学反应的速率。聚集因此已经广泛用于研究聚合物成环动力学特性、DNA结构、凝聚、复制和稳定性，例如。大分子拥挤影响许多关键过程(包括细胞粘附、迁移、增殖以及细胞外基质形成和重塑)[7]。这些积极影响脂肪细胞和肌细胞(或其组合)的细胞培养的效果已经在本文中示出。这样的MMC试剂在本文中描述的脂肪细胞和/或肌细胞的细胞培养期间的用途因此是特别有利的。
数种MMC试剂为已知的。在本文中描述的细胞培养基、补充剂、方法和用途的上下文中，MMC试剂可为选自由下述组成的组中的一种或多种MMC试剂：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360、角叉藻聚糖、70和400；或其组合。
聚乙二醇(PEG)为对体外实验有效果(比如影响配体亲和力和酶促反应的速率并且当与血清使用时促进细胞外基质沉积)的常用的大分子拥挤剂[8]。聚乙二醇为通过环氧乙烷的聚合来制备的并且在宽范围的分子量(300Da至10,000kDa)内是商业上可得到的(Alister等，应用化学国际版，第48卷，第7期，第1248-1252页)。例如，聚乙二醇8kDa(PEG8)为无毒的聚醚，其具有全部允许在水溶液中稀释的亲水性头[4]。由PEG8诱导的大分子拥挤通过增加高浓度下的基质结合以及增加增殖细菌菌株来调节反应[5，6]。PEG8的分子结构是熟知的，见例如Sigma-Aldrich，Cas号25322-68-3，直链式：H(OCH2CH2)nOH和Hyun-JunJang等，毒理学研究，2015年6月；31(2)：105-136。
可在本文中使用的可选的PEG为PEG35。PEG35的分子结构也是熟知的，见例如Hyun-Jun Jang等，毒理学研究，2015年6月；31(2)：105-136。
聚乙烯吡咯烷酮40kDa(PVP40)为水溶性聚合物，其具有各种用途(包括饮品稳定性用途和医学用途(其中其用作血浆体积膨胀剂))[9]。与血清组合的PVP40也已经被证明有效的大分子拥挤剂，其处理增加人真皮成纤维细胞的I型胶原蛋白和增殖二者[10]。PVP40的分子结构是熟知的，见例如Sigma Aldrich，Cas号9003-39-8，直链式(C6H9NO)n和Kariduraganavar等，天然和合成生物医学聚合物；第1章，2014，第1至31页。
I型胶原蛋白产生的增加表明，聚乙烯吡咯烷酮360kDa(PVP360)与血清一起用作大分子拥挤剂已经被证明增加人真皮成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积[10]。PVP360的分子结构也是熟知的。见例如Kariduraganavar等，天然和合成生物医学聚合物；第1章，2014，第1至31页。
角叉藻聚糖(也称为角叉菜胶(carrageenin))为从红色可食用的海草中提取的天然直链硫酸化多糖的系列。最熟知的也是最重要的用于制造亲水性胶体以产生角叉藻聚糖的红色海草为角叉菜(爱尔兰苔藓)，其为附着在岩石上生长的深红色欧芹类植物。角叉藻聚糖因其凝胶、增厚和稳定特性而广泛地用于食品工业。由于其与食品蛋白质的强结合，因此角叉藻聚糖的主要应用于乳制品和肉产品。
所有角叉藻聚糖为高分子量多糖并且主要由交替的形成角叉藻聚糖的二糖重复单元的3-键b-D-半乳糖-吡喃(G-单位)和4-键a-D-吡喃半乳糖(D-单位)或4-键3,6-脱水-a-D-吡喃半乳糖(DA-单位)组成。存在角叉藻聚糖的三种主商业类型：κ角叉藻聚糖、ι角叉藻聚糖和λ角叉藻聚糖。不同类型的角叉藻聚糖的分子结构是熟知的，见例如Hilliou，食品与营养研究进展，2014；72:17-43。
在优选的示例中，在本发明的上下文中使用的角叉藻聚糖为λ角叉藻聚糖。角叉藻聚糖囊括最初从红色海草中提取的硫酸化半乳聚糖的系列，其中已经发现它们起到关键的结构功能。传统上，角叉藻聚糖是作为包括三种分子物质(通过它们的硫酸化和是否存在无水半乳糖来限定)的不同组合的粗提取物来产生和使用的。λ-角叉藻聚糖含有约35％的硫酸酯并且不含无水半乳糖，使得其极易溶于水并且不能形成凝胶。相比之下，ι-角叉藻聚糖和κ-角叉藻聚糖含有较少的硫酸酯和约30％-35％的3,6-脱水半乳糖，使得它们不溶于冷水并且在热水溶液中形成热可逆凝胶。λ-角叉藻聚糖的不同物理化学和生物特性表明该分子物质与ι物质和κ物质以及粗角叉藻聚糖提取物完全不同。
角叉藻聚糖由于其增加细胞外基质产生的能力而已经被提议为有前景的用于组织工程的大分子拥挤剂(MMC)。已经证明用角叉藻聚糖和血清处理脂肪来源的干细胞增强I型、II型和V型胶原蛋白的细胞外基质沉积，增加细胞增殖以及增加骨生成、软骨形成和减少脂肪形成[1]。
70(也称为聚(蔗糖-共-环氧氯丙烷))在细胞体积信号传导和蛋白质重折叠的研究中用作大分子拥挤试剂。其可用于组织工程和大分子构象研究以开发、评估和使用大分子拥挤(MMC)系统和配置。70的分子结构是熟知的，见例如Sigma Aldrich，Cas号72146-89-5和CN102690364A。
400(也称为聚蔗糖400)为蔗糖的非离子合成聚合物蔗糖，其用于细胞分开和器官分离。400的分子结构是熟知的，见例如Sigma Aldrich，Cas号26873-85-8和CN102690364A和https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ficoll-400。
在本文中描述的MMC试剂可用作单个补充剂(其中仅一种MMC试剂添加至细胞培养基)或MMC试剂可组合使用。本领域技术人员可鉴定适当的组合。例如，可使用至少两种MMC试剂的组合。可选地，可使用至少三种或至少四种MMC试剂的组合。
在本文中描述了MMC试剂的具体组合，例如PVP40和PVP360的组合，或PEG8和PEG35的组合，或70和400的组合。在本文中表明了这些具体组合对具体的细胞类型的功用。然而，其他适当的组合也可由本领域技术人员基于在本文中的公开而选择。例如，PVP40可与PEG8组合。可选地，PVP40可与PEG35组合。可选地，PVP40可与70组合。可选地，PVP40可与400组合。可选地，PVP40可与角叉藻聚糖组合。
在另一示例中，PVP360可与PEG8组合。可选地，PVP360可与PEG35组合。可选地，PVP360可与70组合。可选地，PVP360可与400组合。可选地，PVP360可与角叉藻聚糖组合。
在另一示例中，PEG8可与70组合。可选地，PEG8可与400组合。可选地，PEG8可与角叉藻聚糖组合。
在另一示例中，PEG35可与70组合。可选地，PEG35可与400组合。可选地，PEG35可与角叉藻聚糖组合。
MMC试剂可在本文中描述的细胞培养基中以任何适当的浓度使用。
例如，当使用PEG8时，可以大于约0.25g/L，但是小于约25g/L细胞培养基的终浓度使用它。例如，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约0.5g/L，但是小于约10g/L的终浓度的PEG8。例如，其可通常包括大于约0.5g/L，但是小于约5g/L。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约1.1g/L的PEG8的终浓度。
在另一示例中，当使用PEG35时，可以大于约0.5g/L，但是小于约50g/L细胞培养基的终浓度使用它。例如，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约0.5g/L，但是小于约25g/L的终浓度的PEG35。例如，其可通常包括大于约1g/L，但是小于约10g/L。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约2g/L的PEG35的终浓度。
在进一步的示例中，当使用PVP40时，可以大于约0.05g/L，但是小于约50g/L细胞培养基的终浓度使用它。例如，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约0.5g/L，但是小于约25g/L的终浓度的PVP40。例如，其可通常包括大于约1g/L，但是小于约10g/L。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约4.5g/L的PVP40的终浓度。
在进一步的示例中，当使用PVP360时，可以大于约50mg/L，但是小于约15g/L细胞培养基的终浓度使用它。例如，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约0.5g/L，但是小于约15g/L的终浓度的PVP360。例如，其可通常包括大于约1g/L，但是小于约15g/L。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约10g/L的PVP360的终浓度。
例如，当使用角叉藻聚糖时，可以大于约1mg/L，但是小于约10g/L的细胞培养基的终浓度使用它。例如，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约1mg/L，但是小于约10g/L的终浓度的角叉藻聚糖。例如，其可通常包括大于约1mg/L，但是小于约1g/L。例如，其可通常包括大于约5mg/L，但是小于约100mg/L。例如，其可通常包括大于约5mg/L，但是小于约50mg/L。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约10mg/L的角叉藻聚糖的终浓度。
例如，当使用70、400或其组合时，可以大于约300mg/L，但是小于约300g/L的细胞培养基的终浓度使用它。例如，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约300mg/L，但是小于约300g/L的终浓度的70、400或其组合。例如，其可通常包括大于约500mg/L，但是小于约100g/L的70。例如，其可通常包括大于约375mg/L，但是小于约75g/L的400。例如，其可通常包括分别大于约500mg/L和375mg/L，但是小于约100g/L和75g/L的70和400。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约10g/L的70和7.5g/L的400的终浓度。
组合使用的MMC试剂的适当的终浓度可基于在本文中提供的公开而使用本领域已知的常规方法来确定。
在本文中描述的细胞培养基对角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养尤其有益。换句话说，这些细胞培养基对角膜或皮肤组织工程或者角膜或皮肤细胞制造特别有用。
在本文中使用的术语“细胞”指包括真核细胞的所有类型。在优选的实施方式中，该术语指哺乳动物细胞，并且最优选地指小鼠或人。细胞可为正常细胞或异常细胞(即，转化细胞、确立细胞或来源于患病组织样品的细胞)。该术语包括贴壁细胞和非贴壁细胞二者。
角膜细胞包括角膜基质细胞。适当的角膜基质细胞的示例包括角膜成纤维细胞。角膜成纤维细胞，也称为角膜细胞，为角膜基质的间质来源的细胞。术语“角膜成纤维细胞”和“角膜细胞”在本文中互换使用。角膜基质细胞也可为优选地包括角膜缘上皮细胞的角膜干细胞，即可从在角膜的边缘处的角膜缘获得的干细胞和分化细胞的异质混合物。在另一示例中，基质细胞包括基质祖细胞(比如分化或未分化形式的角膜成纤维细胞(角膜细胞))。优选地，这些角膜成纤维细胞从外周角膜缘或从角膜缘环获得。在另一示例中，基质细胞为骨髓细胞。基质细胞也可来源于iPSC。
皮肤细胞包括上皮细胞和真皮成纤维细胞。真皮成纤维细胞存在于皮肤的真皮层内，并且负责生成将表皮的分层鳞状的上皮细胞组织成统一组织的结缔组织。
在下面的实施例部分描述，无血清细胞培养基或低血清细胞培养基包括基础培养基和选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360、角叉藻聚糖、70和400；或其组合，当培养角膜细胞(比如角膜基质细胞)时，该无血清细胞培养基或低血清细胞培养基特别有用。
这些阐述的MMC试剂的组合可用于角膜细胞(比如角膜基质细胞)的培养。例如，PEG8和PEG35的组合可有利于角膜细胞(比如角膜基质细胞)的培养。在另一示例中，PEG8和PVP40的组合可为有益的。在一个示例中，可使用PEG8和PVP360的组合。可选地，PEG8和70的组合可为有利的。在一个示例中，可使用PEG8和400的组合。
可选地，PEG35和PVP40的组合在角膜细胞(比如角膜基质细胞)的培养中可为有益的。在一个示例中，可使用PEG35和PVP360的组合。可选地，PEG35和70的组合可为有利的。在一个示例中，可使用PEG35和400的组合。
可选地，PVP40和PVP360的组合可用于角膜细胞(比如角膜基质细胞)的培养。可选地，PVP40和70的组合可为有利的。在一个示例中，可使用PVP40和400的组合。
可选地，可使用角叉藻聚糖和PEG8的组合。可选地，角叉藻聚糖和PEG35的组合可为有利的。在另一示例中，角叉藻聚糖和PVP40的组合可为有益的。在一个示例中，可使用角叉藻聚糖和PVP360的组合。在另一示例中，角叉藻聚糖和70的组合可为有利的。在一个示例中，可使用的组合角叉藻聚糖和400。
可选地，70和400的组合可用于角膜细胞(比如角膜基质细胞)的培养。
在另一示例中，无血清细胞培养基或低血清细胞培养基包括基础培养基和选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360、70和400；或其组合，当培养皮肤细胞(比如成纤维细胞)时，该无血清细胞培养基或低血清细胞培养基特别有用。
这些阐述的MMC试剂的组合可用于皮肤细胞(比如成纤维细胞)的培养。例如，可使用PVP360和PEG8的组合。可选地，PVP360和PEG35的组合可为有利的。在另一示例中，PVP360和PVP40的组合可为有益的。可选地，PVP360和70的组合可为有利的。在另一示例中，PVP360和400的组合可为有益的。
在进一步的示例中，PEG8和PEG35的组合可有利于皮肤细胞(比如成纤维细胞)的培养。在另一示例中，PEG8和70可为有利的。在另一示例中，PEG8和400的组合可为有益的。
可选地，PEG35和PVP40的组合在皮肤细胞(比如成纤维细胞)的培养中可为有益的。在另一示例中，PEG35和70可为有利的。在另一示例中，PEG35和400的组合可为有益的。
可选地，70和400的组合可用于皮肤细胞(比如成纤维细胞)的培养。
本领域技术人员可鉴定上面提到的MMC试剂和MMC试剂组合的适当的浓度。
本领域技术人员清楚的是，除了上面阐述的基础培养基和MMC试剂之外，在本文中描述的细胞培养基可包括另外补充剂。
例如，细胞培养基可包括谷氨酰胺(在本文中也称为稳定的谷氨酰胺)。包括基础培养基(例如DMEM/F12)和谷氨酰胺(并且不添加血清)的细胞培养基在下面实施例部分中称为“SFM”。
谷氨酰胺的适当的来源为本领域熟知的并且可由本领域技术人员容易地鉴定。通过示例，但是不是限制性的，谷氨酰胺可通过向基础培养基(比如DMEM/F12)添加GlutaMAXTM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、L-谷氨酰胺或谷氨酰胺的任何其他来源而存在于细胞培养基中。
例如，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约1mM，但是小于约10mM的谷氨酰胺(例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽)。例如，其可通常包括大于约1.5mM，但是小于约5mM的谷氨酰胺(例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽)。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约2mM至约4mM之间的谷氨酰胺。
细胞培养基可包括上面阐述的谷氨酰胺。另外，细胞培养基可包括抗坏血酸、胰岛素、运铁蛋白、硒和乙醇胺中的一种或多种。包括基础培养基(例如DMEM/F12)、谷氨酰胺抗坏血酸、胰岛素、运铁蛋白、硒和乙醇胺(并且不含血清)的细胞培养基在下面实施例部分中称为“SFM*”。
例如，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约0.1mM，但是小于约10mM的抗坏血酸。例如，其可通常包括大于约0.5mM，但是小于约5mM的抗坏血酸，或大于约0.5mM，但是小于约2mM的抗坏血酸。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约1mM的抗坏血酸。
除了抗坏血酸之外，细胞培养基可包括上面阐述的谷氨酰胺。
细胞培养基可因此包括在本文中举出的范围中的谷氨酰胺和处于在本文中举出的范围的抗坏血酸。作为一个示例，为了培养角膜细胞或皮肤细胞，其可具有约2mM至约4mM之间的谷氨酰胺和约1mM的抗坏血酸。
用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约1mg/L，但是小于约100mg/L的胰岛素。例如，其可通常包括大于约5mg/L，但是小于约50mg/L的胰岛素，或大于约5mg/L，但是小于约25mg/L的胰岛素。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约10mg/L的胰岛素。
除了胰岛素之外，细胞培养基可包括上面阐述的谷氨酰胺和/或抗坏血酸。
细胞培养基可因此包括在本文中举出的范围中的谷氨酰胺、处于在本文中举出的范围的抗坏血酸和在本文中举出的范围的胰岛素。作为一个示例，为了培养角膜细胞或皮肤细胞，其可具有约2mM至约4mM之间的谷氨酰胺，约1mM的抗坏血酸和约10mg/L的胰岛素。
用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约0.5mg/L，但是小于约10mg/L的运铁蛋白。例如，其可通常包括大于约1mg/L，但是小于约8mg/L的运铁蛋白，或大于约3mg/L，但是小于约8mg/L的运铁蛋白。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约5.5mg/L的运铁蛋白。
除了运铁蛋白之外，细胞培养基可包括上面阐述的谷氨酰胺、抗坏血酸和/或胰岛素。
细胞培养基可因此包括在本文中举出的范围中的谷氨酰胺、处于在本文中举出的范围的抗坏血酸、在本文中举出的范围的胰岛素和在本文中举出的范围的运铁蛋白。作为一个示例，为了培养角膜细胞或皮肤细胞，其可具有约2mM至约4mM之间的谷氨酰胺、约1mM的抗坏血酸、约10mg/L的胰岛素和约5.5mg/L的运铁蛋白。
用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约0.5μg/L，但是小于约10μg/L的硒。例如，其可通常包括大于约2μg/L，但是小于约10μg/L的硒，或大于约2μg/L，但是小于约8μg/L的硒。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约6.7μg/L的硒。
除了硒之外，细胞培养基可包括上面阐述的谷氨酰胺、抗坏血酸、胰岛素和/或运铁蛋白。
细胞培养基可因此包括在本文中举出的范围中的谷氨酰胺、处于在本文中举出的范围的抗坏血酸、在本文中举出的范围的胰岛素、在本文中举出的范围的运铁蛋白和在本文中举出范围的硒。作为一个示例，为了培养角膜细胞或皮肤细胞，其可具有约2mM至约4mM之间的谷氨酰胺、约1mM的抗坏血酸、约10mg/L的胰岛素、约5.5mg/L的运铁蛋白和约6.7μg/L的硒。
用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基可包括大于约0.2mg/L，但是小于约20mg/L的乙醇胺。例如，其可通常包括大于约0.5mg/L，但是小于约10mg/L的乙醇胺，或大于约1mg/L，但是小于约5mg/L的乙醇胺。典型地，用于培养角膜细胞或皮肤细胞的细胞培养基具有约2mg/L的乙醇胺。
除了乙醇胺之外，细胞培养基可包括上面阐述的谷氨酰胺、抗坏血酸、胰岛素、运铁蛋白和/或硒。
细胞培养基可因此包括在本文中举出的范围中的谷氨酰胺、处于在本文中举出的范围的抗坏血酸、在本文中举出的范围的胰岛素、在本文中举出的范围的运铁蛋白在本文中举出范围的硒和在本文中举出范围的乙醇胺。作为一个示例，为了培养角膜细胞或皮肤细胞，其可具有约2mM至约4mM之间的谷氨酰胺、约1mM的抗坏血酸、约10mg/L的胰岛素、约5.5mg/L的运铁蛋白、约6.7μg/L的硒和约2mg/L的乙醇胺。
另外的细胞培养补充剂也可存在于细胞培养基内。例如，抗生素(比如青霉素和/或链霉素)通常存在于细胞培养基中以减少细菌感染/污染的风险。用于细胞培养的这样的抗生素的常规浓度范围为本领域熟知的并且同样适用于在本文中描述的细胞培养基。
当培养角膜细胞或皮肤细胞时，在本文中提供的细胞培养基特别有用。在下面实施例部分中可以看出，在本文中阐述的MMC试剂对角膜细胞或皮肤细胞活力和增殖具有显著效果。
具体地，证明了，在角膜细胞的培养期间，PEG8、角叉藻聚糖、PVP40、PVP360或者70和400的组合的存在增加了细胞活力和/或增殖。另外，证明了PEG35，PEG8和PEG35的组合；或PVP40和PVP360在角膜细胞的培养期间的存在对细胞活力和/或增殖具有有益效果。类似地，证明了PVP360、PVP40、PEG35或者70和400的组合在皮肤细胞的培养期间的存在增加了细胞活力和/或增殖。另外，证明了PEG8、PEG8和PEG35的组合；或PVP40和PVP360在皮肤细胞的培养期间的存在对细胞活力和/或增殖具有有益效果。因此，当期望改善细胞活力和/或细胞增殖时，使用包括这些具体的MMC中的一种或多种的细胞培养基对这些细胞类型特别有用。
包括基础培养基和选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基可因此用于促进角膜细胞的细胞生长、细胞活力和/或增殖：角叉藻聚糖、PEG8、PEG35、PVP40和PVP360；或者PEG8和PEG35的组合；或70和400；或PVP40和PVP360。
另外，包括基础培养基和选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基可因此用于促进皮肤细胞的细胞生长、细胞活力和/或增殖：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360或者PEG8和PEG35的组合；或70和400；或PVP40和PVP360。
另外，发现具体的MMC试剂在角膜细胞培养中增加组织产生。具体地，证明了，在细胞培养期间，PEG8、PEG35、角叉藻聚糖或者70和400的组合的存在通过角膜细胞增加组织产生。此外，证明了PVP40，PVP360，PEG8和PEG35的组合或者PVP40和PVP360的组合的存在通过角膜细胞促进组织产生。因此，当期望组织产生时，使用包括这些具体的MMC中的一种或多种的细胞培养基特别有用。
包括基础培养基和选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂无血清细胞培养基或低血清细胞培养基可因此用于改善由角膜细胞(比如角膜基质细胞)的组织产生：角叉藻聚糖，PEG8，PEG35，PVP40，PVP360，PEG8和PEG35的组合，PVP40和PVP360的组合或者70和400的组合。
上述数据总结在下面实施例部分中的表1和表2中。
本领域技术人员清楚的是，在本文中描述的细胞培养基中的任何一种可用于体外细胞培养，特别是用于角膜细胞或皮肤细胞的培养。因此在本文中也提供这些细胞培养基用于体外细胞培养的用途。在本文中详细地描述的细胞培养基组合物和针对具体的细胞类型描述的益处同样适用于这种用途。
在本文中也提供细胞培养的方法，其中方法包括在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养细胞。这样的方法特别涉及角膜细胞或皮肤细胞的培养。在本文中详细地描述的细胞培养基和针对具体的细胞类型描述的益处同样适用于这样的方法。
使用在本文中描述的细胞培养基来培养角膜细胞或皮肤细胞的典型细胞培养方法和过程囊括在本文中并且是本领域熟知的。例如，在本文中描述的体外低血清或无血清细胞培养方法可包括培养细胞(即将细胞保持在叙述的细胞培养基中)标准时间段，例如最小24小时的时段。可使用常规培养过程。
在本文中也描述了细胞培养基补充剂。本领域技术人员清楚的是，这些补充用于添加至基础培养基，例如，以确保用于细胞培养的适当的细胞培养基的制备。因此，在本文中限定的细胞培养补充剂不包括基础培养基。
相应地，提供了用于体外无血清细胞培养或低血清细胞培养的细胞培养基补充剂，其包括选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360、角叉藻聚糖、70和400；或其组合，其中补充剂进一步包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和/或谷氨酰胺。细胞培养基补充剂的单个组分在本文中其他地方详细地描述，并且等同于在此处描述。
术语“细胞培养基补充剂”和“细胞培养基补充剂制剂”在本文中互换使用。
在本文中限定的细胞培养补充剂为包括多个成分的单个组合物。在本文中描述的细胞培养补充剂可包括适当的比例的成分，使得当补充剂添加至基础培养基时，补充剂成分以其期望浓度(其工作浓度)存在于所得培养基中。例如，MMC试剂、胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和谷氨酰胺可以相对比例存在于补充剂制剂中，该相对比例确保补充剂以MMC试剂、胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和谷氨酰胺中的每一个以其工作浓度存在于所得培养基中的量添加至基础培养基。这些成分的适当的比例可由本领域技术人员使用在本文中提供的工作浓度和浓度范围而确定。
例如，细胞培养补充剂可包括：
a)胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素在所得细胞培养基中的终浓度大于约1mg/L，但是小于约100mg/L；
b)运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.5mg/L，但是小于约10mg/L；
c)硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.5μg/L，但是小于约10μg/L；
d)乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.2mg/L，但是小于约20mg/L；
e)抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.1mM，但是小于约10mM；
f)谷氨酰胺(例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽)，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，在所得细胞培养基中，培养基中可用的谷氨酰胺的量的终浓度大于约1mM，但是小于约10mM；以及
g)选自下述的大分子拥挤试剂：
(i)PEG8，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG8在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.25g/L，但是小于约25g/L；或
(ii)PEG35，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG35在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.0g/L，但是小于约50g/L；或
(iii)PVP40，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP40在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.05g/L，但是小于约50g/L；或
(iv)PVP360，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP360在所得细胞培养基中的终浓度大于约50mg/L，但是小于约15g/L；或
角叉藻聚糖，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，角叉藻聚糖在所得细胞培养基中的终浓度大于约1mg/L，但是小于约10g/L细胞；或
(v)70，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，70在所得细胞培养基中的终浓度大于约300mg/L，但是小于约300g/L；或
(vi)400，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，400在所得细胞培养基中的终浓度大于约300mg/L，但是小于约300g/L。
在一个示例中，除了(g)(i)之外，细胞培养补充剂包括(a)至(f)。例如，当培养角膜细胞或皮肤细胞时，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)，和PEG8，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG8在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.25g/L，但是小于约25g/L。例如，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)，和PEG8，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG8的终浓度大于约0.5g/L，但是小于约10g/L，例如大于约0.5g/L，但是小于约5g/L。典型地，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和PEG8，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG8的终浓度为约1.1g/L。
在一个示例中，细胞培养补充剂包括胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素的终浓度为约10mg/L；运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白的终浓度为约5.5mg/L；硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒的终浓度为约6.7μg/L；乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺的终浓度为约2mg/L；抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸的终浓度为约1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的终浓度为约4mM；和PEG8，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG8的终浓度为约1.1g/L。
在另一示例中，除了(g)(ii)之外，细胞培养补充剂包括(a)至(f)。例如，当培养角膜细胞或皮肤细胞时，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)，和PEG35，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG35在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.5g/L，但是小于约50g/L。例如，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和PEG35，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG35的终浓度大于约0.5g/L，但是小于约25g/L例如大于约1g/L，但是小于约10g/L。典型地，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和PEG35，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG35的终浓度为约2g/L。
在一个示例中，细胞培养补充剂包括胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素的终浓度为约10mg/L；运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白的终浓度为约5.5mg/L；硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒的终浓度为约6.7μg/L；乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺的终浓度为约2mg/L；抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸的终浓度为约1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的终浓度为约4mM；和PEG35，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PEG35的终浓度为约2g/L。
在另一示例中，除了(g)(iii)之外，细胞培养补充剂包括(a)至(f)。例如，当培养角膜细胞或皮肤细胞时，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)，和PVP40，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP40在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.05g/L，但是小于约50g/L。例如，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和PVP40，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP40的终浓度大于约0.5g/L，但是小于约25g/L例如大于约1g/L，但是小于约10g/L。典型地，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和PVP40，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP40的终浓度为约4.5g/L。
在一个示例中，细胞培养补充剂包括胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素的终浓度为约10mg/L；运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白的终浓度为约5.5mg/L；硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒的终浓度为约6.7μg/L；乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺的终浓度为约2mg/L；抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸的终浓度为约1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的终浓度为约4mM；和PVP40，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP40的终浓度为约4.5g/L。
在另一示例中，除了(g)(iv)之外，细胞培养补充剂包括(a)至(f)。例如，当培养角膜细胞或皮肤细胞时，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)，和PVP360，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP360在所得细胞培养基中的终浓度大于约50mg/L，但是小于约15g/L。例如，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和PVP360，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP360的终浓度大于约0.5g/L，但是小于约15g/L例如大于约1g/L，但是小于约15g/L。典型地，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和PVP360，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP360的终浓度为约10g/L。
在一个示例中，细胞培养补充剂包括胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素的终浓度为约10mg/L；运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白的终浓度为约5.5mg/L；硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒的终浓度为约6.7μg/L；乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺的终浓度为约2mg/L；抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸的终浓度为约1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的终浓度为约4mM；和PVP360，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，PVP360的终浓度为约10g/L。
在一个示例中，除了(g)(v)之外，细胞培养补充剂包括(a)至(f)。例如，当培养角膜细胞或皮肤细胞时，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)，和角叉藻聚糖，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，角叉藻聚糖在所得细胞培养基中的终浓度大于约1mg/L，但是小于约10g/L。例如，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和角叉藻聚糖，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，角叉藻聚糖在所得细胞培养基中的终浓度大于约1mg/L，但是小于约1g/L例如大于约5mg/L，但是小于约100mg/L。典型地，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和角叉藻聚糖，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，角叉藻聚糖的终浓度为约10mg/L。
在一个示例中，细胞培养补充剂包括胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素的终浓度为约10mg/L；运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白的终浓度为约5.5mg/L；硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒的终浓度为约6.7μg/L；乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺的终浓度为约2mg/L；抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸的终浓度为约1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的终浓度为约4mM；和角叉藻聚糖，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，角叉藻聚糖的终浓度为约10mg/L。
在另一示例中，除了(g)(vi)之外，细胞培养补充剂包括(a)至(f)。例如，当培养角膜细胞或皮肤细胞时，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)，和70，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，70在所得细胞培养基中的终浓度大于约300mg/L，但是小于约300g/L。例如，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和70，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，70的终浓度大于约500mg/L，但是小于约100g/L，例如大于约1g/L，但是小于约50g/L。典型地，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和70，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，70的终浓度为约10g/L。
在一个示例中，细胞培养补充剂包括胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素的终浓度为约10mg/L；运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白的终浓度为约5.5mg/L；硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒的终浓度为约6.7μg/L；乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺的终浓度为约2mg/L；抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸的终浓度为约1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的终浓度为约4mM；和70，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，70的终浓度为约10g/L。
在另一示例中，除了(g)(vii)之外，细胞培养补充剂包括(a)至(f)。例如，当培养角膜细胞或皮肤细胞时，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)，和400，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，400在所得细胞培养基中的终浓度大于约300mg/L，但是小于约300g/L。例如，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和400，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，400的终浓度大于约375mg/L，但是小于约75g/L例如大于约1g/L，但是小于约50g/L。典型地，细胞培养补充剂可包括(a)至(f)和400，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，400的终浓度为约7.5g/L。
在一个示例中，细胞培养补充剂包括胰岛素，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，胰岛素的终浓度为约10mg/L；运铁蛋白，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，运铁蛋白的终浓度为约5.5mg/L；硒，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，硒的终浓度为约6.7μg/L；乙醇胺，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，乙醇胺的终浓度为约2mg/L；抗坏血酸，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，抗坏血酸的终浓度为约1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的终浓度为约4mM；和400，其浓度为，当补充剂添加至基础培养基时，400的终浓度为约7.5g/L。
在本文中其他地方提供了这些成分中的每一种的最佳终浓度范围和值。这些同样适用于可用于在本文中提供的细胞培养补充剂的范围、值和组合。补充剂中的成分的适当的比例可由本领域技术人员基于本文的公开而容易地得到。
在本文中描述的细胞培养补充剂通常配制为浓缩的补充剂制剂，其可适当地稀释(例如在基础培养基中)以使用。在该上下文中，浓缩的补充剂可具有任何适当的浓度，例如其可为5×制剂、10×制剂、50×制剂等。在该上下文中，1×制剂表示补充剂中的成分的工作浓度(即这些成分存在于细胞培养基中时需要的浓度)。换句话说，1×制剂表示成分的“工作浓度”。工作浓度在本文中也称为“终浓度”。
术语“1×制剂”意在指含有以工作浓度存在于细胞培养基中的一些或所有成分的任何水溶液。“1×制剂”可指，例如，细胞培养基或指该培养基的成分的任何亚组。1×溶液中的成分的浓度与存在于用于体外培养细胞的细胞培养基中的该成分的浓度大致相同。用于细胞的体外培养的细胞培养基为通过限定的1×制剂。当存在许多成分时，1×制剂中的每种成分浓度约等于在细胞培养期间的培养基中的每种单独成分的浓度。例如，RPMI-1640培养基含有，与其他成分一起的0.2g/L的L-精氨酸、0.05g/L的L-天冬酰胺和0.02g/L的L-天冬氨酸酸。这些氨基酸的“1×制剂”在溶液中含有大致相同浓度的这些成分。因此，当提及“1×制剂”时，意指溶液中的每种成分具有与描述的细胞培养基中存在的相同或大致相同的浓度。细胞培养基的1×制剂中的成分的浓度是本领域普通技术人员熟知的。见，例如，用于制备用于无血清动物细胞培养的培养基、补充剂和基质的方法Allen R.Liss，纽约(1984)，微生物培养手册，第二版，Ronald M.Atlas编辑，Lawrence C.Parks(1997)CRC出版社，博卡拉顿，佛罗里达，和植物培养基，第1卷：配方和用途，E.F.George，D.J.M.Puttock和H.J.George(1987)Exegetics Ltd.爱丁顿，韦斯特伯里，威尔特，BA13 4QG，英格兰。然而，与培养基相比，1×制剂中的渗透性和/或pH可不同，特别是当1×制剂中含有较少成分时。
“10×制剂”意在指溶液，其中该溶液中的每种成分的浓度比在细胞培养期间的培养基中的每种单独成分的浓度高约10倍。例如，RPMI-1640培养基的10×制剂(与上面1×制剂相比)可含有，与其他成分一起的2.0g/L的L-精氨酸、0.5g/L的L-天冬酰胺和0,2g/L的L-天冬氨酸酸。“10×制剂”可含有浓度为1×培养制剂中存在的浓度的10倍的许多另外成分。将容易地显而易见，“25×制剂”、“50×制剂”、“100×制剂”、“500×制剂”和“1000×制剂”分别标注与1×细胞培养制剂相比以约25倍、约50倍、约500倍或约100倍的浓度含有成分的溶液。同样，培养基制剂和浓缩的溶液的渗透性和pH可变化。
在本文中描述的补充剂制剂可适当地浓缩为，例如，10×、20×、25×、50×、100×、500×或1000×补充剂制剂。
特别优选的示例为50×补充剂制剂。在该上下文中，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽以及选自由下述组成的组中的大分子拥挤试剂：55g/L的PEG8、225g/L的PVP40、100g/L的PEG35、500g/L的PVP360、0.5g/L的角叉藻聚糖以及50g/L的70和37.5g/L的400。
例如，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和55g/L的PEG8。
在进一步的示例中，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和225g/L的PVP40。
可选地，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和100g/L的PEG35。
此外，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和500g/L的PVP360。
可选地，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和0.5g/L的角叉藻聚糖。
此外，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和50g/L的70和37.5g/L的400。
换句话说，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸以及选自由PEG8、PVP40、PEG35、PVP360、角叉藻聚糖、70和400组成的组中的大分子拥挤试剂，其中胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和MMC试剂由下述组成：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽以及选自由55g/L的PEG8、225g/L的PVP40、100g/L的PEG35、500g/L的PVP360、0.5g/L的角叉藻聚糖以及50g/L的70和37.5g/L的400组成的组中的大分子拥挤试剂。
例如，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和PEG8，其中胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和PEG8由下述组成：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和55g/L的PEG8。
在进一步的示例中，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和PVP40，其中胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和PVP40由下述组成：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和225g/L的PVP40。
可选地，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和PEG35，其中胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和PEG35由下述组成：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和100g/L的PEG35。
此外，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和PVP360，其中胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和PVP360由下述组成：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和500g/L的PVP360。
可选地，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和角叉藻聚糖，其中胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和角叉藻聚糖由下述组成：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和0.5g/L的角叉藻聚糖。
此外，补充剂制剂可为50×浓缩液体溶液，并且该液体溶液可包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和70和400，其中胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和70和400由下述组成：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和50g/L的70和37.5g/L的400。
本领域技术人员将清楚，补充剂可以不同形式(比如，干燥粉末培养基(“DPM”)、粒状制剂(其需要添加水，但是不需要其他处理，比如调节pH)、液体培养基或作为培养基浓缩物)制备。因此，补充剂可为液体溶液或干燥粉末或粒状干燥粉末。
也提供含有在本文中描述的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基或者细胞培养基补充剂的气密密封容器。
“容器(vessel)”意指任何容器(container)，例如，玻璃容器、塑料容器或金属容器，其可提供用于储存本文所述的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基或者细胞培养基补充剂的无菌环境。容器可具有任何体积，例如其可适当地为配置为容纳约500ml或约1L的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基或者细胞培养基补充剂的容器。
气密密封为使给定物体密封(防止空气、氧气或其他气体的通过)的任何类型的密封。该术语最初适用于密封玻璃容器，但是随着技术进步，其适用于更大类别的材料，包括橡胶和塑料。
除非在本文中另外限定，否则在本文中使用的所有技术术语和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Singleton和Sainsbury，微生物学和分子生物学词典，第2版，John Wiley和Sons，纽约(1994)；和Hale和Marham，哈珀柯林斯生物学词典，Harper Perennial，纽约(1991)为本领域技术人员提供本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管与在本文中描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践，但是在本文中描述了优选的方法和材料。相应地，通过参考作为整体的说明书来更充分地描述下面紧接着限定的术语。并且，在本文中使用的，单数术语“一个(a)”，“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指示。除非以其他方式指示，核酸以5'至3'的方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的方向分别从左到右书写。应理解，本发明不限于描述的特别的方法、方案和试剂，因为这些可取决于本领域技术人员使用它们的上下文而变化。
本发明的各个方面通过下述非限制性实施例来证明。
实施例
1.1对角膜细胞测试聚乙二醇8kDa(PEG8)
实验方法
用2种不同无血清培养基使从人供体角膜分离的角膜基质细胞生长：SFM*对照，其包括具有1×ITS液体培养基、1mM的抗坏血酸、10μM的视黄酸和1％的抗生素补充剂的低葡萄糖(2g/L)DMEM；+PEG，与SFM*相同，外加20g/L的PEG8；和+PEG+PA，与SFM*相同，外加20g/L的PEG8和1μm的ETTES-PA。测试这些制剂在无血清条件下促进加速的组织形成的能力。
温育2周、4周和6周之后，使用AlamarBlueTM活力试验(Thermo FisherScientific)确定增殖的变化。培养6周之后评估组织形成，根据厚度、重量、水合和组成荧光显微镜来分析，并且使用ImageJ软件量化。
增殖-PEG8增加人角膜基质细胞的细胞增殖
据观察，+PEG补充剂在所有测试的时间点显著增加细胞数量，但是+PEG+PA却没有。见图1。
组织形成-PEG8促进角膜基质组织的形成
培养6周的时段之后，分析通过用不同培养基的细胞生长而形成的组织并且根据厚度、重量和水合(图2)以及具体的角膜细胞和基质组分(图3)来比较。+PEG和+PEG+PA中的总生物质增加(尽管不显著)，这些两个条件导致显著更厚、更少水合(更致密)组织(图2)。而且，补充MMC的培养基增加角膜特异性ECM组分，即I型和V型胶原蛋白以及角膜蛋白的沉积(图3)。
结论
PEG8处理增加角膜基质细胞增殖
20g/l的PEG8处理导致改善的组织生物制造，增加角膜特异性ECM的沉积
2.1MMC补充剂对皮肤成纤维细胞增殖的效果
将鱼皮肤成纤维细胞以1.5×103细胞/cm2接种在24孔板中的补充有1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(SFM)中。为了允许细胞附接，将培养物在37℃和5％(v/v)CO2的潮湿气氛中温育4小时。然后用补充有MMC试剂或补充有1％ FBS的培养基更换培养基，并且使细胞生长3天。细胞数量表示为SFM对照的百分数并且使用双因素方差分析进行统计学分析，使用Dunnett多重比较检验处理和未处理的对照之间的差异。
结论：PEG35、PVP40和PVP360促进细胞生长，而PSS是有害的。λ角叉藻聚糖抑制成纤维细胞增殖。PEG8具有边际效应(数据未示出)。最后，证明了70/400促进成纤维细胞增殖。见图4。
在本文中提供的数据的总结如下。
表1：不同MMC试剂对角膜基质细胞的增殖和组织产生的效果。MMC试剂以效果的顺序排列(第1个表示最有益的)。
| 增殖 |
| 促进剂 |
| 1.PVP360 |
| 2.PVP40 |
| 3.Ficoll70:400混合物 |
| 4.PEG35 |
| 促进剂(弱) |
| 5.PEG8 |
| 6.PEG8:35混合物 |
| 7.PVP40:360混合物 |
| 有毒的 |
| 8.λ角叉藻聚糖 |
| 9.DxS40 |
| 10.Dx500 |
| 11.PSS |
| 12.DxS40:500混合物 |
表2：不同MMC试剂对皮肤细胞的增殖的效果。MMC试剂以效果的顺序排列(第1个表示最有益的)。
读者应注意与本说明书同时或在本说明书之前提交的与本申请相关并且与本说明书一起供公众查阅的所有纸件和文档，并且所有这样的纸件和文档的内容通过引用并入本文。
在本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有的特征，和/或如此公开的任何方法或工艺的所有的步骤，可以任何组合来组合，除了其中这种特征和/或步骤的至少一些相互排斥的组合。
除非明确地以其他方式叙述，否则在本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的每个特征，可被服务相同、等效或类似目的的可选的特征替代。因此，除非明确地以其他方式叙述，否则每个公开的特征仅为等同或类似特征的通用系列中的一个示例。
本发明不限于任何前述实施方式的细节。本发明延伸至在本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新的一个或任何新的组合，或者延伸至如此公开的任何方法或工艺的步骤的任何新的一个或任何新的组合。
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Claims (18)
1.包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基用于体外细胞培养以促进细胞增殖的用途，其中：
a)所述细胞为皮肤细胞并且所述大分子拥挤试剂选自由下述组成的组中：PEG8、PEG35、PVP40和PVP360；或其组合；或者
b)所述细胞为角膜细胞并且所述大分子拥挤试剂选自由下述组成的组中：PEG8、PVP40、PVP360和PEG35；或其组合。
2.一种用于促进细胞增殖的体外无血清细胞培养方法或低血清细胞培养方法，包括在包括基础培养基和一种或多种大分子拥挤试剂的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基中培养细胞，其中：
a)所述细胞为皮肤细胞并且所述大分子拥挤试剂选自由下述组成的组中：PEG8、PEG35、PVP40、PVP360；或其组合；或者
b)所述细胞为角膜细胞并且所述大分子拥挤试剂选自由下述组成的组中：PEG8、PVP40、PVP360、PEG35；或其组合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途或方法，其中所述细胞为皮肤细胞并且所述大分子拥挤试剂为下述的组合：PEG8和PEG35；或PVP40和PVP360。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的用途或方法，其中所述细胞为角膜细胞并且所述大分子拥挤试剂为下述的组合：PEG8和PEG35；PVP40和PVP360。
5.一种用于体外细胞培养的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基，其中所述细胞培养基包括基础培养基和选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂：PEG8、PVP40、PVP360和PEG35；或其组合。
6.根据权利要求5所述的细胞培养基，其中所述大分子拥挤试剂为下述的组合：PVP40和PVP360；或PEG8和PEG35。
7.根据任何前述权利要求所述的细胞培养基、用途或方法，其中所述基础培养基为DMEM/F12。
8.根据任何前述权利要求所述的细胞培养基、用途或方法，其中所述细胞培养基为无血清细胞培养基，任选地其中所述细胞培养基不含从动物获得的材料。
9.根据权利要求8所述的细胞培养基、用途或方法，其中所述无血清细胞培养基为化学限定的细胞培养基。
10.根据任何前述权利要求所述的细胞培养基、用途或方法，其中所述细胞培养基进一步包括谷氨酰胺，任选地其中所述细胞培养基进一步包括抗坏血酸、胰岛素、运铁蛋白、硒和乙醇胺。
11.根据权利要求10所述的细胞培养基、用途或方法，其中所述细胞培养基包括大于约1mM，但是小于约10mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽；和任选地：
a)大于约0.1mM，但是小于约10mM的抗坏血酸；和
b)大于约1mg/L，但是小于约100mg/L的胰岛素；和
c)大于约0.5mg/L，但是小于约10mg/L的运铁蛋白；和
d)大于约0.5μg/L，但是小于约10μg/L的硒；和
e)大于约0.2mg/L，但是小于约20mg/L的乙醇胺。
12.根据任何前述权利要求所述的细胞培养基、用途或方法，其中所述细胞培养基进一步包括青霉素和链霉素。
13.一种用于体外无血清细胞培养或低血清细胞培养的细胞培养基补充剂，包括选自由下述组成的组中的一种或多种大分子拥挤试剂：PVP40、PEG8、PVP360和PEG35；或其组合，其中所述补充剂进一步包括：胰岛素、运铁蛋白、硒、乙醇胺、抗坏血酸和/或谷氨酰胺。
14.根据权利要求13所述的补充剂，包括：
a)胰岛素，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述胰岛素在所得细胞培养基中的终浓度大于约1mg/L，但是小于约100mg/L；
b)运铁蛋白，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述运铁蛋白在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.5mg/L，但是小于约10mg/L；
c)硒，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述硒在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.5μg/L，但是小于约10μg/L；
d)乙醇胺，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述乙醇胺在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.2mg/L，但是小于约20mg/L；
e)抗坏血酸，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述抗坏血酸在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.1mM，但是小于约10mM；
f)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述在所得细胞培养基中，培养基中可用的谷氨酰胺的量的终浓度大于约1mM，但是小于约10mM；和
g)选自下述的大分子拥挤试剂：
(i)PEG8，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述PEG8在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.25g/L，但是小于约25g/L；或
(ii)PEG35，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述PEG35在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.5g/L，但是小于约50g/L；或
(iii)PVP40，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述PVP40在所得细胞培养基中的终浓度大于约0.05g/L，但是小于约50g/L；或
(iv)PVP360，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述PVP360在所得细胞培养基中的终浓度大于约50mg/L，但是小于约15g/L。
15.根据权利要求14所述的补充剂，包括：
a)胰岛素，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述胰岛素的终浓度为约10mg/L；
b)运铁蛋白，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述运铁蛋白的终浓度为约5.5mg/L；
c)硒，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述硒的终浓度为约6.7μg/L；
d)乙醇胺，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述乙醇胺的终浓度为约2mg/L；
e)抗坏血酸，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述抗坏血酸的终浓度为约1mM；
f)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的终浓度为约4mM；和
g)选自由下述组成的组中的大分子拥挤试剂：PEG8，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述PEG8的终浓度为约1.1g/L；PEG35，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述PEG35的终浓度为约2g/L；PVP40，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述PVP40的终浓度为约4.5g/L；和PVP360，其浓度为，当所述补充剂添加至基础培养基时所述PVP360的终浓度为约10g/L。
16.根据权利要求13至15中的任一项所述的补充剂，其中所述补充剂为液体溶液或干燥粉末或粒状干燥粉末。
17.根据权利要求16所述的补充剂，其中所述补充剂为50×浓缩液体溶液，并且所述液体溶液包括：0.5g/L的胰岛素、0.27g/L的运铁蛋白、0.35ml/L的硒、0.1g/L的乙醇胺、50mM的抗坏血酸、100mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽以及选自由55g/L的PEG8、225g/L的PVP40、100g/L的PEG35和500g/L的PVP360组成的组中的大分子拥挤试剂。
18.一种气密密封容器，含有根据前述权利要求中的任一项所述的无血清细胞培养基或低血清细胞培养基或者细胞培养基补充剂。
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