KR20230051077A

KR20230051077A - 세포 배양을 통한 세포외기질 제조방법 및 제조된 세포외기질의 용도

Info

Publication number: KR20230051077A
Application number: KR1020220125870A
Authority: KR
Inventors: 윤희훈; 김유미; 정종갑
Original assignee: 에이치엘비셀 주식회사
Priority date: 2021-10-08
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2023-04-17
Also published as: WO2023059011A1

Abstract

본 발명은 세포 배양을 통한 세포외기질 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 체외에서 인간 세포를 무혈청배지에서 배양하여 수득한 배양액으로부터 섬유형성능 및 젤화능을 가지는 세포외기질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포외기질을 포함하는 조성물의 제조방법은 비용이 절감된 배양 공정으로 고농도의 세포외기질을 제조할 수 있어, 세포외기질 조성물을 합리적인 가격에 제공할 수 있다. 본 발명의 상기 세포외기질은 인체 세포 유래의 세포외기질로, 우태아 혈청 등 동물 유래 산물을 사용하지 않으므로 향후 세포치료제, 창상치료용 조성물 등 조직치료를 위한 보조수단 및 기능성 화장품 원료 등의 개발에 안전하고 유용하게 사용될 수 있으며, 3D 오가노이드 제작 시 세포부착기질 또는 세포 배양 접시 코팅에 사용될 수 있다.

Description

세포 배양을 통한 세포외기질 제조방법 및 제조된 세포외기질의 용도 {Method for preparing extracellular matrix using cell culture and Use of the same}

본 출원은 2021년 10월 8일 대한민국 특허청에 제출된 특허출원 제10-2021-0133955호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 세포 배양을 통한 세포외기질 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 체외에서 인간 세포를 무혈청배지에서 배양하여 수득한 배양액으로부터 섬유형성능 및 젤화능을 가지는 세포외기질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

1975년 하워드 그린 박사가 각질형성세포를 배양하여 상피 피부 조직 유사체를 만드는 기술을 개발하였다. 이 기술은 지금까지 국내뿐 아니라 전 세계 피부 관련 세포치료제 개발의 기반이 되어 화상이나 당뇨성 족부궤양 적응증에 대해 이용되고 있다. 재생 의학 및 조직공학의 꾸준한 발전으로, 조직의 재생에 정상세포를 활용하고자 하는 바람은 인간의 장기를 모사한 다양한 3차원 장기 유사체인 ‘오가노이드(Organoid)’ 배양의 발전으로 이어졌다. 제조된 오가노이드는 약물 스크리닝, 3D 프린터용 바이오 잉크뿐 아니라 뇌 질환과 같이 기존에 제작하기 어려웠던 질병 모델의 개발 등 생물학 연구의 플랫폼으로서 다양한 잠재력과 응용 가능성을 가진다.

이러한 인간세포의 생체 외 3차원 배양에 가장 필수적인 요소는 바로 세포외기질이다. 세포외기질이란, 세포가 생체 내에서 네트워크와 조직을 형성하는 과정에서 필요한 생체고분자로, 세포외기질은 세포의 증식, 성장, 이동, 분화 등 항상성에 관여하여 생리학적 또는 조직 치유 같은 병리학적 메커니즘에 관여한다고 알려져 있다. 이러한 이유로, 조직 재생 연구에 있어서 세포외기질은 배아 줄기 세포나 성체 줄기 세포, 체세포와 접목된 세포치료나 재생의학 분야에서 더욱 그 중요성이 강조된다.

현재 세포외기질의 주성분을 활용하여 세포배양 관련 연구에 널리 사용되고 있는 세포 배양용 지지체는 매트리젤 (Matrigel, BD Bioscience사의 제품명)이며, 4형 콜라겐과 라미닌을 풍부하게 함유하는 세포외기질 조성물이다. 매트리젤을 이루고 있는 세포외기질은 조직과 유사한 복잡한 세포외 환경을 제공함으로써 세포배양을 위한 매우 유용한 세포외기질로 이용되고 있다. 하지만 이는 쥐 육종에서 유래한 이종성(xenogenic) 세포외기질로, 인간 유래의 기질과 동일하다고 할 수 없어 약물 스크리닝 신뢰도에 한계를 가지며, 이종 유래 감염원의 전이나 면역 거부 반응 등의 위험성 때문에 인체 이식용 등의 생체재료 뿐만 아니라 이를 활용한 조직공학제 또는 오가노이드도 치료제로 사용하기 힘들다. 또한 동물 복지에도 위배되며 단가가 높다는 문제점도 가지고 있다. 따라서 종래 재료의 부족함을 극복할 수 있는 경제적이고 효과적이며 임상적 규제를 만족할 수 있는 새로운 재료가 요구되고 있는 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2019-0092921호 (2019.08.08. 공개)

본 발명자들은 상기와 같은 종래 세포외기질의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 무혈청 세포배양을 통해 인간 세포외기질을 포함하는 세포 배양액을 제조하고, 세포 배양액을 화학적 처리 후 농축 공정을 통해 섬유형성능 및 젤화능을 가지게 된다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포외기질을 포함하는 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 세포외 기질을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포외기질을 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다:

(a) 세포외기질을 포함하는 배양액을 pH 8 내지 12으로 조절하는 단계;

(b) 상기 배양액을 여과하는 단계;

(c) 상기 배양액을 pH 2 내지 7.9로 조절하는 단계; 및

(d) 상기 배양액을 농축시키는 단계.

단계 (a): 세포외기질을 포함하는 배양액을 pH 8 내지 12으로 조절하는 단계

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포외기질은 라미닌, 제4형 콜라겐, 제1형 콜라겐, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 및 황산 헤파란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포외기질을 포함하는 배양액은 결합조직세포, 상피조직세포, 또는 이들의 조합을 배양하여 수득된 것이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 세포외기질을 포함하는 배양액은 결합조직세포 및 상피조직세포를 배양하여 수득된 것이다.

본 발명의 상기 결합조직세포는 섬유아세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 인대세포, 건세포 및 중간엽줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 상피조직세포는 각질형성세포, 혈관내피세포, 장상피세포, 각막상피세포 및 간세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 세포는 인간 유래 세포이다.

본 발명의 상기 세포는 정상세포 또는 유전자 변형된 세포이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배양액은 Dulbecco’s Modified Eagle’s Media (DMEM), F-12, DMEM/F-12, Iscove’s Modified Dulbecco’s Media(IMDM), Fischer’ Medium, Minimum Essential Media Eagle (MEM), MEM alpha MEM, RPMI 1640, Williams’ Medium, Media 199(M199)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포의 배양은 항산화제를 포함하는 배양액에 의해 수행되는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항산화제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 셀레늄, 코엔자임큐10, 카테닌, N-Acetylcysteine(NAC), 글루타치온, 베타카로틴, 라이코펜, 루테인, 폴리페놀, 시스테인 및 타우린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 항산화제이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포의 배양은 동물 유래 산물을 1 중량% 미만으로 포함하는 배양액에 의해 수행되는 것이다.

본 발명의 상기 "동물 유래 산물을 1 중량% 미만으로 포함하는 배양액"은 "동물 유래 산물이 없는", 또는 "실질적으로 동물 유래 산물이 없는" 것을 의미한다. 상기 각각 "동물 유래 산물이 없는", 또는 "실질적으로 동물 유래 산물이 없는"은 "동물 단백질이 없는" 또는 "실질적으로 동물 단백질이 없는"의 의미를 포함하며, 혈액 유래, 혈액 풀드(blood pooled) 및 다른 동물 유래 산물들 또는 화합 물들이 없거나 실질적으로 없다는 것을 의미한다. "동물"은 사람을 제외한 포유류, 조류, 파충류, 어류, 곤충, 거미 또는 다른 동물종들을 의미한다. "동물"은 박테리아 및 세포와 같은 미생물은 포함하지 않는다. 예를 들어, 동물 유래 산물이 없는 방법 또는 실질적으로 동물 유래 산물이 없는 방법은, 면역글로불린, 고기 소화물, 고기 부산물 및 젖 또는 낙농 산물 또는 소화물과 같은 동물 유래 단백질이 실질적으로 없거나 본질적으로 없거나 완전히 없는 방법을 의미한다. 따라서, 동물 유래 산물이 없는 방법의 예로는 고기 및 낙농 산물 또는 고기 또는 낙농 부산물을 배제한 방법(박테리아 또는 세포의 배양 또는 박테리아 발효 방법과 같은)이 있다. 상기 "완전히 없는"은 사용되는 장비 또는 방법의 검출 범위 내에서, 물질이 검출될 수 없거나, 그 존재가 확인될 수 없다는 것을 의미한다. "본질적으로 없는"은 단지 흔적량의 물질이 검출될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포의 배양은 저산소 배양, 회분식 배양, 유가식 배양, 및 연속식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 배양법으로 수행되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 저산소 배양은 산소 분압이 1% 내지 10%인 저산소 조건에서 배양하는 것이다. 보다 구체적으로 상기 저산소 배양은 산소 분압이 1% 내지 10%, 1% 내지 8%, 1% 내지 6%, 1% 내지 5%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2%, 2% 내지 10%, 2% 내지 8%, 2% 내지 6%, 2% 내지 5%, 2% 내지 4%, 2% 내지 3%, 3% 내지 10%, 3% 내지 8%, 3% 내지 6%, 3% 내지 5%, 3% 내지 4%, 5% 내지 10%, 5% 내지 8%, 5% 내지 6%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 회분식 배양은 세포배양 시 배양액의 교체 없이 7일 내지 13일간 배양하는 것이다.

본 발명의 상기 유가식 배양은 세포배양 시 배양액의 교체 없이 배양액을 매일 10% 내지 30%씩 추가하여 7일 내지 13일간 배양하는 것이다.

본 발명의 상기 연속식 배양은 세포배양 시 배양액의 25% 내지 75%를 2∼3일 간격으로 교체하여 13일간 배양하는 것이다.

본 발명의 (a) 단계는 세포외기질을 포함하는 배양액을 pH 8 내지 12로 조절한다.

상기 pH는 보다 구체적으로 8 내지 12, 8.5 내지 12, 9 내지 12, 9.5 내지 12, 10 내지 12, 10.5 내지 12, 11 내지 12, 8 내지 11.5, 8.5 내지 11.5, 9 내지 11.5, 9.5 내지 11.5, 10 내지 11.5, 10.5 내지 11.5, 11 내지 11.5, 8 내지 11, 8.5 내지 11, 9 내지 11, 9.5 내지 11, 10 내지 11, 또는 10.5 내지 11 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 배양액은 세포를 상술한 배양액 내에서 배양한 조건배지이다.

본 발명의 상기 배양액의 pH 조절은 1 내지 25℃, 보다 구체적으로는 1 내지 25℃, 1 내지 20℃, 1 내지 15℃, 1 내지 10℃, 1 내지 8℃, 1 내지 6℃, 1 내지 5℃, 1 내지 4℃, 1 내지 3℃, 2 내지 25℃, 2 내지 20℃, 2 내지 15℃, 2 내지 10℃, 2 내지 8℃, 2 내지 6℃, 2 내지 5℃, 2 내지 4℃, 2 내지 3℃, 3 내지 25℃, 3 내지 20℃, 3 내지 15℃, 3 내지 10℃, 3 내지 8℃, 3 내지 6℃, 3 내지 5℃, 3 내지 4℃, 4 내지 25℃, 4 내지 20℃, 4 내지 15℃, 4 내지 10℃, 4 내지 8℃, 4 내지 6℃, 4 내지 5℃에서 냉각한 후에 수행된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 pH를 8 내지 12로 조절하는 것은 수산화나트륨, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼슘, 침강탄산칼슘, 염화칼슘, 산화칼슘, 구연산칼슘, 산화마그네슘, 탄산마그네슘 및 황산칼륨으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 염기를 첨가하여 수행되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 (b): 상기 배양액을 여과하는 단계

단계 (b)는 상기 (a) 단계에서 pH를 8 내지 12로 조절한 배양액을 여과하는 단계이다.

상기 여과는 상기 배양액을 원심분리 후 침전물을 제거함으로써 수행될 수 있다. 상기 원심분리는 100 내지 5000 g의 범위로 이루어지나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 여과는 상기 배양액을 0.1 마이크론 내지 1.2 마이크론의 공극을 지니는 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 보다 구체적으로는 0.2 마이크론 또는 0.45 마이크론의 공극을 지닌 필터를 사용하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 여과는 생성된 부유물을 상술한 원심분리 후 침전물 제거, 및 필터 여과를 하여 수행될 수 있다.

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단계 (c): 상기 배양액을 pH 2 내지 7.9로 조절하는 단계;

단계 (c)는 상기 (b) 단계에서 여과한 배양액의 pH를 다시 2 내지 7.9로 조절하는 단계이다. 보다 구체적으로는 상기 (b) 단계에서 여과한 배양액의 pH를 2 내지 7.9, 2.5 내지 7.9, 3 내지 7.9, 4 내지 7.9, 4.5 내지 7.9, 5 내지 7.9, 5.5 내지 7.9, 6 내지 7.9, 6.5 내지 7.9, 7 내지 7.9, 또는 7.5 내지 7.9로 조절한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 pH를 2 내지 7.9로 조절하는 것은 염화수소, 아세트산, 질산, 및 황산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 산을 첨가하여 수행되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 배양액의 pH 조절은 1 내지 25℃, 보다 구체적으로는 1 내지 25℃, 1 내지 20℃, 1 내지 15℃, 1 내지 10℃, 1 내지 8℃, 1 내지 6℃, 1 내지 5℃, 1 내지 4℃, 1 내지 3℃, 2 내지 25℃, 2 내지 20℃, 2 내지 15℃, 2 내지 10℃, 2 내지 8℃, 2 내지 6℃, 2 내지 5℃, 2 내지 4℃, 2 내지 3℃, 3 내지 25℃, 3 내지 20℃, 3 내지 15℃, 3 내지 10℃, 3 내지 8℃, 3 내지 6℃, 3 내지 5℃, 3 내지 4℃, 4 내지 25℃, 4 내지 20℃, 4 내지 15℃, 4 내지 10℃, 4 내지 8℃, 4 내지 6℃, 4 내지 5℃에서 수행될 수 있다.

단계 (d): 상기 배양액을 농축시키는 단계.

단계 (d)는 상기 (c) 단계에서 pH를 2 내지 7.9로 조절한 배양액을 농축시키는 단계이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 농축은 분자량 차단 규격(molecular weight cut-off, MWCO)이 50 내지 100 kDa인 여과막을 이용하여 이루어진다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 여과막에 사용되는 버터는 DMEM, F-12, DMEM/F-12, IMDM, Fischer’ Medium, MEM, MEM alpha MEM, RPMI 1640, Williams’ Medium, 및 M199으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 여과막에 사용되는 버퍼는 상기 농축의 대상이 되는 세포 배양액과 동일한 종류의 배양액이다. 예를 들어, 상기 세포 배양에 DMEM/F12 배지를 사용한 경우, 여과막 농축에 사용되는 버퍼도 DMEM/F12이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 농축은 20 내지 100배, 30 내지 100배, 40 내지 100배, 50 내지 100배, 60 내지 100배, 70 내지 100배, 80 내지 100배로 농축될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 농축을 수행함에 따라 배양액이 젤화가 가능한 배율로 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 세포외기질을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포외기질을 포함하는 조성물은 세포, 조직, 또는 오가노이드 배양용 조성물, 화장품 원료, 창상 치료용 약제학적 조성물, 조직수복용 생체소재로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포외기질을 포함하는 조성물은 하이드로겔이 되는 것이다. 상기 본 발명의 세포외기질을 포함하는 조성물이 하이드로겔 형태를 가지는 점은 본원 조성물의 젤화능 및 섬유형성능으로부터 기인한다. 또한, 상기 조성물의 하이드로겔 형태의 특성은 생리학적 환경에서 나타난다. 상기 생리학적 환경은 중성 pH(약 pH 7, 예컨대 pH 6 내지 8, 보다 구체적으로는 pH 6.5 내지 7.5), 등삼투압 조건, 또는 이들의 조합을 의미한다.

상기 생리학적 환경은 추가적으로 22℃ 내지 39℃, 23℃ 내지 39℃, 24℃ 내지 39℃, 25℃내지 39℃, 30℃ 내지 39℃, 31℃ 내지 39℃, 32℃ 내지 39℃, 33℃ 내지 39℃, 34℃ 내지 39℃, 35℃ 내지 39℃, 36℃ 내지 39℃, 36.5℃ 내지 39℃, 37℃ 내지 39℃, 35℃, 36℃, 36.5℃, 37℃, 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 또는 39℃의 온도 조건을 더 포함하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물에서 젤화능에 기여하는 주요 성분은 콜라겐 및 라미닌이며, 상기 세포외기질을 포함하는 조성물의 온도가 22℃ 이하인 경우에는 젤화가 관찰되지 않는다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명은 세포외기질을 포함하는 조성물을 포함하는 세포지지체를 제공한다. 상기 세포지지체는 2차원 또는 3차원 세포배양지지체이다.

본 발명에 따른 세포외기질을 포함하는 조성물의 제조방법은 비용이 절감된 배양 공정으로 고농도의 세포외기질을 제조할 수 있어, 세포외기질 조성물을 합리적인 가격에 제공할 수 있다. 본 발명의 상기 세포외기질은 인체 세포 유래의 세포외기질로, 우태아 혈청 등 동물 유래 산물을 사용하지 않으므로 향후 세포치료제, 창상치료용 조성물 등 조직치료를 위한 보조수단 및 기능성 화장품 원료 등의 개발에 안전하고 유용하게 사용될 수 있으며, 3D 오가노이드 제작 시 세포부착기질 또는 세포 배양 접시 코팅에 사용될 수 있다.

도 1은 세포배양 유래 세포외기질 조성물 제조 순서도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 단독배양 또는 공동배양된 세포의 배양배지 내 총 콜라겐 생성량을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. (*p < 0.05)
도 3은 공동배양 시 배양배지로 분비 또는 배양 접시에 침착된 4형 콜라겐의 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. (*p < 0.05)
도 4는 공동배양 시 배양배지로 분비 또는 배양 접시에 침착된 라미닌의 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. (*p < 0.05)
도 5는 공동배양된 세포에 항산화제 N-Acetylcysteine(NAC)을 투여 후 배양배지 내 총 콜라겐의 생성량을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. (*p < 0.05)
도 6은 공동배양된 세포에 항산화제 vitamin C 를 투여 후 배양배지로 분비된 4형 콜라겐의 생성량을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 저산소 조건에서 공동배양된 세포의 배양 배지 내 라미닌과 4형 콜라겐의 생성량을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. (*p < 0.05)
도 8은 회분식배양 방법으로 공동배양된 세포의 배양 배지 내 라미닌과 4형 콜라겐의 생성량을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. (*p < 0.05)
도 9는 유가식배양 방법으로 공동배양된 세포의 배양 배지 내 라미닌 생성량을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. (*p < 0.05)
도 10은 연속식배양 방법으로 공동배양된 세포의 배양 배지 내 라미닌 생성량을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. (*p < 0.05)
도 11은 본 발명의 실시예에 따라 pH 11 조절 단계 및 pH 6 조절 단계를 거친 배양배지 농축액의 섬유형성 및 젤화를 현미경으로 관찰 한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시예의 pH 8 내지 12 조절 단계 및 pH 2 내지 7.9 조절 단계를 거친 배양배지 농축액의 섬유형성 및 젤화를 현미경으로 관찰한 결과이다.

<실시예 1: 인간 세포의 배양>

실시예 1.1 - 인간 섬유아세포의 배양

동결된 인간 진피 섬유아세포를 해동하여 150 cm²배양접시 한 개당 3 Х 10⁵개의 세포수가 되도록 접종하였다. 10% 우태아혈청과 1% 페니실린이 포함된 High glucose Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)을 이용하였으며, 2∼3일 간격으로 배지를 교체해주고, 7일 동안 섬유아세포가 배양 용기에서 100%가 되도록 배양하였다.

실시예 1.2 - 인간 피부각질형성세포 배양

동결된 인간 피부각질형성세포를 해동하여 175 cm²접시 한 개당 1.5 Х 10⁶개의 세포수가 되도록 접종하였다. 2.5 μg human recombinant EGF, 25 mg bovine pituitary extract를 포함한 Keratinocyte serum-free medium(KSFM; 각질형성세포 무혈청 배양배지)을 이용하였으며, 2∼3일 간격으로 배지를 교체 해주고, 배양 용기에서 100%가 되도록 7일 동안 배양하였다

실시예 1.3 - 인간 섬유아세포/피부각질형성세포 공동배양

실시예 1.2에서 7일동안 배양된 인간 피부각질형성세포의 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척 후 아큐테이즈 3 ㎖를 첨가한 후, 37℃ 인큐베이터에서 10분 동안 화학적인 반응을 주어 피부각질세포를 부유 하였다. 아큐테이즈 용액에 40 ㎖의 PBS를 첨가하여 800 rpm, 25℃에서 5분간 원심분리 한 후, 상등액을 제거 하였다. 피부각질세포 침전물에 5% 우태아혈청이 포함된 FAD 배지(DMEM/F12(1:1)+Glutamax-I, 1 % 페니실린, 2 mM L-glutamine, 10 mg/L insulin, 5.5 mg/L transferrin, 5 μg/L selenite, 50 μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 1 μM hydrocortisone, 0.02 nM triiodothyronie(T3), 10 μg/L epidermal growth factor(EGF), 1 μM isoproterenol)를 첨가한다. 실시예 1.1 에서의 7일간 배양된 인간 진피 섬유아세포의 배양액을 제거 후 위 피부각질세포를 배양 접시 한 개당 1∼2 Х 10⁶개의 세포 수가 되도록 분주하여 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다.

실시예 1.4 - 인간 섬유아세포/피부각질형성세포 xeno-free 공동배양

실시예 1.3에서 24시간동안 배양된 인간 섬유아세포/피부각질형성세포 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한다. 무혈청 FAD 배지(DMEM/F12(1:1)+Glutamax-I, 1 % 페니실린, 2 mM L-glutamine, 10 mg/L insulin, 5.5 mg/L transferrin, 5 μg/L selenite, 50 μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 1 μM hydrocortisone, 0.02 nM triiodothyronie(T3), 10 μg/L epidermal growth factor(EGF), 1 μM isoproterenol) 35 ㎖ 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 총 13일간 세포를 배양하여 2∼3일 간격으로 배양액을 교체하면서 기존에 배양한 배양액을 회수하여 냉장보관 하였다.

도2는 위 실시예에 따라 단독배양 또는 공동배양된 세포에서 생성되어 배양배지로 분비된 총 콜라겐의 함량을 분석한 결과이다. 섬유아세포의 단독배양 시 26∼31 μg/㎖ 의 콜라겐이 생성되었으며, 섬유아세포와 상피세포 공동배양 시, 단독배양 시 생성된 콜라겐의 약 2.7 ∼4 배인 71∼124 μg/㎖ 의 콜라겐이 생성되었다.

도 3은 공동배양 시 배양배지로 분비 또는 배양 접시에 침착된 4형 콜라겐의 함량을, 도 4는 라미닌의 함량을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 침착된 4형 콜라겐의 약 67.4배의 4형콜라겐이 배양배지로 분비되었으며, 라미닌은 침착된 함량의 약 6.18배가 배양배지로 분비되었다.

<실시예 2: 항산화제를 이용한 세포외기질 생성 촉진 효과 확인>

실시예 2.1 - N-acetyl cysteine(NAC)의 투여

실시예 1.3에서 24시간동안 배양된 인간 섬유아세포/피부각질형성세포 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한다. 무혈청 FAD 배지(DMEM/F12(1:1)+Glutamax-I, 1 % 페니실린, 2 mM L-glutamine, 10 mg/L insulin, 5.5 mg/L transferrin, 5 μg/L selenite, 50 μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 1 μM hydrocortisone, 0.02 nM triiodothyronie(T3), 10 μg/L epidermal growth factor(EGF), 1 μM isoproterenol) 35 ㎖에 N-acetyl cysteine(NAC)을 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 5 mM 농도로 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 총 13일간 세포를 배양하여 2~3일 간격으로 배양액을 교체하면서 기존에 배양하고 있는 배양액을 회수하였다.

도5는 위 실시예에 따라 공동배양된 세포에 NAC을 투여 후 생성된 총 콜라겐의 함량을 분석한 결과이다. NAC을 투여하지않은 대조군에서는 77.1∼99.5 μg/㎖ 의 콜라겐이 생성되었으며, 0.1 mM의 NAC을 투여한 실험군에서는 122.1∼137.5 μg/㎖, 0.5 mM 의 NAC을 투여한 실험군에서는 112.7∼130.9 μg/㎖ 의 콜라겐이 생성되었다. 1 mM 이상 농도의 NAC 투여 시 콜라겐의 생성량이 저하되었으며, 세포독성이 관찰되었다.

실시예 2.2 - Vitamin C의 투여

실시예 1.3에서 24시간동안 배양된 인간 섬유아세포/피부각질형성세포 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한다. 무혈청 FAD 배지(DMEM/F12(1:1)+Glutamax-I, 1 % 페니실린, 2 mM L-glutamine, 10 mg/L insulin, 5.5 mg/L transferrin, 5 μg/L selenite, 50 μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 1 μM hydrocortisone, 0.02 nM triiodothyronie(T3), 10 μg/L epidermal growth factor(EGF), 1 μM isoproterenol) 35 ㎖ 에 Vitamin C 를 50 μM, 100 μM, 200 μM 농도로 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 총 13일간 세포를 배양하여 2∼3일 간격으로 배양액을 교체하면서 기존에 배양하고 있는 배양액을 회수하였다.

도 6은 위 실시예에 따라 공동배양된 세포에 vitamin C를 투여 후 생성된 4형 콜라겐의 함량을 분석한 결과이다. 50 μM의 vitamin C를 투여한 대조군 에서는 4.17 μg/㎖ 의 4형 콜라겐이 생성되었으며, 100 μM의 vitamin C를 투여한 실험군에서는 5.6 μg/㎖ , 200 μM 의 vitamin C를 투여한 실험군에서는 5.69 μg/㎖ 의 4형 콜라겐이 생성되었다.

<실시예 3: 세포외기질 제조 단가 절감을 위한 xeno-free 공동배양 공정 개선>

실시예 3.1 - 저산소 배양

실시예 1.3에서 24시간동안 배양된 인간 섬유아세포/피부각질형성세포 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한다. 무혈청 FAD 배지(DMEM/F12(1:1)+Glutamax-I, 1 % 페니실린, 2 mM L-glutamine, 10 mg/L insulin, 5.5 mg/L transferrin, 5 μg/L selenite, 50 μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 1 μM hydrocortisone, 0.02 nM triiodothyronie(T3), 10 μg/L epidermal growth factor(EGF), 1 μM isoproterenol) 35 ㎖ 에 37℃ 인큐베이터, 저산소(5% 산소)조건에서 총 13일간 세포를 배양하여 2∼3일 간격으로 배양액을 교체하면서 기존에 배양하고 있는 배양액을 회수하였다.

도 7은 위 실시예에 따라 ‘총 13일간 세포를 대기산소농도(21%) 조건에서 배양하여 2∼3일 간격으로 배양액을 교체한 실험’(대조군)과 비교 분석한 결과이다. 대조군 에서는 0.69 μg/㎖ 의 라미닌과 4.17 μg/㎖ 의 4형 콜라겐이 생성되었으며, ‘저산소(5% 산소)에서 총 13일간 세포를 배양하여 배양액을 2~3일 간격으로 교체한 실험군’(저산소)에서는 대조군의 약 1.5 배인 1.0 μg/㎖ 의 라미닌과 약 2.4 배 인 10.0 μg/㎖ 의 4형 콜라겐이 생성되었다.

실시예 3.2 - 회분식 배양

실시예 1.3에서 24시간동안 배양된 인간 섬유아세포/피부각질형성세포 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한다. 무혈청 FAD 배지(DMEM/F12(1:1)+Glutamax-I, 1 % 페니실린, 2 mM L-glutamine, 10 mg/L insulin, 5.5 mg/L transferrin, 5 μg/L selenite, 50 μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 1 μM hydrocortisone, 0.02 nM triiodothyronie(T3), 10 μg/L epidermal growth factor(EGF), 1 μM isoproterenol) 35 ㎖을 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 총 13일간 배양액 교체 없이 세포를 배양한 후 배양액을 회수하여 냉장 보관하였다.

도8은 위 실시예에 따라 ‘총 13일간 세포를 배양하여 2∼3일 간격으로 배양액을 교체한 실험’(대조군)과 비교 분석한 결과이다. 대조군 에서는 0.69 μg/㎖ 의 라미닌과 4.17 μg/㎖ 의 4형 콜라겐이 생성되었으며, ‘총 13일간 배양액 교체 없이 세포를 배양한 실험군‘(회분식) 에서는 대조군의 약 3.0 배인 2.1 μg/㎖ 의 라미닌과 약 2.6 배인 10.9 μg/㎖ 의 4형 콜라겐이 생성되었다.

실시예 3.3 - 유가식 배양

실시예 1.3에서 24시간동안 배양된 인간 섬유아세포/피부각질형성세포 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한다. 무혈청 FAD 배지(DMEM/F12(1:1)+Glutamax-I, 1 % 페니실린, 2 mM L-glutamine, 10 mg/L insulin, 5.5 mg/L transferrin, 5 μg/L selenite, 50 μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 1 μM hydrocortisone, 0.02 nM triiodothyronie(T3), 10 μg/L epidermal growth factor(EGF), 1 μM isoproterenol) 20㎖을 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 1일 간격으로 배양액을 10% 첨가(2 ㎖/일)하여 총 8일간 배양한 후 배양액을 회수하여 냉장 보관하였다.

도 9는 위 실시예에 따라 ‘총 13일간 세포를 배양하여 2∼3일 간격으로 배양액을 교체한 실험’(대조군)과 비교 분석한 결과이다. 대조군 에서는 0.69 μg/㎖ 의 라미닌이 생성되었으며, ‘총 8일간 배양하여 1일 간격으로 배양액을 10% (2㎖/일)씩 추가한 실험군’(유가식) 에서는 대조군의 약 3.1 배인 2.12 μg/㎖ 의 라미닌이 생성되었다.

실시예 3.4 - 연속식 배양

실시예 1.3에서 24시간동안 배양된 인간 섬유아세포/피부각질형성세포 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한다. 무혈청 FAD 배지(DMEM/F12(1:1)+Glutamax-I, 1 % 페니실린, 2 mM L-glutamine, 10 mg/L insulin, 5.5 mg/L transferrin, 5 μg/L selenite, 50 μM L-ascorbic acid 2-phosphate, 1 μM hydrocortisone, 0.02 nM triiodothyronie(T3), 10 μg/L epidermal growth factor(EGF), 1 μM isoproterenol) 35 ㎖을 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 총 13일간 세포를 배양하여 2∼3일 간격으로 배양액 일부(50%)를 교체하고 회수된 배양액은 냉장 보관하였다.

도 10은 위 실시예에 따라 ‘총 13일간 세포를 배양하여 2∼3일 간격으로 배양액을 전체 교체한 실험’(대조군)과 비교 분석한 결과이다. 대조군 에서는 0.69 μg/㎖ 의 라미닌이 생성되었으며, ‘총 13일간 배양하여 2∼3일 간격으로 배양액 일부(50%)를 교체한 실험군’(연속식) 에서는 대조군의 약 1.4 배인 0.96 μg/㎖ 의 라미닌이 생성되었다.

<실시예 4: 섬유형성능 및 젤화능을 갖는 배양액 및 그 농축액의 제조 방법>

실시예 4.1 - 배양액의 화학적 처리

실시예에 따라 수득된 배양액을 4℃에서 보관하여 냉각한 뒤 냉각된 배양액을 1 M 수산화나트륨을 이용하여 pH 8 내지 12로 알카리화하여 24시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 생성된 부유물을 원심분리 및 여과하여 제거한 뒤 1 M 염화수소를 이용하여 pH 2 내지 7.9 로 조절한 뒤 2시간 이상 4℃에서 반응시켰다.

실시예 4.1.A

보다 구체적으로, 본 발명자들은 화학적 처리 방법으로서 상기 알카리화 단계에서는 pH 11 에서 24시간 동안 4℃에서 반응시켰고, 부유물 제거 후 pH를 6으로 조절한 뒤 2시간 이상 4℃에서 반응시켰다. 대조군으로는 화학적 처리를 하지 않고, 4℃에서 보관한 배양액을 사용하였다.

실시예 4.1.B

또한, 본 발명자들은 화학적 처리 방법에 있어서, 상기 pH 8 내지 12 범위의 알카리 조건 처리, 및 pH 2 내지 7.9 조건 범위 하에서 처리시 섬유형성능 및 젤화능을 가짐을 확인하기 위하여, pH 8 또는 12의 알카리 조건에서 처리한 다음, 부유물을 제거하고 pH 2 또는 7.9 조건 하에서 2시간 이상 4℃에서 반응시켰다.

상기 실시예 4.1.A 또는 실시예 4.1.B의 화학적 처리에 따른 배양액의 섬유형성능 및 젤화능은 하기 실시예 4.2에서 배양액을 농축하여 확인하였다.

실시예 4.2 - 버퍼교환 및 농축

실시예 4.1에 따라 제조한 배양액을 50 내지 100 kDa의 분자량 차단(MWCO) 규격의 공극을 가진 재생셀룰로오스 재질의 여과막을 이용하여 4℃에서 DMEM/F12 기본배지로 버퍼교환 및 50배 농축하였다.

도 11은 세포배양액을 실시예 4.1.A에 따라 전처리 또는 전처리하지 않은 세포배양액을 37℃ 인큐베이터에서 젤화 후, 저배율 현미경으로 비교, 관찰한 결과이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 화학적 전처리를 거치지 않은 세포배양액 농축액에서는 세포외기질 섬유가 관찰되지 않았지만, 실시예 4.1.A의 화학적 처리공정을 거친 세포배양액 농축액은 다량의 세포외기질 섬유가 생성되어 거시적인 젤화가 진행되었다.

도 12는 세포배양액을 실시예 4.1.B에 따라 전처리한 세포배양액 농축액을 37℃ 인큐베이터에서 젤화 후, 저배율 현미경으로 비교, 관찰한 결과이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 알카리화 단계에서 pH를 8 또는 12로 처리한 후, pH를 다시 2 또는 7.9로 조절하여 처리한 후의 네 가지 경우의 배양액 농축액에서 모두 세포외 기질 섬유 및 젤화되는 것이 관찰되었다.

<실시예 5: 배양액 내 세포외기질 성분 함량 분석>

실시예 5.1 - Human collagen 함량 분석

실시예에 따라 수득된 배양액 내 존재하는 세포외기질 중 human collagen 함량을 측정하기 위해 상업적으로 구입 가능한 시리우스레드 키트(Chondrex 사, #9062)을 활용하여 정량분석 하였다. 분석 방법은 제품의 매뉴얼에 따랐다. 구체적으로는 배양액에 시리우스레드 용액을 첨가하여 반응시킨 후, 침전된 콜라겐을 산성용액에 혼합하여 530 nm에서 흡광도를 측정하여 정량분석 하였다.

실시예 5.2 - Human type IV collagen 함량 분석

실시예에 따라 수득된 배양액 내 존재하는 세포외기질 중 인간 4형 콜라겐 성분의 양을 측정하기 위해 상업적으로 구입이 가능한 분석키트 (Aviva Systems Biology 사, OKCD06075)를 이용하여 정량분석 하였다. 분석 방법은 제품의 매뉴얼에 따랐다. 구체적으로는 인간 4형 콜라겐 항체가 코팅된 96-웰플레이트에 배양액을 첨가하여 반응시킨 후 잔여물을 세척하였고 발색효소가 결합된 특이적 항체를 첨가하여 반응시킨 후 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량분석 하였다.

실시예 5.3 - Human laminin 함량 분석

실시예에 따라 수득된 배양액 내 존재하는 세포외기질 중 인간 라미닌 성분의 양을 측정하기 위해 상업적으로 구입이 가능한 분석키트 (TaKaRa 사, MK107)를 이용하여 정량분석 하였다. 분석 방법은 제품의 매뉴얼에 따랐다. 구체적으로는 인간 라미닌의 항체가 코팅된 96-웰플레이트에 배양액을 첨가하여 반응시킨 후 잔여물을 세척하였고 발색효소가 결합된 특이적 항체를 첨가하여 반응시킨 후 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량분석 하였다.

상기 실시예 5에 따른 인간 콜라겐, 인간 제4형 콜라겐, 및 인간 라미닌의 함량 분석 결과는 도 2 내지 도 10에 나타내었다.

Claims

다음 단계를 포함하는 세포외기질을 포함하는 조성물의 제조방법:
(a) 세포외기질을 포함하는 배양액을 pH 8 내지 12으로 조절하는 단계;
(b) 상기 배양액을 여과하는 단계;
(c) 상기 배양액을 pH 2 내지 7.9로 조절하는 단계; 및
(d) 상기 배양액을 농축시키는 단계.
제1항에 있어서, 상기 세포외기질은 라미닌, 제4형 콜라겐, 제1형 콜라겐, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 및 황산 헤파란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 세포외기질을 포함하는 배양액은 결합조직세포, 상피조직세포, 또는 이들의 조합을 배양하여 수득된 것인, 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 결합조직세포는 섬유아세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 인대세포, 건세포 및 중간엽줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 상피조직세포는 각질형성세포, 혈관내피세포, 장상피세포, 각막상피세포 및 간세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 세포는 인간 유래 세포인, 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 세포의 배양은 항산화제를 포함하는 배양액에 의해 수행되는 것인, 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 항산화제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 셀레늄, 코엔자임큐10, 카테닌, N-Acetylcysteine(NAC), 글루타치온, 베타카로틴, 라이코펜, 루테인, 폴리페놀, 시스테인 및 타우린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 항산화제인, 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 세포의 배양은 동물 유래 산물을 1 중량% 미만으로 포함하는 배양액에 의해 수행되는 것인, 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 세포의 배양은 저산소 배양, 회분식 배양, 유가식 배양, 및 연속식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 배양법으로 수행되는 것인, 제조방법.
제10항에 있어서, 저산소 배양은 산소 분압이 1% 내지 10%인 저산소 조건에서 배양하는 것인, 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 회분식 배양은 세포배양 시 배양액의 교체 없이 7일 내지 13일간 배양하는 것인, 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 유가식 배양은 세포배양 시 배양액의 교체 없이 배양액을 매일 10% 내지 30%씩 추가하여 7일 내지 13일간 배양하는 것인, 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 연속식배양은 세포배양 시 배양액의 25% 내지 75%를 2∼3일 간격으로 교체하여 13일간 배양하는 것인, 제조방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 세포외기질을 포함하는 조성물.
제15항의 조성물은 하이드로겔이 되는 특성을 지닌, 조성물.
제15항의 조성물을 포함하는 세포지지체.