CN109112101B - 一种成纤维细胞培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种细胞培养基，该细胞培养基包含基础培养基和血小板裂解物，优选地，还包含谷氨酸和/或脯氨酸。本申请还提供了利用上述细胞培养基培养成纤维细胞的方法以及培养得到的成纤维细胞在作为用于美容或组织修复的原料中的用途。

Description

一种成纤维细胞培养基及其应用
技术领域
本申请属于细胞培养领域。具体而言，本申请涉及一种成纤维细胞培养基及其应用。
背景技术
成纤维细胞作为人体最大器官皮肤真皮织网的主要细胞，它能合成和分泌大量的胶原蛋白以及少量的弹性蛋白，于细胞外聚合成为粗大的胶原纤维束和细小的弹性纤维束。胶原纤维是成纤维细胞合成和分泌的主要结构蛋白，在真皮中聚集成与皮面平行的、粗大且相互交织成网的纤维束，具有高度机械稳定性，是维持皮肤张力和承受拉力的重要成分，也是维持皮肤饱满充盈的物质基础。
自体成纤维细胞除皱术已经成为美容领域重要的技术措施。该技术是首先大量扩增自体成纤维细胞数量，然后将扩增后的自体成纤维细胞注入到真皮层，使真皮层的密度和厚度增加，扩增的自体成纤维细胞回到母体后，会根据母体环境继续分泌大量的胶原纤维和弹性纤维，激活沉睡细胞，替换衰老细胞，从而达到除皱的目的。
虽然成纤维细胞在人体中广泛存在，但是要想获得达到临床治疗所需细胞数量，仍必须进行体外大规模扩增。目前成纤维细胞的扩增体系主要是使用含胎牛血清的基础培养基。胎牛血清中含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可以促进细胞生长。但是由于胎牛血清属于异种蛋白，且可能有动物携带的细菌、病毒、蛋白传染性疾病等潜在危险，使用胎牛血清培养的成纤维细胞注射人体后，可能导致这些病原体的传播而产生感染，或引起过敏反应，寻找无动物源成分的细胞培养基用于培养成纤维细胞成为亟待解决的问题。
发明内容
第一方面，本申请提供了细胞培养基，其包含基础培养基和血小板裂解物，优选地，其中所述细胞培养基还包含谷氨酸和/或脯氨酸。
在一些实施方案中，谷氨酸在所述细胞培养基中的浓度为30～1500mg/L。
在一些实施方案中，脯氨酸在所述细胞培养基中的浓度为10～1200mg/L。
在一些实施方案中，所述血小板裂解物在所述细胞培养基中的体积含量为1～10％。
在一些实施方案中，所述血小板裂解物为人血小板裂解物。
在一些具体的实施方案中，所述血小板裂解物为SuperGrow细胞培养添加物。
在一些实施方案中，所述基础培养基为DMEM培养基、BME培养基、MEM培养基、Ham’sF12培养基、RPMI1640培养基、199培养基、IMDM培养基或其任意组合。
第二方面，本申请还提供了成纤维细胞的培养方法，其包括将所述成纤维细胞在第一方面所述的细胞培养基中进行培养。
在一些实施方案中，所述细胞培养基能够维持成纤维细胞传至少5代、至少10代、至少20代、至少30代、至少40代、至少50代或至少100代。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞的培养方法还包括从皮肤组织获得成纤维细胞的步骤，其中采用含胶原酶的消化液对皮肤组织进行消化。
在一些实施方案中，所述胶原酶为胶原酶I和胶原酶IV。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的细胞培养基用于培养成纤维细胞的用途。
第四方面，本申请提供了通过第二方面所述的培养方法获得的成纤维细胞在作为用于美容或组织修复的原料中的用途。
附图说明
图1为不同时间点SuperGrow组和FBS组的人成纤维细胞的贴壁生长情况的照片。其中A为不同时间点FBS组的人成纤维细胞的贴壁生长情况的照片，B为不同时间点SuperGrow组的人成纤维细胞的贴壁生长情况的照片。
图2为SuperGrow组和FBS组的人成纤维细胞的细胞形态照片。其中A为FBS组的人成纤维细胞P4代的细胞形态照片，B为SuperGrow组的人成纤维细胞P4代的细胞形态照片；A和B中，1均代表明场的照片，2均代表DAPI染色的照片，3均代表波形蛋白染色的照片，4均代表DAPI染色和波形蛋白染色拟合的照片。
图3为流式细胞仪测定的SuperGrow组和FBS组的人成纤维细胞的纯度图。其中，A代表P3代成纤维细胞-对照组的细胞散点图；B代表P3代成纤维细胞-FBS组相对成纤维细胞-对照组的细胞纯度图；C代表P3代成纤维细胞-SuperGrow组相对成纤维细胞-对照组的细胞纯度图；D代表P3代成纤维细胞-对照组的细胞直方图；E代表P3代成纤维细胞-FBS组的细胞纯度图；F代表成纤维细胞-SuperGrow组的细胞纯度图。
图4为SuperGrow组和FBS组的人成纤维细胞的细胞周期测定结果。其中，A为SuperGrow组的人成纤维细胞的细胞周期测定结果；B为FBS组的人成纤维细胞的细胞周期测定结果。
图5为FBS组、SuperGrow组和Ultroser G组的人成纤维细胞增殖的曲线图。
图6为羟脯氨酸标准曲线图。
图7为不同时间点FBS组、SuperGrow组和Ultroser G组的细胞培养基中羟脯氨酸含量变化曲线图。
图8为包含谷氨酸和/或脯氨酸的细胞培养基对人成纤维细胞生长影响的图。其中，A为对照组人成纤维细胞的图像，B为第1组人成纤维细胞的图像，C为第2组人成纤维细胞的图像，D为第3组人成纤维细胞的图像，E为第4组人成纤维细胞的图像，F为第5组人成纤维细胞的图像，G为第6组人成纤维细胞的图像，H为第7组人成纤维细胞的图像。
发明详述
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
定义
本文所用术语“基础培养基”，是指仅能够维持细胞生存的培养基，其可以为包含氨基酸、维生素、盐和营养素的溶液。营养素包括可被细胞代谢的碳源(例如糖，如葡萄糖)，以及细胞存活必需的其它化合物。许多基础培养基是哺乳动物细胞培养领域所已知的，例如DMEM培养基、BME培养基等。
本文所用术语“血小板裂解物”，是指自体或异体血小板富集物经细胞裂解后的产物，其富含血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor，FGF)、类胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)、上皮细胞生长因子(epithelial cell growth factor，ECGF)等多种生长因子。
本文所用术语“SuperGrow细胞培养添加物”，是一种适用于淋巴细胞体外培养的血清替代物，富含细胞生长所需生长因子，是免疫细胞扩增培养的天然营养物。在一些实施方案中，用于本申请的SuperGrow细胞培养添加物购自深圳市达科为生物技术股份有限公司，货号为DKW34-SM20025。
具体实施方式
第一方面，本申请提供了细胞培养基，其包含基础培养基和血小板裂解物。
在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含抗生素。在一些具体实施方案中，所述抗生素为庆大霉素、两性霉素B或其组合。
在一些实施方案中，所述血小板裂解物在所述细胞培养基中的体积含量为1～10％。
在一些实施方案中，所述血小板裂解物在所述细胞培养基中的体积含量为2～5％，例如2.5％或5％。
在一些实施方案中，所述血小板裂解物为人血小板裂解物。
在一些具体的实施方案中，所述血小板裂解物为SuperGrow细胞培养添加物。SuperGrow细胞培养添加物可通过商业途径购买。
在一些实施方案中，所述基础培养基为DMEM培养基、BME培养基、MEM培养基、Ham’sF12培养基、RPMI1640培养基、199培养基、IMDM培养基或其任意组合。
在一些实施方案中，所述基础培养基为DMEM培养基。在一些具体的实施方案中，所述基础培养基为高糖型DMEM培养基。
本申请的细胞培养基没有添加动物源血清，避免了血清可能携带的安全隐患，同时避免了不同批次之间的差异，有利于细胞的规模化稳定培养。
在优选的实施方案中，上述细胞培养基还包含谷氨酸和/或脯氨酸。在一些具体的实施方案中，所述细胞培养基包含基础培养基、血小板裂解物和谷氨酸。在一些具体的实施方案中，所述细胞培养基包含基础培养基、血小板裂解物和脯氨酸。在一些具体的实施方案中，所述细胞培养基包含基础培养基、血小板裂解物、谷氨酸和脯氨酸。
在一些实施方案中，谷氨酸在所述细胞培养基中的浓度为30～1500mg/L。
在一些实施方案中，谷氨酸在所述细胞培养基中的浓度为118～590mg/L，例如118mg/L或590mg/L。
在一些实施方案中，脯氨酸在所述细胞培养基中的浓度为10～1200mg/L。
在一些实施方案中，脯氨酸在所述细胞培养基中的浓度为92～460mg/L，例如92mg/L或460mg/L。
本申请发明人出乎意料地发现，在细胞培养基中加入谷氨酸和/或脯氨酸能够有效地增加细胞例如成纤维细胞的数量和/或有利于更好地维持细胞例如成纤维细胞的形态，与不含谷氨酸和/或脯氨酸的培养基培养的成纤维细胞相比，在数量或形态方面具有显著的差异。
第二方面，本申请还提供了成纤维细胞的培养方法，其包括将所述成纤维细胞在第一方面所述的细胞培养基中进行培养。
在一些实施方案中，所述细胞培养基能够维持成纤维细胞传至少5～100代或以上，例如传至少5代、至少10代、至少20代、至少30代、至少40代、至少50代或至少100代。
在一些具体的实施方案中，所述细胞培养基能够维持成纤维细胞传至少20代。
在一些具体的实施方案中，所述培养在37℃，含5％CO2的环境中按照本领域技术人员所熟悉的常规方法进行培养。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞的培养方法还包括从皮肤组织获得成纤维细胞的步骤，其中采用含胶原酶的消化液对皮肤组织进行消化。
在一些实施方案中，所述胶原酶为胶原酶I和胶原酶IV的组合。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞。
在一些具体的实施方案中，所述成纤维细胞为人成纤维细胞。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的细胞培养基用于培养成纤维细胞的用途。
本申请的细胞培养基与常规细胞培养基相比，能促进成纤维细胞长期体外生存，满足多次传代需要，能够使其从原代传20代以上。此外，利用本文公开的方法培养的成纤维细胞不易老化，在多次传代后仍能够维持良好的细胞形态和分泌活性。
本申请发明人发现，本申请细胞培养基中所包含的血小板裂解物例如SuperGrow细胞培养添加物与其他血清替代物相比，能够更好地维持所培养的成纤维细胞的细胞形态和分泌活性。
在一些实施方案中，在包含基础培养基和血小板裂解物的细胞培养基中进一步添加谷氨酸后能够有效增加成纤维细胞的数量，与不添加谷氨酸的培养基相比在细胞数量方面具有显著的统计学差异。
在一些实施方案中，在包含基础培养基和血小板裂解物的细胞培养基中添加脯氨酸后能够更好地维持成纤维细胞的形态。
在一些实施方案中，在包含基础培养基和血小板裂解物的细胞培养基中添加谷氨酸和脯氨酸后可以增加成纤维细胞的数量，还可以更好地维持成纤维细胞良好的细胞形态。
第四方面，本申请提供了通过第二方面所述的培养方法获得的成纤维细胞在作为用于美容或组织修复的原料中的用途。
本申请通过提供扩增的成纤维细胞能够提供用于皮肤美容或皮肤组织修复的原料。成纤维细胞是真皮组织的主要效应细胞，能产生胶原、纤维粘连蛋白等多种细胞外基质，成纤维细胞及其所产生的细胞外基质、基质所保持的水分是维持皮肤弹性的物质基础。此外，成纤维细胞是创伤愈合过程中主要的修复细胞之一。当皮肤组织受损后，成纤维细胞应答损伤刺激游走浸润至伤口局部，并被激活进入增殖及代谢旺盛期，同时产生多种组织修复因子。
第五方面，本申请提供了用于消化皮肤组织的方法，其包括利用含胶原酶的组合物来处理皮肤组织。
胶原酶即胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大，因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。胶原酶分为I、II、III、IV、V型以及肝细胞专用胶原酶，根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。
在一些实施方案中，所述胶原酶为胶原酶I和胶原酶IV的组合。
在一些实施方案中，所述消化在37℃进行2～5小时(例如，4小时)。
在一些实施方案中，所述皮肤组织与所述消化液的比例满足1：(1～30)w/v。
在一些具体的实施方案中，所述皮肤组织与所述消化液的比例满足1：(10～25)w/v，例如1:20w/v。
在一些实施方案中，可以将胶原酶I和胶原酶IV同时溶解在基础培养基中配制成消化液，也可以将胶原酶I和胶原酶IV分别溶解在基础培养基中配制成溶液，混合后制成消化液。
在一些实施方案中，将相同浓度的胶原酶I溶液和胶原酶IV溶液按照体积比(1～3):1的比例配制。例如，在一些具体的实施方案中，将胶原酶I溶解在基础培养基(例如，DMEM培养基)中配制成胶原酶I溶液(浓度为0.1％，w/v)，将胶原酶IV溶解在基础培养基(例如，DMEM培养基)中配制成胶原酶IV溶液(浓度为0.1％，w/v)，将胶原酶I溶液和胶原酶IV溶液按照体积比(1～3):1的比例混合制成消化液。
本申请使用胶原酶I和胶原酶IV共同消化皮肤组织，其中胶原酶I可针对性的对皮肤组织进行消化，同时添加胶原酶IV对皮肤组织中的一些非特异性胶原进行消化，进而增加消化能力，而且避免了使用其他类的蛋白酶对成纤维细胞造成的伤害。
在一些具体的实施方案中，在消化前还需要对皮肤组织进行洗涤，例如用4℃的生理盐水洗涤3次，或先用4℃的生理盐水洗涤3次，再用75％的乙醇洗涤，最后再用生理盐水洗涤；将洗涤后的皮肤组织剪碎后再进行消化。
作为示例性而非限制性的方案，本申请的成纤维细胞的培养方法可以包含下述一个或多个步骤：
1)洗涤(例如用4℃的生理盐水洗涤3次，或先用4℃的生理盐水洗涤3次，再用75％的乙醇洗涤，最后再用生理盐水洗涤)新鲜皮肤组织，得到洗涤后的皮肤组织；
2)将在步骤1)洗涤后的皮肤组织剪碎(例如，直径约1mm大小)，得到剪碎的皮肤组织；
3)在37℃使用含胶原酶(包括胶原酶I和胶原酶IV)的消化液消化步骤2)的剪碎的皮肤组织2～5小时(例如，4小时)，得到消化后的混合物；
4)将消化后的混合物用基础培养基(例如，高糖型DMEM培养基)稀释，进行离心(例如，2000rpm离心5分钟)，去上清，得到成纤维细胞；
5)用本申请的细胞培养基在37℃，含5％CO2的环境培养步骤4)的成纤维细胞。
在上述示例性成纤维细胞的培养方法中，各步骤均为无菌操作。
本申请提供的成纤维细胞培养基及其应用，至少具有但不限于以下一种优势：
1)本申请的细胞培养基中未添加动物源血清，避免了可能携带的安全隐患，同时避免了不同批次之间的差异，有利于规模化稳定培养。
2)本申请的细胞培养基同时适用于成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)的原代和传代培养，而且在本申请的细胞培养基中原代细胞能够保持更好的细胞形态，呈细长梭状、边缘清晰、伸展良好。
3)在本申请的细胞培养基中培养的成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)比使用含血清的细胞培养基培养的成纤维细胞增殖更快；培养2天后，在本申请的细胞培养基中培养的成纤维细胞比使用含血清细胞培养基中培养的成纤维细胞数量明显增多。
4)在本申请的细胞培养基中培养的成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)与含血清细胞培养基中培养的成纤维细胞相比，功能相似，分泌的总胶原蛋白含量相差不大，说明在本申请的细胞培养基中成纤维细胞功能未受到影响。
5)本申请的细胞培养基能够满足多次传代需要，能够维持成纤维细胞(例如，人成纤维细胞)从原代传至20代以上，且传至20代后仍然能保持良好的细胞形态，这有利于成纤维细胞的大规模扩增培养。
6)在细胞培养基中进一步加入谷氨酸和/或脯氨酸后能够有效增加成纤维细胞的数量和/或有利于更好地维持成纤维细胞的良好形态，与不含谷氨酸和/或脯氨酸的培养基相比，成纤维细胞数量和/或形态具有显著的差异。
实施例
实施例1人成纤维细胞的培养
1.获取人成纤维细胞
将无菌条件下取回的新鲜皮肤组织(来源于医院医疗手术皮肤组织废弃物)放入无菌培养皿内，用4℃预冷的生理盐水洗涤3次，同时用无菌的眼科手术剪和镊子配合刮出组织中残留的血液，并剪去多余的皮下组织，然后将组织块剪碎(直径约1mm大小)。
将剪碎组织混合后称重，按重量每份0.25g，共计称量6份，编号为1～6号，分别用5mL消化液混匀后，37℃消化4小时，得到消化后的混合物。
消化液的配制方法如下：
称取0.1g胶原酶I，加入到100mL含双抗(庆大霉素和两性霉素B)的高糖型DMEM培养基(北京中生奥邦生物科技有限公司；货号：03.1002C)中，溶解后经0.22μm滤膜过滤，得到胶原酶I溶液(0.1％，w/v)，分装后1～2周内使用，或-20℃长时间冻存。
称取0.1g胶原酶IV，加入到100mL含双抗(庆大霉素和两性霉素B)的高糖型DMEM培养基中，溶解后经0.22μm滤膜过滤，得到胶原酶IV溶液(0.1％，w/v)，分装后1～2周内使用，或-20℃长时间冻存。
将胶原酶I溶液和胶原酶IV溶液按照体积比1:1的比例混合，得到消化液。
2.培养人成纤维细胞
分别用高糖型DMEM培养基将上述消化后的混合物稀释至15mL，混匀，2000rpm离心5分钟，去掉上清，获得人成纤维细胞沉淀。用5mL的细胞培养基A(10％(v/v)FBS+高糖型DMEM培养基)重悬的人成纤维细胞沉淀记为FBS组，用5mL的细胞培养基B(2.5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物+高糖型DMEM培养基)重悬的人成纤维细胞沉淀记为SuperGrow组，每组3份平行样品。重悬后将细胞悬液转入6cm培养皿中，在37℃，含5％CO2的培养箱中静置培养。其中SuperGrow细胞培养添加物购自深圳市达科为生物技术股份有限公司，货号为DKW34-SM20025。
实施例2人成纤维细胞的表征
1.细胞数量与活率检测
待实施例1中的细胞培养3天后将培养皿中的细胞培养基更换成各自对应的新鲜细胞培养基，并观察记录细胞生长状况，以后隔一天观察一次并拍照记录细胞的生长状况。将采用细胞培养基A(10％(v/v)FBS+高糖型DMEM培养基)培养的记为FBS组；采用细胞培养基B(2.5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物+高糖型DMEM培养基)培养的记为SuperGrow组。结果如图1所示，SuperGrow组原代细胞在培养的第13天达到60％的贴壁，比FBS组的原代细胞(第15天)提前2天时间达到贴壁60％。
待细胞生长贴壁到一定密度(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的50％～60％)时，对贴壁细胞进行处理、传代。采用胰蛋白酶将贴壁的细胞进行消化，并将消化后的细胞按照1:2的比例进行传代。
当P1代细胞生长达到贴壁80％左右(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，用细胞培养基将细胞悬浮，并吸取少量悬液，台盼蓝染色、计数，同时将细胞按1:3传代。
当P2代细胞生长达到贴壁80％左右(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，用细胞培养基将细胞悬浮，并吸取少量悬液，台盼蓝染色、计数，同时将细胞按1:3传代。
当P3代细胞生长达到贴壁80％左右(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，用细胞培养基将细胞悬浮，并吸取少量悬液，台盼蓝染色、计数，同时将细胞进行爬片和纯度测定。
传代培养后，SuperGrow组和FBS组的人成纤维细胞的数量和细胞活率如表1所示，SuperGrow组的传代细胞比FBS组的传代细胞提前2天达到相同数量级的细胞数量，两组细胞活率没有明显差异，均达到了98％以上。
表1人成纤维细胞的数量和活率数值
Figure BDA0001332262980000111
2.细胞形态检测
1)将用于增殖实验的P3代细胞传代至6孔板(记为P4代)中，次日用于细胞免疫荧光检测；
2)将培养过夜的细胞用4％多聚甲醛4℃固定30分钟，用PBS溶液洗涤3次，每次3分钟；
3)用0.4％Triton X-100对细胞透化处理10分钟，用PBS溶液洗涤3次，每次3分钟；
4)用封闭液(5％BSA溶液)封闭30分钟，用PBS溶液洗涤3次，每次3分钟；
5)用抗波形蛋白-FITC(11-9897，eBioscience；用PBS溶液稀释100倍)在4℃下避光孵育过夜，孵育结束后用PBS溶液洗涤3次，每次3分钟；
6)用DAPI复染，避光孵育8分钟，孵育结束后用PBS溶液洗涤3次，每次3分钟；
7)用荧光显微镜观察。
结果如图2所示，SuperGrow组的人成纤维细胞保持了很好的细胞形态，呈细长梭状、边缘清晰、伸展良好。
3.细胞纯度测定
1)收集用于增殖实验的P3代人成纤维细胞，用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，用PBS溶液洗涤3次，然后3500rpm离心3分钟；
2)用0.4％的Triton X-100溶液对细胞室温透化10分钟，用PBS溶液洗涤3次，然后3500rpm离心3分钟；
3)用200μL PBS溶液重悬细胞，分成2等份，其中一份加入1μL抗波形蛋白-FITC溶液，混匀后避光冰浴放置30分钟，另外一份不加抗波形蛋白-FITC作为对照组；
4)染色结束后，用PBS溶液洗涤1次，3500rpm离心3分钟；
5)使用流式细胞仪测定细胞纯度。
结果如图3所示，SuperGrow组的人成纤维细胞和FBS组的人成纤维细胞一样具有高于98％的细胞纯度。
4.细胞周期测定
1)细胞固定：收集用于增殖实验的P3代人成纤维细胞，取适量细胞用PBS溶液洗涤1次，后用1mL预冷的70％乙醇重悬，4℃放置过夜，离心去掉上清，用预冷的PBS溶液洗涤1次，小心去掉上清；
2)使用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术，货号：C1052)进行细胞周期测定，碘化丙啶染色液配制：
试剂 用量
染色缓冲液 0.5mL
碘化丙啶染色液(20X) 25μL
RNase A(50X) 10μL
终体积 0.535mL
3)染色：向细胞样品中加入500μL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30分钟；
4)使用流式检测；
5)使用Modfit软件分析结果。
结果如图4所示，FBS组的人成纤维细胞处于G1期的细胞比例为62.14％，SuperGrow组的人成纤维细胞处于G1期的细胞比例为59.36％。SuperGrow组的人成纤维细胞处于G1期的细胞比例低于FBS组，表明使用SuperGrow细胞培养添加物的细胞培养基培养的人成纤维细胞比使用FBS的细胞培养基培养的人成纤维细胞增殖更旺盛，分裂能力更强。
5.细胞增殖曲线测定
将P3代培养结束的人成纤维细胞用胰酶消化后，按2×103个/mL的细胞浓度接种96孔培养板，每孔100μL细胞悬液(采用10％(v/v)FBS+高糖型DMEM配制)，贴壁12小时后分别换成表2中所示的1～3号细胞培养基，分别命名为FBS组、SuperGrow组和Ultroser G组，与FBS组、SuperGrow组和Ultroser G组分别对应的空白对照组为只添加相应的培养基而不含细胞。次日起每天固定时间点使用CCK-8测定增殖曲线。其中Ultroser G购自PALL生命科学公司(PALL life sciences)，货号为15950-017。
表2细胞培养基的配方
Figure BDA0001332262980000141
CCK-8测定：将原有细胞培养基全部吸走，重新加入110μL用对应的细胞培养基配制的含有10％CCK-8的新鲜细胞培养基，放回培养箱，继续培养2小时后，用酶标仪分别测定A450和A650。
使用Origin 8中的DoseResp函数对曲线进行拟合，函数公式为：
Figure BDA0001332262980000142
其中A1为A450和A650差值的最小值，A2为A450和A650差值的最大值，Logx0为中心值，p为斜率，x为时间，y为吸光值(△A为A450和A650的差值)，各组的A1、A2、Logx0和p的相关数值如表3所示。
表3各组相关常数数值
Figure BDA0001332262980000143
Figure BDA0001332262980000151
FBS组、SuperGrow组和Ultroser G组的细胞增殖曲线如图5所示，SuperGrow组人成纤维细胞的增殖能力要明显高于FBS组和Ultroser G组，这主要是由于SuperGrow组的细胞培养基中含有丰富的促人成纤维细胞生长因子，很好的促进了细胞的增殖。
6.羟脯氨酸的测定
将P3代培养结束的人成纤维细胞用胰酶消化后，按2×103个/mL的细胞浓度接种96孔培养板，每孔100μL细胞悬液(采用10％(v/v)FBS+高糖型DMEM配制)，贴壁12小时后分别换成表2中所示的1～3号细胞培养基，分别命名为FBS组、SuperGrow组和Ultroser G组，均为实验组。测定不同时间点(0、24、48、72、96、120、144和168小时)细胞培养基中羟脯氨酸的含量。
使用南京建成生物工程研究所的羟脯氨酸检测试剂盒(消化法，货号为A030-1)进行羟脯氨酸的检测。按照表4中的设置进行样品的消化处理，混合均匀后，37℃水浴3小时。
表4
Figure BDA0001332262980000152
消化结束后，按照表5中的步骤进行羟脯氨酸的测定。
表5
Figure BDA0001332262980000153
Figure BDA0001332262980000161
按照表5中步骤操作结束后，混合均匀，60℃水浴15分钟，流水冷却后，12000rpm离心15秒，取上清300μL于平底的96孔板中，用酶标仪测定550nm处的吸光度。按照图6的羟脯氨酸标准曲线计算实验组样品中各时间点中羟脯氨酸的含量。实验组各时间点羟脯氨酸含量的变化如图7所示，FBS组的羟脯氨酸含量能够长时间的维持比较高的水平，这主要是由于FBS中营养物质非常丰富，能给细胞的增殖提供源源不断的氨基酸来源；而SuperGrow组、Ultroser G组在大约72～96小时后羟脯氨酸的含量逐渐下降，主要是由于细胞培养基中的氨基酸大部分都用于了细胞的增殖，且随着细胞增殖氨基酸的含量逐渐下降，导致能够生成羟脯氨酸的量逐渐减少。
实施例3谷氨酸和/或脯氨酸对人成纤维细胞生长的影响
本实施例测定了培养基中含有谷氨酸和/或脯氨酸时对人成纤维细胞生长的影响，具体实验步骤如下：
1、当采用5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物+高糖型DMEM培养基(北京中生奥邦生物科技有限公司；货号：03.1002C)培养的P4代人成纤维细胞生长达到贴壁80％左右(细胞贴壁面积占培养瓶培养面积的比例)时，无菌条件下消化、收集细胞，用细胞培养基将细胞悬浮，并吸取少量悬液，台盼蓝染色、计数，同时将细胞进行爬片和纯度测定。
2、用5％SuperGrow+高糖型DMEM培养基将收集的P4代人成纤维细胞重悬，并按相同的密度(2500个/孔)接种至96孔板中，放回培养箱培养。
3、待细胞完全贴壁后将培养液分别更换成如下1-7组培养基继续培养，各组培养基的组成如下：
第1组：5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物、高糖型DMEM培养基、葡萄糖(9000mg/L)、赖氨酸(292mg/L)、甘氨酸(60mg/L)、谷氨酸(118mg/L)和脯氨酸(92mg/L)；
第2组：5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物、高糖型DMEM培养基、葡萄糖(22500mg/L)、赖氨酸(730mg/L)、甘氨酸(150mg/L)、谷氨酸(590mg/L)和脯氨酸(460mg/L)；
第3组：5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物、高糖型DMEM培养基和葡萄糖(22500mg/L)；
第4组：5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物、高糖型DMEM培养基和甘氨酸(150mg/L)；
第5组：5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物、高糖型DMEM培养基和赖氨酸(730mg/L)；
第6组：5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物、高糖型DMEM培养基和谷氨酸(590mg/L)；
第7组：5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物、高糖型DMEM培养基和脯氨酸(460mg/L)；
对照组：5％(v/v)SuperGrow细胞培养添加物和高糖型DMEM培养基。
上述各组，每组3个重复，培养一周后观察并记录细胞生长状况，结果如图8所示。
从图8中可以看出，与对照组相比，第6组培养的人成纤维细胞的数量明显增多，相对于对照组具有显著的统计学差异，表明谷氨酸对于人成纤维细胞数量的增加具有明显的促进作用；与对照组相比，第7组的人成纤维细胞具有更好的细胞形态，表明脯氨酸有利于人成纤维细胞保持良好的细胞形态；与对照组相比，第1组人成纤维细胞不仅在细胞数量上明显增多，相对于对照组具有显著的统计学差异，而且比对照组细胞具有更好的细胞形态；与对照组相比，第2组人成纤维细胞在细胞数量上明显增多，相对于对照组具有显著的统计学差异；与对照组相比，第3组、第4组和第5组人成纤维细胞在细胞数量和细胞形态上与对照组无差别。上述实验结果表明，在培养基中加入谷氨酸和/或脯氨酸后，显著有利于人成纤维细胞的生长。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.细胞培养基，其包含基础培养基和血小板裂解物，其中所述细胞培养基还包含额外添加的谷氨酸和/或脯氨酸，除了所述基础培养基含有的谷氨酸和/或脯氨酸之外，额外添加的谷氨酸在所述细胞培养基中的浓度为118～590mg/L，额外添加的脯氨酸在所述细胞培养基中的浓度为92～460mg/L，其中所述血小板裂解物为SuperGrow细胞培养添加物，所述基础培养基为高糖型DMEM培养基，SuperGrow细胞培养添加物在所述细胞培养基中的体积含量为5％。
2.成纤维细胞的培养方法，其包括将所述成纤维细胞在权利要求1所述的细胞培养基中进行培养。
3.如权利要求2所述的培养方法，其还包括从皮肤组织获得成纤维细胞的步骤，其中采用含胶原酶的消化液对皮肤组织进行消化。
4.如权利要求3所述的培养方法，其中所述胶原酶为胶原酶I和胶原酶IV。
5.如权利要求2所述的培养方法，其中所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞。
6.如权利要求2所述的培养方法，其中所述成纤维细胞为人成纤维细胞。
7.权利要求1所述的细胞培养基用于培养成纤维细胞的用途。
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