CN110373375A - 一种制备纤维细胞作为细胞培养基的方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备纤维细胞作为细胞培养基的方法，该方法包括以下步骤：步骤1、提供胚胎干细胞悬浮液，培养为拟胚体(EB)并继续培养；步骤2、培养到第6天后的将形成的EB接种到6孔板中，使用诱导培养基进行5天时间的培养，所述的诱导培养基的成分包括：DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)；步骤3、当进行步骤(2)中的5天培养后，EB周围会爬出梭形的细胞，将梭形细胞挑出放于一个新的6孔板中用诱导培养基培养；步骤4、当诱导培养的6孔板中的梭形细胞汇合度达到90％时，按1:3的比例传代，待细胞汇合度达到100％。采用这样的方法培养的纤维细胞可以培养胚胎细胞而且适应范围广，避免了异源新问题。

Description

一种制备纤维细胞作为细胞培养基的方法和用途
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及细胞外基质的制备及胚胎干细胞的培养。具体涉及胚胎干细胞向成纤维细胞的分化，成纤维细胞外基质的制备和胚胎干细胞的培养，能够用自体来源的细胞外基质培养胚胎干细胞。
背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是从早期胚胎的内细胞团(innercell mass,ICM)或单卵裂球中分离培养得到的一类细胞，其主要特点在于自我更新能力和产生机体内所有细胞的潜能。1981年，Evans和Kaufman用小鼠胚胎成功建立鼠胚胎干细胞系(mouse embryonic stem cells,mESCs)。随后，研究人员开始探索建立人胚胎干细胞系(human embryonic stem cells,hESCs)的方法。直至1998年，Thomson等从体外受精(invitro fertilization,IVF)的早期胚胎中分离得到hESCs，这一研究成果在世界范围内引起了巨大反响。
自成功建立细胞系以来学者们一直在改进建系方法和培养体系，如避免异源污染(基质胶的研究、无饲养层和无血清培养体系的研究等)以建立优质的细胞系，获得更高全能性的干细胞。胚胎干细胞的培养体系根据饲养层的有无可以分为含饲养层和无饲养层体系两种。
含饲养层培养体系自Thomson等使用丝裂霉素C或γ射线灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)作为饲养层成功建系以来，含饲养层培养体系一直被大多数研究人员所接受，至今仍是hES细胞培养最常见的体系。这种体系中培养的hES细胞状态比较稳定，但MEF在体外培养代次有限(一般为8代左右，饲养层常用第4代左右)，人力物力耗费大，且是鼠源物质，给hES细胞的临床应用带来安全隐患。
为避免异源污染，韩国学者用人羊水细胞(human amniotic fluid cells,HAF)作为饲养层，并用SR代替血清培养hES细胞，这一研究使hES细胞摆脱动物源污染。除此之外，研究人员还用羊水间充质干细胞、骨髓间充质细胞、毛囊间充质、成纤维细胞作为饲养层，为临床应用奠定基础。
饲养层体系建系、培养hES细胞的局限性使学者们渴望寻求一种基质，来代替MEF或其他类型的饲养层为hES细胞的生长提供营养。Teotia等用人源饲养层细胞的条件培养基来培养hESCs，条件培养基是细胞处于对数生长期时回收的培养基，经过滤除菌后再次使用，但这种培养基培养细胞容易分化。 Miyazaki等发现hES细胞主要表达整合素α6β1，其主要结合层黏连蛋白 (recombinant human laminin,rhLM)-111、-332和-511/-521。当将hESCs接种到rhLM上时，细胞确实明显地黏附于rhLM-332，并且rhLM-511和 rhLM-111的黏附程度较低。hESCs可以在这三种rhLM上增殖，同时保持它们的多能性。这些结果显示rhLM-111、-332和-511是扩展未分化hESCs的良好底物。此外，用作基质胶的还有Matrigel，它与rhLM都是无饲养层培养体系中常用的基质胶，主要成分是层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等。Xu等认为这两种基质胶仍存在异种污染的潜在风险，因此，Xu等用辣根过氧化物酶和过氧化氢交联酪胺部分得到HA-Tyr(hyaluronic acidtyramine) 水凝胶，用其作为基质进行3D培养后发现hES细胞仍具有全能性，他们认为这种基质可以完全通过化学方法来获得，是比较理想的基质胶选择。
防止异源污染的另一种方法是使用成分明确的培养基，即无血清培养体系。无血清培养体系的研究主要包括美国Thomson实验室和北京大学邓宏魁实验室。2006年，首次分离出hESCs的Thomson实验室使用一种成分明确的培养基TeSR1和Matrigel包被的培养皿共同维持hESCs的生长。同年，该实验室又报道了对TeSR1培养基的改进——以斑马鱼来源的bFGF(zebrafish basic fibroblast growth factor,zbFGF)取代了人源bFGF，即mTeSR1。2011年， Thomson实验室又提出只含有8种成分的培养基(即E8)就可以保证维持人诱导多能干细胞(human induced pluri-potent stem cells,hiPSCs)的自我更新和全能性。这两种培养基都被StemCell公司产品化，从而推出了完全成分确定的无血清培养基，即mTeSRTM 1和TeSR TM-E8 TM。
这就需要对传统的方法进行改进，解决了异源物质污染的问题，这种方法培养的细胞可以用来做临床研究。
发明内容
本发明提供一种胚胎干细胞来源的成纤维细胞的培养方法，该方法包括：
步骤1、提供胚胎干细胞悬浮液，培养为拟胚体(EB)；
步骤2、第6天将形成的EB接种到6孔板中，使用诱导培养基进行5天时间的培养，所述的诱导培养基的成分为：DMEM+10％Platelet lysate+1mM L-glutamine+100U/mLpenicillin+100mg/mL streptomycin；
步骤3、当进行步骤(3)中的5天培养后，EB周围会爬出梭形的细胞，将梭形细胞挑出放于一个新的6孔板中用诱导培养基培养；
步骤4、当诱导培养的6孔板中的梭形细胞汇合度达到90％时，按1:3的比例传代，待细胞汇合度达到100％。
在一个优选的方式中，其中，在步骤4中，待细胞汇合度达到80％时，取一孔细胞用免疫荧光方法鉴定成纤维细胞特异性表面蛋白，鉴定细胞为成纤维细胞阳性后，其余的成纤维细胞继续培养，直到汇合度达到100％。
在一个优选的方式中，其中，该方法进一步包括步骤5，在步骤4后，冷冻处理汇合度100％的成纤维细胞：吸去培养液，把6孔板密封后放入-20℃冰箱，24 小时后取出。
在一个优选的方式中，该方法进一步包括步骤6，在步骤5后，等-20℃冰箱冷冻处理24小时后，取出等每孔加入1ml DNA酶，37℃孵育5分钟，加入1mlPBS，冲洗掉附着在孔底部的成纤维细胞培养基，从而形成成纤维细胞的胞外基质培养基。
在一些优选的方式中，所述的诱导培养基包括DMEM和8-12％血小板裂解物(Platelet lysate)。
在一些优选的方式中，所述的诱导培养基包：括88％DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)+1mML左旋谷氨酰胺(glutamine)+100U/mL青霉素(penicillin) +100mg/mL链霉素(streptomycin)。
另一方面，本发明提供根据前述所述的方法所获得的成纤细胞培养基在作为培养内皮细胞，周皮细胞，平滑肌细胞，成纤维细胞，口腔角质细胞，或者皮肤角质细胞中的用途。
另一方面，本发明提供根据前述所述的方法所获得的成纤细胞培养基在作为培养内皮细胞，周皮细胞，平滑肌细胞，成纤维细胞，口腔角质细胞，或皮肤角质细胞中的用途。
有益效果：
本方法使用胚胎干细胞分化得到的成纤维细胞的胞外基质培养胚胎干细胞，是自体的胞外基质，所以不含异源动物成分，避免了异源成分的污染和病毒的感染，而且自体来源的细胞外基质相比于商业来源的MEF和基质胶更便宜，节约了胚胎干细胞培养成本，此方法培养的胚胎干细胞可用于临床研究。因为所得到的胞外基质模拟了人类细胞的生长基质，所以还适用于人类多种细胞的培养。
附图说明
图1为拟胚体及其分化的成纤维细胞的不同阶段实验结果图，其中，A是人胚胎干细胞，B是胚胎干细胞形成的拟胚体，C是由胚胎干细胞分化得到的成纤维细胞。
图2为胚胎干细胞分化出的成纤维细胞的免疫荧光结果图，其中绿色信号表示成纤维细胞标志蛋白vimentin，蓝色信号表示细胞核。
图3胚胎干细胞来源的成纤维细胞胞外基质和成体成纤维细胞总胞外基质的扫面电镜图，其中，A是胚胎干细胞来源的成纤维细胞总的胞外基质，B是成体成纤维细胞总胞外基质；由图可以看出，胚胎干细胞来源的成纤维细胞产生的细胞外基质要远远多于成体成纤维细胞产生的细胞外基质。
图4为胚胎干细胞来源的成纤维细胞胞外基质蛋白和成体成纤维细胞胞外基质蛋白的比较图，其中，胚胎干细胞来源的成纤维细胞外基质4型胶原蛋白和纤连蛋白(A,C)的含量明显多于成体成纤维细胞胞外基质(B,D)。A,B是4型胶原蛋白的免疫荧光结果，C,D是纤连蛋白的免疫荧光结果，从荧光的检测亮度来看。
图5为不同基质上培养的胚胎干细胞的比较结果图。
图6是本发明制备的胚胎干细胞来源的成纤维细胞胞外基质上培养的不同种类细胞的结果图。由图可以看出胚胎干细胞来源的成纤维细胞胞外基质可以支持多种类型细胞的生长。A是内皮细胞，B是周皮细胞，C是平滑肌细胞，D是成纤维细胞，E是口腔角质细胞，F是皮肤角质细胞。此外还可培养骨骼肌细胞，脂肪细胞，神经细胞等其他种类的细胞。
图7是本发明一个具体实施例子的工艺图。
详细说明
下面对本发明涉及的结构或这些所使用的技术术语做进一步的说明。这些说明仅仅是采用举例的方式进行说明本发明的方式是如何实现的，并不能对本发明构成任何的限制。
具体实施方式
现在以具体的方式来说明本发明是如何实现的，但是，这样的方式并不是对本发明有任何限制，而是本发明精髓下的一个具体实现方式。没有特别说明，本发明的百分数表示质量百分比。
实施例子1:胚胎干细胞来源的成纤维细胞的培养过程(参见图7的工艺路线图)
1.材料和试剂
胚胎干细胞细胞株系H9(来源：本公司自有的细胞)；中性蛋白酶(购买自STEMCELLTechnologies)。
血小板裂解物购买自Biological Industries，型号是PLTGOLD50R。
DMEM的具体成分(基础培养基)：购买自Biological Industries，成分为：无水氯化钙，硝酸铁,氯化钾，无水硫酸镁，氯化钠，无水磷酸二氢钠，L-盐酸精氨酸，L-盐酸胱氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-盐酸组氨酸，L-异亮氨酸，L- 亮氨酸，L-盐酸赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸钠盐，L-缬氨酸，D-泛酸钙，氯化胆碱，叶酸，肌醇，烟酰胺，核黄素，盐酸硫铵，盐酸吡哆辛，葡萄糖，丙酮酸钠，酚红。
具体培养的方法为：
1.6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2ml DMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC 的克隆(即:ESC即胚胎干细胞，使用注射器的推杆把ESC克隆分割成小块刮下来，目的是使大的ESC变成小块的ESC，小块的ESC易于形成拟胚体。一般为边长大约为100-200μm的正方形，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟。
2.弃上清，加入2ml拟胚体(EB)培养液(88％DMEM+10％KSR +1％L-glutamine+1％NEAA，质量百分比为88％DMEM,10％KSR,1％ L-glutamine,1％NEAA)，用5ml血清管重悬细胞(用血清管吹打离心管底部的细胞块，使细胞悬浮于培养液中)，加入超低吸附6孔板中(普通的培养皿是易于细胞吸附于底部生长的，超低吸附的培养皿细胞不容易贴壁，细胞会一直悬浮于培养液中，有利于拟胚体的形成，只有本步骤使用超低吸附培养皿，其他步骤都是普通的培养皿)，二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次。
3.第6天将形成的EB接种到6孔板中，采用诱导培养基【(88％DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)+1mML左旋谷氨酰胺(glutamine)+100U/mL 青霉素(penicillin)+100mg/mL链霉素(streptomycin)】培养5天后，EB 周围会爬出类似梭形的细胞，将梭形细胞挑出放于一个新的6孔板中用诱导培养基(【(88％DMEM+10％血小板裂解物(Plateletlysate)+1mML左旋谷氨酰胺(glutamine)+100U/mL青霉素(penicillin)+100mg/mL链霉素(streptomycin)】培养，剩下的EB继续在原来的6孔板中培养。
4.每天观察原来的6孔板中EB的分化情况，等EB周围再次爬出大量梭形细胞时，再次将梭形细胞挑出，放于另外一个新的6孔板中培养，并采用诱导培养基【(88％DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)+1mML左旋谷氨酰胺(glutamine)+100U/mL青霉素(penicillin)+100mg/mL链霉素 (streptomycin)】进行培养。
5.当诱导培养6孔板中的梭形细胞汇合度达到90％时，按1:3的比例传代(1 孔接种三孔的比例进行)，待细胞汇合度达到60％-70％时，取一孔细胞用免疫荧光方法鉴定成纤维细胞特异性表面蛋白(例如vimentin(波形蛋白)，如果检测该蛋白免疫荧光强度来判断细胞特异表面细胞的阳性，如图2,绿色信号表示vimentin免疫荧光阳性，95％以上的细胞都有阳性信号)。
6.当鉴定细胞为成纤维细胞阳性后，其余的成纤维细胞继续培养，直到汇合度达到100％。
7.冷冻处理汇合度100％的成纤维细胞：吸去培养液，把6孔板密封后放入-20℃冰箱，24小时后取出；每孔加入1ml DNA酶，37℃孵育5分钟，加入1mlPBS，冲洗掉附着在孔底部的成纤维细胞，即获得hESC-Fibroblast来源的细胞外基质。
8.重复步骤3-7，可以连续生产来源于胚胎干细胞的成纤维细胞，并把该成纤维细胞作为培养细胞的培养基来使用，而不需要额外添加试剂就可以完成细胞的培养。
实施例子2：胚胎干细胞来源的成纤维细胞的培养过程
与实施例子1不同的是，诱导培养基是：88％DMEM+1mML左旋谷氨酰胺(glutamine)+100U/mL青霉素(penicillin)+100mg/mL链霉素。其它方法和步骤与实施例子一样。
实施例子3：胚胎干细胞来源的成纤维细胞的培养过程
与实施例子1不同的是，诱导培养基是：88％DMEM+1％Platelet lysate+1mM L-glutamine+100U/mLpenicillin+100mg/mL streptomycin。其它步骤和实施例子1 相同。
通过实施例子2和3培养的显微细胞来看，虽然这样培养可以得到分化为成纤维细胞，但是总胞外基质和胞外基质蛋白的类别相对实施例子1来讲，都显著减少。说明诱导培养基中的血小板裂解物成分是质量好坏的关键成分，而且含量也特别关键。为了进一步验证血小板裂解物的浓度的大小的影响，本发明进行了系列实验，从1-15％，按照浓度从1％到15％依次进行了大量的实验，发现浓度从8-12％是可以获得最好的成纤维细胞，总胞外基质和胞外基质蛋白的类别相对实施例子1来讲，含量相当，无显著差异，但是其它浓度缺差异显著。具体实验数据略。这可能是血小板裂解物浓度太高,会直接导致纤维细胞的胞基质蛋白含量或者质量下降。这些纤维细胞也不能完成胚胎细胞的分化或者其它培养，在本发明中没有进一步的阐述和说明。
实施例子4：通过实施例子1培养的纤维细胞和成体成纤维细胞胞外基质蛋白的比 较和总胞外基质的比较。
图3实施例子的过程：ECM(纤维细胞或成体成纤维细)包被的载玻片在2.5％戊二醛中固定4小时,然后用1％的四氧化锇处理1小时。ECM包被的载玻片用 PBS清洗三次,每次清洗10分钟。然后分别用25％、50％、75％、95％梯度浓度酒精脱水，每个梯度中静置10min，脱水完毕，用纯酒精脱水3次，每次10min。脱水后,样品在临界点干燥机干燥,然后安装在金属样品台上,在真空条件下喷镀金钯。用扫描电镜在10kv的加速电压下对样品进行成像。
图4：ECM在4孔培养皿中,用4％的甲醛室温固定15分钟。用PBS清洗两次样品,每次5分钟,用含有5％正常山羊血清和2％BSA的PBS在室温封闭1 小时。用1:200比例稀释在染色缓冲液(2％的BSA/PBS)中的一抗对ECM进行孵育。经过4度隔夜孵育后,用洗涤缓冲液(0.05％的tween20/PBS)对ECM 进行两次清洗,每次5分钟。ECM在二抗中避光室温孵育1小时。在共聚焦显微镜下进行观察拍照。
具体见图3和图4，通过本发明的实施例子1中纤维细胞和非来源于胚胎干细胞(成体成纤维细胞)的外基质蛋白的比较和总胞外基质的比较，发现胚胎干细胞来源的成纤维细胞产生的细胞外基质要远远多于成体成纤维细胞产生的细胞外基质。从胞外基质蛋白的比较来看，胚胎干细胞来源的成纤维细胞外基质4 型胶原蛋白和纤连蛋白(A,C)的含量明显多于成体成纤维细胞胞外基质(B,D)。 A,B是4型胶原蛋白的免疫荧光结果，C,D是纤连蛋白的免疫荧光结果。由此可见，来自胚胎干细胞的纤维细胞明显优于成体细胞。同样，实施例子2和3的种类和含量显著减少(具体实验结果略)。
实施例子5：对本发明实施例子1的纤维细胞和商业化的培养基的比较试验
MSCs的群体倍增时间:MSC的群体倍增时间(Population doubling level,PDL)在临床应用中，是最重要的一个参数，它是指群体中细胞数量增长一倍所需要的时间。PDL能准确表征细胞生长动力学。相比细胞传代次数，它更能准确的表征细胞的健康程度。群体倍增时间和细胞衰老直接相关，细胞衰老意味着分化能力下降。群体倍增时间和基因组的稳定性也直接相关。综上所述，群体倍增时间是和细胞衰老，基因组稳定性，分化能力等性质紧密相关的一个最重要的指标。 PDL值可以在不同工艺中进行横向比较。
我们分别将100,000个的hESC-MSC(胚胎干细胞)和脐带间充质干细胞 (UC-MSC)接种到一个T75培养瓶中，培养5天后分别计数每个培养瓶中细胞数量，仅仅是胞外基质蛋白不同来进行培养，来验证本发明的基质蛋白(实施例子1)和商业化基质蛋白的差异。
结果：
具体结果见图5所示的实验结果。由图5可以看出用hESC-ECM培养的胚胎干细胞和用商业化来源的基质培养的胚胎干细胞形态和发育状况都很接近，有些要好于商业来源的培养基，说明本发明的培养基要好于商业来源的培养基。
表1.hESC-MSC群体倍增时间检测
表2.脐带间充质干细胞群体倍增时间检测
实施例子6：在胚胎干细胞来源的成纤维细胞胞外基质上培养的不同种类细胞的 比较。
利用本发明的培养基进行不同细胞的培养，发现该培养基可以支持多种细胞的培养(图6)，而采用实施例子3商业来源的培养基并不支持一些细胞的培养 (培养的过程略)。
具体结果如下：
这进一步说明，通过本发明的培养方法获得的成纤维细胞胞外基质作为细胞培养的适应范围宽，而且更为有效。
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

Claims (8)

1.一种制备纤维细胞作为细胞培养基的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1、提供胚胎干细胞悬浮液，培养为拟胚体(EB)并继续培养；
步骤2、培养到第6天后的将形成的EB接种到6孔板中，使用诱导培养基进行5天时间的培养，所述的诱导培养基的成分包括：DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)；
步骤3、当进行步骤(2)中的5天培养后，EB周围会爬出梭形的细胞，将梭形细胞挑出放于一个新的6孔板中用诱导培养基培养；
步骤4、当诱导培养的6孔板中的梭形细胞汇合度达到90％时，按1:3的比例传代，待细胞汇合度达到100％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4中，待细胞汇合度达到80％时，取一孔细胞用免疫荧光方法鉴定成纤维细胞特异性表面蛋白，鉴定细胞为成纤维细胞阳性后，其余的成纤维细胞继续培养，直到汇合度达到100％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法进一步包括步骤5，在步骤4后，冷冻处理汇合度100％的成纤维细胞：吸去培养液，把6孔板密封后放入-20℃冰箱，24小时后取出。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，该方法进一步包括步骤6，在步骤5后，等-20℃冰箱冷冻处理24小时后，取出等每孔加入1ml DNA酶，37℃孵育5分钟，加入1mlPBS，冲洗掉附着在孔底部的成纤维细胞培养基，从而形成成纤维细胞的胞外基质培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的诱导培养基包括DMEM和8-12％血小板裂解物(Platelet lysate)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的诱导培养基包括：88％DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)+1mML左旋谷氨酰胺(glutamine)+100U/mL青霉素(penicillin)+100mg/mL链霉素(streptomycin)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的诱导培养基为88％DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)+1mML左旋谷氨酰胺(glutamine)+100U/mL青霉素(penicillin)+100mg/mL链霉素(streptomycin)。
8.本发明提供根据前述权利要求1-8之一方法所获得的成纤细胞培养基在作为培养内皮细胞，周皮细胞，平滑肌细胞，成纤维细胞，口腔角质细胞，和皮肤角质细胞中的用途。
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