CN106609256A - 体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，属于生物技术领域。本发明诱导分化经过一次传代可获得纯的视网膜色素上皮细胞。与现有技术相比，本发明缩短了人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的时间。本发明为人胚胎干细胞定向诱导分化为色素上皮细胞提供指导和新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法。
背景技术
视网膜变性疾病是全球首要的致盲原因。在该疾病中，视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)的损伤和功能异常导致光感受器细胞变性，最终影响病人视力直至失明。由于RPE和光感受器细胞的不可再生，至今在临床上人缺乏对这类疾病的有效治疗措施。相较于其他治疗方法，细胞治疗对视网膜退行性疾病的治疗有更大的前景。
由于胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)具有无限增殖和分化为各种细胞的能力，因此可以作为理想的移植细胞的来源。已有报道证实ESCs来源的RPE细胞应用于人类视网膜退行性疾病临床研究的可行性与安全性。那么，一套稳定有效的体外hESCs向RPE细胞分化的方法对视网膜退行性疾病的治疗和制药研究显得尤为重要。
在过去的十几年间，多种方法被报道可以控制胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化，并且在多种动物病变模型中发挥保护作用。但是这些报道的方法都各有其优缺点，耗时长，方法繁琐，批次间差异大和细胞得率低等问题依旧存在。
因此，需要一种诱导hESCs向RPE细胞分化的方法，不仅可以得到成熟的有功能的RPE细胞，而且能够做到方法简单，时间快捷，可重复性强和细胞得率高。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种体外高效诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种体外高效诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)分化为视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)的方法，包括以下步骤：
A、将人胚胎干细胞(hESCs)接种到饲养层细胞中，加入干细胞完全培养基，放置培养4-5天并定期换液；
b、去除分化细胞后用酶处理人胚胎细胞成小团块并接种于培养皿，加入分化培养基并添加特定的细胞因子，悬浮培养3天形成类胚体；
c、按照一定的密度将类胚体接种到贴壁培养皿，加入分化培养基并添加特定的细胞因子，贴壁培养并定期换液11天；
d、更换为视网膜色素上皮细胞培养基，放置培养2周，然后用酶处理细胞并1：2传代，接种到贴壁培养皿，继续培养4周，即可得到100％纯化的视网膜色素上皮细胞。
优选地，步骤a中所述饲养层细胞为X射线处理小鼠胚胎成纤维细胞。步骤a中所述干细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇及成纤维细胞生长因子，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/ml。所述达到融合状态为每天换液至细胞达到80％～90％的融合。
优选地，步骤b中所述去除分化细胞是用玻璃针挑除分化的干细胞；所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理12分钟并用移液器机械吹打；所述小团块为20～50个细胞的细胞团块；所述培养皿为不贴壁的细菌培养皿。步骤b中所述分化培养基成分为：Neurobasal medium和DMEM/F12等体积混合的基础培养基、N2、B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，N2体积含量为1％，B27体积含量为1％，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L。步骤b中所述特定的细胞因子为CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1与PJ34，各细胞因子在分化培养基中含量分别为：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：1μg/ml；IGF1：5ng/ml，PJ34：3μM。
优选地，步骤c中所述一定的密度为10个类胚体/cm2；所述贴壁培养皿为300ug/ml matrigel包被的细胞培养皿。步骤c中所述特定的细胞因子为CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1与PJ34，各细胞因子在分化培养基中含量分别为：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：10μg/ml；IGF1：10ng/ml，PJ34：3μM。
优选地，步骤d中所述视网膜色素上皮细胞培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；所述酶处理为0.25％胰酶处理10分钟；所述贴壁培养基为300ug/ml matrigel包被的细胞培养皿；100％纯化的视网膜色素上皮细胞为整皿的单层视网膜色素上皮样细胞，该细胞呈鹅卵石样形态，有色素积累。
优选地，各步骤中所述培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行。
目前文献报道的体外诱导hESCs向RPE分化的方法不仅耗时长(8周到数月不等)，而且获得的RPE细胞往往有其它分化细胞混合，需要人工挑取含有色素的RPE细胞进行RPE的纯化。与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明通过添加一定的小分子组合刺激，定向诱导人胚胎干细胞向RPE方向分化，本发明方法大大缩短了RPE细胞分化的时间，本发明分化时间为8周左右。而常规的自主分化的方法向多种方向分化，不仅分化时间长，目的细胞得率也低。
2、本发明方法提高了hESCs向RPE分化的纯度，经过6-8周的分化，经过一次传代可获得将近100％的RPE细胞。在常规的自主分化方法中，只有少部分细胞分化为RPE细胞，因而需要人工挑选的方法将黑色的RPE细胞从混合的细胞分离并扩增。本发明定向的将全部细胞向RPE分化，最终得到100％的RPE细胞，不需要机械分离。
3、本发明方法简单，可重复性强，细胞率高，本发明为人胚胎干细胞定向诱导分化为视网膜色素上皮细胞提供指导和新的途径。
附图说明
图1为本发明hESCs及分化3天和7天细胞的示意图；
图2为本发明hESCs分化细胞经一次传代后所得纯的RPE细胞图；
图3为本发明分化的RPE细胞及免疫荧光鉴定示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
本实施例为体外高效诱导hESCs分化为RPE细胞的方法。
本实施例中，所述诱导分化包括如下步骤：
a.将hESCs接种到饲养层细胞中，加入干细胞完全培养基，放置培养并定期换液至细胞达到融合；
本步骤中所述hESCs为细胞系H1，饲养层细胞为X射线处理小鼠胚胎成纤维细胞；所述干细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇及成纤维细胞生长因子，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/ml，培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行，所述hESCs培养4-5天后并每天换液的状态如图1A。
b.去除分化细胞后用酶处理hESCs成小团块并接种于培养皿，加入分化培养基并添加特定的细胞因子，悬浮培养3天形成类胚体；
本步骤中所述去除分化细胞是用玻璃针挑除分化的干细胞；所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理12分钟并用移液器机械吹打；所述小团块为20～50个细胞的细胞团块；所述培养皿为不贴壁的细菌培养皿；所述分化培养基成分为：Neurobasal medium和DMEM/F12等体积混合的基础培养基、N2、B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，N2体积含量为1％，B27体积含量为1％，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；特定的细胞因子为CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1与PJ34，各细胞因子在分化培养基中含量分别为：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：1μg/ml；IGF1：5ng/ml，PJ34：3μM，培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行，悬浮培养3天后形成类胚体，如图1B。
c.按照一定的密度将类胚体接种到贴壁培养皿，加入分化培养基并添加特定的细胞因子，放置培养并定期换液11天；
本步骤中所述一定的密度为10个类胚体/cm2；所述贴壁培养皿为100ug/mlmatrigel包被的细胞培养皿；特定的细胞因子为CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1与PJ34，各细胞因子在分化培养基中含量分别为：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：10μg/ml；IGF1：10ng/ml，PJ34：3μM。类胚体接种4天后形成如图1C所示的神经花环样结构。
d.更换为视网膜色素上皮细胞培养基，放置培养2周，然后用酶处理细胞并1：2传代，接种到贴壁培养皿，继续培养4周，即可得到纯化视网膜色素上皮细胞，如图2；
本步骤中所述视网膜色素上皮细胞培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；所述酶处理为0.25％胰酶处理10分钟；所述贴壁培养基为100ug/ml Matrigel包被的细胞培养皿；所述100％纯化视网膜色素上皮细胞为整皿的单层视网膜色素上皮样细胞，该细胞呈鹅卵石样形态，有色素积累，如图3A。
进一步对人ESCs分化来源的RPE细胞进行免疫组化鉴定，发现人ESCs分化来源的RPE细胞表达RPE细胞的前体基因Pax6和MITF，也表达成熟的RPE细胞相关基因如Cralbp，Bestrophin和ZO-1，如图3B-F。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照较佳实施案例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或这等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将人胚胎干细胞接种到饲养层细胞中，加入干细胞完全培养基，放置培养4-5天并定期换液；
b、去除分化细胞后用酶处理人胚胎细胞成小团块并接种于培养皿，加入分化培养基并添加特定的细胞因子，悬浮培养3天形成类胚体；
c、按照一定的密度将类胚体接种到贴壁培养皿，加入分化培养基并添加特定的细胞因子，贴壁培养并定期换液11天；
d、更换为视网膜色素上皮细胞培养基，放置培养2周，然后用酶处理细胞并1：2传代，接种到贴壁培养皿，继续培养4周，即可得到100％纯化的视网膜色素上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤a中所述饲养层细胞为X射线处理小鼠胚胎成纤维细胞。
3.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤a中所述干细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇及成纤维细胞生长因子，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/ml。
4.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤b中所述去除分化细胞是用玻璃针挑除分化的干细胞；所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理12分钟并用移液器机械吹打；所述小团块为20～50个细胞的细胞团块；所述培养皿为不贴壁的细菌培养皿。
5.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤b中所述分化培养基成分为：Neurobasal medium和DMEM/F12等体积混合的基础培养基、N2、B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，N2体积含量为1％，B27体积含量为1％，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤b中所述特定的细胞因子为CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1与PJ34，各细胞因子在分化培养基中含量分别为：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：1μg/ml；IGF1：5ng/ml，PJ34：3μM。
7.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤c中所述一定的密度为10个类胚体/cm2；所述贴壁培养皿为300ug/ml matrigel包被的细胞培养皿。
8.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤c中所述特定的细胞因子为CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1与PJ34，各细胞因子在分化培养基中含量分别为：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：10μg/ml；IGF1：10ng/ml，PJ34：3μM。。
9.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，步骤d中所述视网膜色素上皮细胞培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；所述酶处理为0.25％胰酶处理10分钟；所述贴壁培养基为300ug/ml matrigel包被的细胞培养皿；100％纯化视网膜色素上皮细胞为整皿的单层视网膜色素上皮样细胞，该细胞呈鹅卵石样形态，有色素积累。
10.根据权利要求1所述的一种体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于，各步骤中所述培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行。
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